朱相展，張彥婷，楊　露，張楠楠，李慶華，馬珊珊，張，關(guān)方霞1,#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細胞實驗室 鄭州 450052

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β-胡蘿卜素對食管鱗癌EC1細胞增殖、凋亡、遷移及細胞周期的影響*

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細胞實驗室 鄭州 450052

摘要目的：觀察β-胡蘿卜素對食管鱗癌EC1細胞增殖、凋亡、遷移及細胞周期的影響。方法：用不同濃度(1、5、10、20、30、50 μmol/L)β-胡蘿卜素分別處理EC1細胞12、24、36、48、60、72 h后，CCK-8法檢測β-胡蘿卜素對EC1細胞增殖率的影響，篩選β-胡蘿卜素的最佳處理時間及濃度；隨后，在此條件下將EC1細胞分為3組(陰性對照組、空白對照組和實驗組)，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，流式細胞儀檢測細胞周期的變化，Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力的變化，Western blot檢測小窩蛋白1(Cav-1)、p-Akt、p-NF-κB、Bcl-2、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達水平的變化。結(jié)果：經(jīng)篩選，選用50 μmol/L β-胡蘿卜素作用EC1細胞48 h進行后續(xù)實驗。與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組EC1細胞凋亡率顯著提高(P<0.001)，G0/G1期細胞比例增加(P<0.001)，而S期細胞比例降低(P<0.001)，發(fā)生遷移的細胞數(shù)量減少(P<0.001)，且細胞黏附因子E-cadherin的表達顯著增加(P<0.001)，Cav-1及AKT信號通路關(guān)鍵蛋白p-Akt、p-NF-κB、Bcl-2表達量明顯下調(diào)，而Caspase-3的表達被激活(P<0.001)。結(jié)論：β-胡蘿卜素能夠有效促進EC1細胞的凋亡，推測可能是通過抑制Cav-1介導(dǎo)的AKT/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。

食管癌是一種上消化道高發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均位于惡性腫瘤的前列。β-胡蘿卜素是一種多烯烴類化合物，具有清除氧自由基的能力，是維護人體健康不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，在抗癌、預(yù)防心血管疾病、白內(nèi)障及抗氧化方面具有顯著的作用。王尤麗等[1]發(fā)現(xiàn)，膳食維生素A及β-胡蘿卜素含量低可增加食管癌發(fā)生率。研究[2-4]表明β-胡蘿卜素可以抑制胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腦垂體瘤等多種腫瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，β-胡蘿卜素能夠抑制食管鱗癌EC9706細胞增殖，但其相關(guān)分子機制尚不明確[5]。實驗研究[6]表明，β-胡蘿卜素可以通過多種機制抑制腫瘤細胞的增殖。Palozza等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1(Cav-1)能夠調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞和前列腺癌細胞對β-胡蘿卜素的敏感性。Cav-1是細胞質(zhì)膜微囊主要結(jié)構(gòu)蛋白，作為小窩的主要部分能夠參與許多重要的細胞過程，如膽固醇體內(nèi)平衡、膜泡運輸、細胞遷移、細胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。Cav-1在腫瘤發(fā)生中的作用仍然存在爭議，雖然多數(shù)研究認為Cav-1的編碼基因是一種腫瘤抑制基因[8]，但部分研究發(fā)現(xiàn)Cav-1在一些腫瘤細胞中呈高表達[9-11]。Ando等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在15株食管鱗癌TE1-15細胞中，Cav-1呈現(xiàn)高表達，而在正常食管上皮細胞Het-1A中不表達；因此，Cav-1可能促進食管鱗癌的發(fā)生。由此，作者推測β-胡蘿卜素可能通過抑制Cav-1的表達，影響食管鱗癌EC1細胞內(nèi)的信號調(diào)控，進而抑制細胞增殖并促進凋亡。研究[9-10,13]發(fā)現(xiàn)，Cav-1參與調(diào)節(jié)AKT信號通路活性，進而抑制膀胱癌等多種腫瘤細胞的增殖與促凋亡過程。因此，該研究通過觀察β-胡蘿卜素對食管鱗癌EC1細胞增殖、凋亡、遷移及細胞周期的影響，并分析Cav-1介導(dǎo)的AKT/NF-κB信號通路在這一過程中發(fā)揮的作用，探討β-胡蘿卜素誘導(dǎo)食管鱗癌EC1細胞凋亡的分子機制。

1材料與方法

1.1材料食管鱗癌EC1細胞株由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細胞生物學(xué)實驗室保存，β-胡蘿卜素、四氫呋喃(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶(美國HyClone公司)，標準胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，結(jié)晶紫染色液(北京碧云天公司)，Cav-1、p-Akt、p-NF-κB單克隆抗體(美國CST公司)，GAPDH、Bcl-2多克隆抗體和細胞全蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，E-cadherin、Caspase-3多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(美國BD公司)。β-胡蘿卜素溶解于四氫呋喃配制成10 mmol/L母液。

1.2細胞培養(yǎng)使用含體積分數(shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)EC1細胞，2 d傳代1次。實驗時將EC1細胞接種于培養(yǎng)板中，待細胞生長至對數(shù)生長期后用于后續(xù)實驗。

