王艷萍，朱賀，劉歡，馬克濤，司軍強(qiáng)，李麗

[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），新疆 石河子 832000]

?

論著

缺氧對(duì)乳鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元外向電流的影響及其環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷含量變化的研究*

王艷萍，朱賀，劉歡，馬克濤，司軍強(qiáng)，李麗

[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），新疆 石河子 832000]

摘要：目的觀察缺氧時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（SGNs）外向電流的影響及其細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量變化。方法體外原代培養(yǎng)新生1～3d SD大鼠SGNs并進(jìn)行免疫熒光鑒定。用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式觀察缺氧外液灌流SGNs時(shí)，外向電流的變化趨勢(shì)和特點(diǎn)。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧5、15和20min時(shí)SGNs內(nèi)cAMP和cGMP的濃度變化。結(jié)果①酶解分離可獲得生存狀態(tài)良好的神經(jīng)元，經(jīng)免疫熒光鑒定為SGNs。②當(dāng)電壓鉗制在-60mV時(shí)，急性缺氧增強(qiáng)SGNs外向電流，主要增強(qiáng)0～+60mV電壓區(qū)間的激活電流幅度。缺氧5min時(shí)，+60mV激活電流幅度從（971.2±50.3）pA增強(qiáng)到（2361.0±207.4）pA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，11～15 min時(shí)，增強(qiáng)的電流幅度與對(duì)照組基礎(chǔ)電流比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。③分別檢測(cè)缺氧5、15和20min后SGNs中cAMP和cGMP的含量變化。缺氧5min組與正常對(duì)照組比較，cAMP濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。缺氧15min組與正常對(duì)照組比較，cAMP濃度變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺氧20min組與正常組對(duì)照組比較，cAMP濃度水平下降（P<0.01）。cGMP濃度隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，總體呈下降趨勢(shì)，但在20min后有部分回升（缺氧15minvs缺氧20min，P<0.01）。結(jié)論在SGNs急性缺氧損傷過(guò)程中，外向電流增強(qiáng)，增強(qiáng)幅度隨缺氧時(shí)間變化先升后降，推測(cè)在短期缺氧時(shí)細(xì)胞通過(guò)降低興奮性，影響聽(tīng)覺(jué)信息的傳導(dǎo)，且該過(guò)程與胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP濃度的改變相關(guān)。

關(guān)鍵詞：缺氧；SGNs；環(huán)磷酸腺苷；環(huán)磷酸鳥苷

聽(tīng)覺(jué)障礙是指聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中的傳音、感音、聽(tīng)神經(jīng)和/或其各級(jí)聽(tīng)覺(jué)中樞發(fā)生病變，導(dǎo)致聽(tīng)功能出現(xiàn)障礙，而發(fā)生不同程度的聽(tīng)力下降[1]。圍生期窒息缺氧導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害是影響新生兒聽(tīng)力的高危因素[2]。耳蝸及聽(tīng)覺(jué)中樞對(duì)缺氧極為敏感，當(dāng)缺氧、缺血時(shí)首先累及耳蝸組織，使耳蝸產(chǎn)生類似于腦缺氧時(shí)興奮性氨基酸受體過(guò)度激動(dòng)而引起的神經(jīng)中毒。有研究表明，缺氧、缺血可造成耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞下傳入神經(jīng)樹突末梢腫脹、變性、空泡樣變[3]。另外聽(tīng)覺(jué)中樞因缺氧引起損傷可壓迫血管，從而影響耳蝸的供血，造成耳蝸功能異常[4]。在感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力障礙發(fā)生過(guò)程中，聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中各級(jí)神經(jīng)元的損害是其重要因素。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（spiral ganglion neurons，SGNs）是位于蝸軸螺旋管內(nèi)、聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的第一級(jí)神經(jīng)元，起著將聲音的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)變成化學(xué)沖動(dòng)傳送到神經(jīng)節(jié)，再由中樞軸突組成的聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)束將信號(hào)進(jìn)一步向上一級(jí)的聽(tīng)覺(jué)中樞傳遞的作用。本實(shí)驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)，急性缺氧可增強(qiáng)SGNs的外向電流，且該電流可能主要為大電導(dǎo)鈣激活鉀(large conductance Ca2+-activated K+-channel，BKCa)電流。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立體外SGNs缺氧模型[5]，進(jìn)一步研究缺氧時(shí)電流的變化特點(diǎn)及造成電流變化的胞內(nèi)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用出生1～3 d的新生Sprague Dawley乳鼠，動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)為清潔級(jí)，雌雄不拘，新疆自治區(qū)疾病控制中心動(dòng)物飼養(yǎng)科提供，許可證編號(hào)：SCXK新2003-0001。動(dòng)物使用遵守醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器

達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清、青鏈霉素、B27神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（B27 NeuroMix）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒為美國(guó)BioVison公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。Axon 700B放大器購(gòu)自美國(guó)Axon公司，P-97拉制儀購(gòu)自美國(guó)Sutter公司，生物電信號(hào)記錄計(jì)算機(jī)（Axoscope 10.2軟件）購(gòu)自美國(guó)Axon公司。

1.3SGNs的分離與培養(yǎng)

取出生0～3 d的新生Sprague Dawley乳鼠，75%酒精浸泡消毒3～5 min，麻醉后斷頭處死，沿正中線矢狀剪開(kāi)皮膚及顱骨，去除頂骨及腦組織，分離雙側(cè)顳骨，浸入預(yù)冷（4℃）的D-Hanks液（含100u/ml青霉素+100 u/ml鏈霉素）中。從耳蝸底部開(kāi)始，用顯微鑷輕輕撥開(kāi)蝸底還未骨化的組織，充分暴露聽(tīng)泡。取出膜迷路，仔細(xì)剝除螺旋韌帶及基底膜后，將含有螺旋神經(jīng)節(jié)的蝸軸螺旋管組織迅速移入1 ml含有0.125%Ⅰ型膠原酶和0.125%胰酶的已高壓的Eppendorf離心管中。在37℃溫箱內(nèi)溫育17 min，超凈臺(tái)上用移液槍移除部分消化液上清，加入300μl種植培養(yǎng)液（90%DMEM/F12，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素，已復(fù)溫）3min終止消化。將終止消化的細(xì)胞懸液輕輕吹打20次，放入離心機(jī)，1 000 r/min離心8min。棄上清液，加入1ml細(xì)胞種植培養(yǎng)液輕輕吹打50次制成細(xì)胞混懸液。取一小滴SGNs混懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行單位面積內(nèi)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。以密度為1×106/ml種植在預(yù)先用0.05%多聚賴氨酸包被過(guò)爬片的6孔板中。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)選取培養(yǎng)8 h的SGNs，此時(shí)細(xì)胞活性最好。用神經(jīng)Ⅲ類β-微管蛋白單克隆抗體（neuronal classⅢβ-tubulin，TUJ1）為特異性標(biāo)記物鑒別神經(jīng)元。

1.4急性缺氧模型制備

在室溫條件下（22～25℃）對(duì)培養(yǎng)的SGNs標(biāo)本，使用多管灌流給藥系統(tǒng)持續(xù)灌注無(wú)糖低氧的生理鹽溶液（physiological saline solution，PSS）（20%CO2和80%氮?dú)釴2混合氣體充分飽和，pH值=6.5）5～15min。

1.5全細(xì)胞膜片鉗記錄

在室溫條件下（22～25℃）使用Axon 700B放大器進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極尖端直徑約為1μm，電極阻抗約為3～5MΩ。電極內(nèi)液成分是：氯化鉀KCl 140.0 mmol/L，二水氯化鎂MgCl2·2H2O 2.0 mmol/L，氯化鈣CaCl21.2 mmol/L，乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸10.0mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L，以氫氧化鉀（KOH）將pH值調(diào)至7.3，滲透壓300mOsm/L。細(xì)胞外液成分：氯化鈉NaCl 137.0mmol/L，磷酸氫二鈉Na2HPO40.2mmol/L，氯化鉀KCl 5.4mmol/L，磷酸二氫鉀KH2PO40.4mmol/L，氯化鎂MgCl21.0 mmol/L，氯化鈣CaCl21.2 mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L。通過(guò)微操縱器使記錄電極的尖端接觸到神經(jīng)元后，給予負(fù)壓形成G歐封接。補(bǔ)償電極電容后，給予瞬時(shí)較強(qiáng)負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。待電流穩(wěn)定5 min后開(kāi)始記錄。膜電流用5或10 kHz （3dB）低頻濾過(guò)。生物電信號(hào)通過(guò)PC計(jì)算機(jī)記錄。采樣間隔為10、20或100μs。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法

用缺氧外液灌流培養(yǎng)細(xì)胞造成缺氧模型，在不同時(shí)間點(diǎn)，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞。取適量磷酸緩沖鹽溶液重懸細(xì)胞，超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，再將細(xì)胞置入-20℃冰箱冷凍，反復(fù)3次，使細(xì)胞進(jìn)一步破碎。將標(biāo)本置于2～8℃溫度下1 500 r/min離心10 min，收集上清液備用。按照cAMP和cGMP的ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　SGNs培養(yǎng)與鑒定 （×400）

2　結(jié)果

2.1SGNs培養(yǎng)與免疫熒光鑒定

大約在接種8h后耳蝸SGNs貼壁。鏡下可見(jiàn)形態(tài)不一的細(xì)胞，貼壁的SGNs細(xì)胞胞體多呈橢圓形，有的呈球形，邊緣清晰光滑，折光性好，周邊可見(jiàn)明顯光暈，胞體兩側(cè)未見(jiàn)突起生長(zhǎng)。培養(yǎng)至24h后，大部分細(xì)胞長(zhǎng)出突起，背景細(xì)胞中可見(jiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。但是其形態(tài)卻大不一樣，SGNs由之前的橢圓形延伸出突起，突起長(zhǎng)度僅有胞體的1～2倍。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的突起伸出較短一些，胞體呈梭形，突起伸出后靠近胞體部分稍寬，進(jìn)而逐漸變細(xì)。另一些為成纖維細(xì)胞，胞體稍大，多呈不規(guī)則形，多邊形或者星型，且分裂速度較快，光澤度不高。TUJ1免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)神經(jīng)元胞體和突起均呈綠色，背景下可見(jiàn)少許非特異性染色，未見(jiàn)其他背景細(xì)胞著色（見(jiàn)圖1）。

2.2SGNs外向電流隨缺氧時(shí)間的變化

鉗制電壓-60 mV，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，激活的SGNs外向電流先增強(qiáng)后逐漸減弱。其中缺氧致5min時(shí)，外向電流幅度增強(qiáng)最大，+60 mV電流幅度與對(duì)照組基礎(chǔ)電流比較由（971.2±50.3）pA增加到（2361.0±207.4）pA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，t= 4.430，P=0.007）。5min以后增強(qiáng)幅度呈下降趨勢(shì)，缺氧11～15 min，缺氧對(duì)外向電流的增強(qiáng)作用基本消失。+60mV電流幅度為（1024.6±232.2）pA，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，t=1.030，P= 0.350）。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，SGNs外向電流逐漸增大，5min時(shí)外向電流最大。（見(jiàn)圖2）。

2.3酶聯(lián)免疫吸附法

使用自制灌流系統(tǒng)，將預(yù)充20%CO2和80%N2混合氣體充分飽和的PSS持續(xù)灌流培養(yǎng)的SGNs。缺氧5、15和20 min時(shí)，SGNs中cAMP的濃度分別為（278.39±0.69）、（220.37±1.05）和（174.40± 0.26）pg/ml（見(jiàn)表1）。缺氧5min時(shí)，SGNs內(nèi)cAMP濃度明顯升高，20min后明顯下降（見(jiàn)圖3）。缺氧5、15 和20 min時(shí)cGMP的濃度分別為（2.49±0.05）、（2.30±0.09）和（3.83±0.15）pmol/ml（見(jiàn)表2）；缺氧后SGNs內(nèi)cGMP濃度總體呈下降趨勢(shì)，20 min時(shí)，其濃度有部分回升（見(jiàn)圖4）。缺氧5min時(shí)，cAMP濃度出現(xiàn)增加（缺氧5 min vs對(duì)照組，t=57.533，P= 0.000），15 min時(shí)cAMP濃度與對(duì)照組水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.441，P=0.865），20min后繼續(xù)下降（缺氧20minvs對(duì)照組，t=44.584，P=0.000）。5和15 min時(shí)，cGMP濃度下降（缺氧5和15 minvs對(duì)照組，t=21.698和23.302，P=0.000），20 min時(shí)又出現(xiàn)升高現(xiàn)象（缺氧15minvs缺氧20min，t=17.816，P=0.000）。

圖2　SGNs外向電流隨缺氧時(shí)間的變化

表1　不同缺氧時(shí)間下SGNs內(nèi)cAMP濃度的變化（n=6，pg/ml±s）

表1　不同缺氧時(shí)間下SGNs內(nèi)cAMP濃度的變化（n=6，pg/ml±s）

注：方差分析F=1249.126，P=0.000；t、P值：與對(duì)照組比較

組別P值對(duì)照組　219.92±0.59缺氧5min　278.39±0.69　57.533　0.000缺氧15min　220.37±1.05　0.441　0.865缺氧20min　174.40±0.26　44.584　0.000 cAMP濃度t值

圖3　不同缺氧時(shí)間對(duì)SGNs內(nèi)cAMP濃度的影響

表2　不同缺氧時(shí)間下SGNs內(nèi)cGMP濃度的變化（n=6，pmol/ml±s）

表2　不同缺氧時(shí)間下SGNs內(nèi)cGMP濃度的變化（n=6，pmol/ml±s）

注：方差分析F=210.937，P=0.000；1）與對(duì)照組比較；2）與缺氧15min比較

組別P值對(duì)照組　5.76±0.18缺氧5min　2.49±0.03　21.6981）　0.0001）缺氧15min　2.29±0.06　23.3021）　0.0001）缺氧20min　3.83±0.09　20.6151），17.8162）　0.0001），0.0002）cGMP濃度t值

圖4　不同缺氧時(shí)間對(duì)SGNs內(nèi)cGMP濃度的影響

3　討論

在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中，很多聽(tīng)力喪失都與缺血、缺氧有關(guān)。新生兒缺氧，包括新生兒窒息、呼吸暫停、難產(chǎn)、持續(xù)機(jī)械通氣史等，子宮內(nèi)缺氧和分娩時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)影響新生兒的聽(tīng)覺(jué)器官，引起耳蝸，腦干或者皮質(zhì)可逆或不可逆的變化[6]。研究表明，缺氧是導(dǎo)致聽(tīng)力障礙的一個(gè)相當(dāng)明確的危險(xiǎn)因素[7]。本研究利用免疫熒光技術(shù)、電生理膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法等研究缺氧對(duì)耳蝸SGNs電流的影響。研究結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)的SGNs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)確定為SGNs，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。膜片鉗實(shí)驗(yàn)證實(shí)急性缺氧增加SGNs的外向電流，且該外向電流的增強(qiáng)作用隨缺氧時(shí)間變化而改變。胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP水平在急性缺氧過(guò)程中發(fā)生變化，cAMP的濃度隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。cGMP濃度隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，總體呈下降趨勢(shì)，但在20 min后有部分回升，可能與鉀離子通道的開(kāi)放有關(guān)，從離子通道方面進(jìn)一步闡釋缺氧對(duì)聽(tīng)力的影響。

由于耳蝸特殊的生理結(jié)構(gòu)和位置，SGNs位于耳蝸骨螺旋板與蝸軸相接處的Rosenthal隧道中，位置較深，分離難度較大。因此，筆者選用出生后1～3d的乳鼠進(jìn)行培養(yǎng)。此時(shí)的乳鼠顳骨尚未骨化，在鏡下用顯微鑷即可從分離出的基底膜上剝離SGNs。如果大鼠>5 d，其顳骨開(kāi)始部分骨化，在分離SGNs時(shí)可能會(huì)將蝸軸螺旋管遺留在蝸軸螺旋管內(nèi)，影響取材的數(shù)量[8]。所以原代培養(yǎng)耳蝸SGNs是有一定難度的。培養(yǎng)的SGNs一般4～6h即可貼壁，8 h貼壁較牢固。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的鑒定。鑒定結(jié)果表明，熒光顯色可見(jiàn)胞體呈圓形或者橢圓形，核著藍(lán)色且較大。本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)出原代SGNs，且培養(yǎng)的神經(jīng)元能滿足后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基本需要。

本研究中的電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性缺氧時(shí)，外向電流發(fā)生一個(gè)時(shí)間相關(guān)性變化，缺氧5 min時(shí)，外向電流增強(qiáng)幅度最大，10～15 min時(shí)逐漸回降至基礎(chǔ)水平。本實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果初步分析該增強(qiáng)的電流成分可能主要是BKCa電流[9]。有研究證實(shí)，BKCa通道參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激過(guò)程[10]。缺氧對(duì)不同種屬、不同部位、不同種類細(xì)胞的BKCa電流影響不盡相同。在豚鼠耳蝸螺旋動(dòng)脈[11]、大鼠大腦皮層神經(jīng)元[12]中缺氧增強(qiáng)BKCa電流，但是在小鼠前庭核神經(jīng)元[13]、大鼠頸動(dòng)脈體細(xì)胞[14]及足細(xì)胞[15]中抑制BKCa電流。LIU等[16]應(yīng)用內(nèi)面向外式膜片鉗技術(shù)，證實(shí)缺氧引起B(yǎng)KCa電流變化是通過(guò)胞內(nèi)機(jī)制完成的。BKCa通道除可以被胞內(nèi)Ca2+和去極化電壓激活以外，還可以通過(guò)胞內(nèi)磷酸化調(diào)節(jié)。有研究顯示，圍產(chǎn)期缺氧可增強(qiáng)成年小鼠肺動(dòng)脈中cAMP介導(dǎo)的BKCa通道電流[17]。另外，腺苷可以增大海馬神經(jīng)元BKCa電流幅值[18]。缺氧早期Ca2+內(nèi)流，隨著缺氧的時(shí)間增加，更多的Ca2+流向細(xì)胞內(nèi)，加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣的釋放，造成鈣離子超載[19]，一些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生，通過(guò)與神經(jīng)元胞外G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活胞內(nèi)第二信使通路，進(jìn)而激活下游的蛋白激酶，使BKCa通道發(fā)生磷酸化，通道開(kāi)放。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BKCa通道受細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、三磷酸鳥苷調(diào)控[20-21]。本實(shí)驗(yàn)為從胞內(nèi)機(jī)制進(jìn)一步觀察和解釋SGNs外向電流變化的原因，分別檢測(cè)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的含量。cAMP由ATP經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶（Adenylatecvclase，Ac）轉(zhuǎn)化而來(lái)，又在磷酸二酯酶（Phosphodiesterases，PDE）的催化下不斷水解成AMP。其含量的穩(wěn)定主要依靠Ac與PDE之間的平衡。本實(shí)驗(yàn)中cAMP濃度變化的可能機(jī)制為：糖氧剝奪時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，Ac等迅速合成cAMP致其增高，隨后ATP耗竭，酶系統(tǒng)受抑等因素使Ac下降[22]。另一方面，由于缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，使ATP合成原料不足，影響cAMP的濃度。隨著cAMP濃度的下降，對(duì)BKCa通道的磷酸化程度降低，出現(xiàn)該電流先升后降的現(xiàn)象。有研究顯示，缺氧時(shí)間可影響神經(jīng)元鉀通道的開(kāi)放頻率，進(jìn)而使神經(jīng)元的興奮性產(chǎn)生變化[11]。通道開(kāi)放頻率的改變與第二信使密切相關(guān)。cAMP與其他兩種第二信使cGMP、Ca2+密切相關(guān)，其相互間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系有助于擴(kuò)大細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活路徑[23-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，cGMP 與cAMP的濃度變化不盡相同，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，先出現(xiàn)一個(gè)明顯的下降，隨后在缺氧20 min時(shí)回升，雖然cGMP也與BKCa通道的開(kāi)放相關(guān)，但是其濃度變化與cAMP的濃度變化相反。有資料表明，cAMP和cGMP在細(xì)胞內(nèi)的濃度?；ハ嘞L(zhǎng)[25]，其引起的生物學(xué)效應(yīng)也常常相反[26]。該過(guò)程是胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)通路的聯(lián)系變化，需要筆者進(jìn)一步研究。但是可以推測(cè)，缺氧可以通過(guò)胞內(nèi)第二信使影響通道的開(kāi)放，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的興奮性。加快細(xì)胞受損凋亡的過(guò)程，進(jìn)一步使SGNs損傷，造成永久性聽(tīng)力喪失。

參考文獻(xiàn)：

[1]姜鑫,胡永國(guó),朱瑩.新生兒聽(tīng)力障礙危險(xiǎn)因素的研究進(jìn)展 [J].保健醫(yī)學(xué)研究踐,2014,11(6):73-74.

[2]COLELLA-SANTOS M F,HEIN T A,de SOUZA G L,et al. Newborn hearing screening and early diagnostic in the NICU[J]. BioMed Research International,2014,9:1-11.

[3]王麗萍,王蘋,杜波,等.缺氧對(duì)體外培養(yǎng)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維的影響[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2008,22(22): 1040-1042.

[4]OLIVETTO E,SIMONI E,GUARAN V,et al.Sensorineural hearing loss and ischemic injury:development of animal models to assess vascular and oxidative effects[J].Hear Res,2015,327: 58-68.

[5]李新芝,司軍強(qiáng),張忠雙,等.急性缺氧增強(qiáng)豚鼠小腦前下動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流并抑制縫隙連接 [J].生理學(xué)報(bào),2011,63(6): 533-539.

[6]WIDZISZOWSKA A,NAMYSLOWSKI G.Assessment of hearing organ activity in a group of neonates with central nervous system impairment[J]Int JPediatr Otorh-inol Aryngol,2011,75(10): 1280-1284.

[7]ABU-SHAHEEN A,AL-MASRI M,EL-BAKRI N,et al.Prevalence and risk factors of hearing loss among infants in Jordan: initial results from universal neonatal screening[J].Int J Audiol, 2014,53(12):915-920.

[8]高可雷,李鵬,蔣海燕,等.大鼠內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)及其取材技術(shù)[J].中華耳科學(xué)雜志,2015,13(1):18-23.

[9]王艷萍,朱賀,馬克濤,等.急性缺氧對(duì)SD乳鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鉀通道的影響[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,50(10): 823-828.

[10]NECKáR J,BORCHERT G H,HLOUSKOVá P,et al.Brief daily episode of normoxia inhibits cardioprotection conferred by chronic continuous hypoxia.Role of oxidative stress and BKCa channels[J].Curr Pharm Des,2013,19(39):6880-6889.

[11]李新芝,司軍強(qiáng),張忠雙,等.急性缺氧增強(qiáng)豚鼠小腦前下動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流并抑制縫隙連接[J].生理學(xué)報(bào),2011,63(6): 533-539.

[12]李小剛,董為偉,范生堯,等.缺氧對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)元鈣激活性鉀通道的影響[J].卒中與神經(jīng)疾病,2002,9(4):195-197.

[13]XIE H,ZHANG Y Q,PAN X L,et al.Decreased calcium-activated potassium channels by hypoxia causes abnormal firing in the spontaneous firing medial vestibular nuclei neurons[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2014,8:31.

[14]ROSS F A,RAFFERTY J N,DALLAS ML,et al.Selective expression in carotid body type I cells of a single splice variant of the large conductance calcium-and voltage-activated potassium channel confers regulation by AMP-activated protein kinase[J].J Biol Chem,2011,286(14):11929-11936.

[15]ZHANG R,SUN H,LIAO C,et al.Chronic hypoxia in cultured human podocytes inhibits BKCa channels by upregulating its β4-subunit[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,420(3): 505-510.

[16]LIU H J,EDWARD M,GABRIEL G,et al.Haddad.O2 deprivation inhibits Ca2+-activated K+channels via cytosolic factors in mice neocortical neurons[J].the Journal of Clinical Investigation, 1999,104(5),DOI:10.1172/JCI7291.

[17]MARINO M,BéNY J L,PEYTER A C,et al.Perinatal hypoxia enhancescyclicadenosinemonophosphate-mediatedBKCa channel activation in adult murine pulmonary artery[J].J Cardiovasc Pharmacol,2011,57(2):154-165.

[18]李巷,康慧聰,劉曉艷,等.腺苷對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2012, 41(3):264.

[19]KANG D,WANG J,HOGAN JO.et al.Increase in cytosolic Ca2+produced by hypoxia and other depolarizing stimuli activates a non-selective cation channel in chemoreceptor cells of rat carotid body[J].J Physiol,2014,592(9):1975-1992.

[20]WU B N,CHEN C F,HONG Y R,et al.Activation of BKCa channels via cyclic AMP-and cyclic GMP-dependent protein kinases y eugenosedin-A in rat basilar artery myocytes[J].Br J Pharmacol,2007,152(3):374-385.

[21]LORCA R A,PRABAGARAN M,ENGLAND S K,et al.Functional insights into modulation of BKCa channel activity to alter myometrial contractility[J].Frontiers in Physiology,2014,DOI: 10.3389/fphys.2014.00289

[22]GAURI H N,HOWARD M P,SARAH L M.Neuroprotective signaling pathways are modulated by adenosine in the anoxia tolerant turtle[J].J Cereb Blood Flow Metab,2011,31(2):467-475.

[23]CHINTAMANI N J,DANIELLE N M,PATTI S,et al.Control of vascular smooth muscle cell growth by connexin 43[J].Front Physiol,2012,3:220.

[24]ZACCOLO M,MOVSESIAN M A.cAMP and cGMP signaling cross-talk:role of phosphodiesterases and implications for cardiac pathophysiology[J].Circ Res,2007,100(11):1569-1578.

[25]NISHIYAMAM,HOSHINOA,TSAIL,etal.Cyclic AMP/GMP-dependent modulation of Ca2+channels Sets the polarity of nerve growth-coneturning[J].Nature,2003,423(6943): 990-995.

[26]KOBAYASHI T,NAGASE F,HOTTA K,et al.Crosstalk between second messengers Predicts the motility of the growth cone[J].Sci Rep,2013,3:3118.

（童穎丹編輯）

中圖分類號(hào)：R 764.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.003

文章編號(hào)：1005-8982（2016）13-0012-06

收稿日期：2015-11-18

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81260159、31460264、81460098、81560175）；石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃優(yōu)秀青年項(xiàng)目（No：2013ZRKXYQ-YD20）

[通信作者]李麗，E-mail：lily7588@163.com

Effect of hypoxia on outward current and change in content of cAMP and cGMP in cochlear spiral ganglion neurons*

Yan-ping Wang，He Zhu，Huan Liu，Ke-tao Ma，Jun-qiang Si，Li Li
［Department of Physiology，Medical College of Shihezi University（the Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases），Shihezi，Xinjiang 832000，China］

Abstract:Objective To observe the effect of hypoxia time on outward current in spiral ganglion neurons （SGNs）culturedin vitroand changes in the intracellular second messenger systems.Methods SGNs of 1-3 d neonatal Sprague Dawley rats were cultivatedin vitroand identified by immunofluorescence.Whole-cell patch clamp technique was used to record the variation trends and characteristics of outward current in SGNs perfused with hypoxic external solution.The changes in concentrations of cAMP and cGMP in SGNs were detected by enzyme-linked immunosorbent assay at 5，15 and 20 min of hypoxia.Results Good neurons could be isolated by enzyme which were identified by immunofluorescence to be SGNs.Acute hypoxia mainly enhanced outward current at 0-（+60）mV with the holding potential of-60 mV.At 5 min of hypoxia，the ampli－tude of outward current was increased from（971.2±50.3）pA to（2361.0±207.4）pA at+60 mV（P＜0.01）；then tended to decline.From 11 to 15 min of hypoxia，the increasing amplitude of outward current had no significant difference from the base current in the control group（P＞0.05）.Compared with the control group，the concentration of cAMP in SGNs significantly increased in the 5-min hypoxia group（P＜0.01），but was not statistically different in the 15-min hypoxia group（P＞0.05）；however，the concentration of cAMP decreased in the 20-min hypoxia group（P＜0.01）.The concentration of cGMP was totally in a downward trend with prolonged hypoxia time，but partially went up after 20 min（15-min hypoxia group vs 20-min hypoxia group，P＜0.01）.Conclusions In the process of acute hypoxia injury in SGNs，outward current increases and the enhancing amplitude increases at first and then decreases along with hypoxia time.So we deduced the conduction of auditory information is influenced by reduced excitability in short-term hypoxia of SGNs，which is related to the change in the concentrations of intracellular second messengers cAMP and cGMP.

Keywords:acute hypoxia；SGN；cyclic adenosine monophosphate；cyclic guanosine monophosphate