1.3細胞增殖的CCK-8檢測收集對數(shù)生長期的EC1細胞，調(diào)整細胞密度至5×104mL-1，接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液。細胞貼壁24 h后，分別加入1、5、10、20、30、50 μmol/L的β-胡蘿卜素作為實驗組，同時加入相同劑量四氫呋喃作為陰性對照，以不含細胞的完全培養(yǎng)基作為空白對照，每組設(shè)置3個平行復(fù)孔；分別處理12、24、36、48、60、72 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8溶液反應(yīng)2 h，隨后用酶標儀450 nm波長處讀取各孔的吸光度值(OD)，并計算細胞增殖抑制率。抑制率=[(OD陰性對照孔-OD實驗孔)/(OD陰性對照孔-OD空白對照孔)]×100%。

1.4細胞凋亡的檢測取對數(shù)生長期的EC1細胞，實驗組加入50 μmol/L的β-胡蘿卜素，陰性對照組加入相同劑量的四氫呋喃，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，離心收集并調(diào)整細胞密度為1×106mL-1，用PBS洗2次，分別加入100 μL 1×binding buffer、5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻后，置于室溫避光反應(yīng)15 min，隨后加入500 μL 1×binding buffer，在1 h內(nèi)避光上機檢測細胞凋亡率。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5各組細胞細胞周期的流式細胞術(shù)檢測離心收集不同處理組的EC1細胞(處理方法同1.4部分)，調(diào)整細胞密度為1×106mL-1，PBS清洗1～2遍，加入450 μL PBS將細胞重懸，隨后加入到1 mL預(yù)冷的體積分數(shù)70%乙醇中，置于4 ℃過夜固定；離心棄去乙醇，PBS清洗1～3次；加入500 μL 50 mg/L RNase A/PI孵育液，室溫避光放置15 min后利用流式細胞儀檢測細胞周期。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.6各組細胞遷移能力的檢測離心收集不同處理組的EC1細胞(處理方法同1.4部分)，調(diào)整細胞密度為1×106mL-1；24孔培養(yǎng)板中加入600 μL含體積分數(shù)5% FBS以及體積分數(shù)0.5% BSA的培養(yǎng)基，小室中加入300 μL上述制備的細胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；取出裝有Transwell小室的24孔培養(yǎng)板，棄去小室中剩余培養(yǎng)基，甲醇室溫固定30 min；PBS清洗小室中殘留甲醇溶液，加入10 g/L的結(jié)晶紫，室溫染色30 min；PBS清洗3遍，將多余的染料洗掉，用脫脂棉球輕輕擦拭小室上層未遷移的細胞，在倒置顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進行分析，應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析選擇β-胡蘿卜素的最佳作用濃度及時間，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞的細胞周期、遷移、黏附能力的差異以及各組細胞中AKT/NF-κB信號通路關(guān)鍵因子Cav-1、p-AKT、p-NF-κB、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響。檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1β-胡蘿卜素最佳作用濃度及時間的篩選結(jié)果見表1。由表1可知， 50 μmol/L β-胡蘿卜素作用EC1細胞48 h時細胞增殖的抑制率接近50%，因此可作為最佳作用濃度及作用時間，用于后續(xù)實驗。

表1　β-胡蘿卜素對EC1細胞增殖的抑制率(n=3)　%

F時間=407.382，F(xiàn)濃度=1 021.861，F(xiàn)交互=89.012，P均<0.001。

2.2β-胡蘿卜素對EC1細胞凋亡的影響50 μmol/L β-胡蘿卜素作用細胞48 h后，與陰性對照組(0.49%±0.23%)和空白對照組(0.41%±0.21%)相比，實驗組細胞凋亡細胞比例(7.50%±0.43%)顯著增加(F=496.224，P<0.001)。

2.3β-胡蘿卜素對EC1細胞周期的影響見表2。結(jié)果表明，實驗組細胞被阻滯在G0/G1期。

2.4β-胡蘿卜素對EC1細胞遷移和黏附能力的影響結(jié)果見表3、圖1。由結(jié)果可知，β-胡蘿卜素能夠抑制EC1細胞遷移，提高細胞中黏附因子E-cadherin的表達。

表2　β-胡蘿卜素對EC1細胞周期的影響(n=3)　%

表3　β-胡蘿卜素對EC1細胞遷移和黏附能力的影響(n=3)　%

圖1　β-胡蘿卜素對EC1細胞E-cadherin蛋白表達的影響

2.5β-胡蘿卜素對AKT/NF-κB信號通路關(guān)鍵因子表達的影響見圖2、表4。結(jié)果表明，經(jīng)過50 μmol/L β-胡蘿卜素處理后，EC1細胞中Cav-1表達下調(diào)，p-AKT、p-NF-κB蛋白表達量顯著降低。此外，Bcl-2蛋白表達量降低，Caspase-3蛋白活性增強。

圖2　50 μmol/L β-胡蘿卜素作用48 h后EC1細胞內(nèi)Cav-1、p-AKT、p-NF-κB 、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的變化

組別nCav-1p-AKTp-NF-κBBcl-2Caspase-3空白對照組31.01±0.021.50±0.121.32±0.111.01±0.121.01±0.02陰性對照組31.11±0.101.44±0.081.41±0.050.91±0.070.91±0.08實驗組30.75±0.07*0.51±0.12*0.41±0.02*0.70±0.08*1.31±0.08*F56.19268.03261.28724.786738.986P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

3討論

β-胡蘿卜素是一種共軛雙烯烴化合物，廣泛存在于綠色植物、真菌和藻類中。作為抗氧化劑，β-胡蘿卜素具有增強免疫力，補充維生素A原以及抗輻射等作用。研究[14]表明，β-胡蘿卜素不僅能夠抑制腦垂體瘤細胞株AtT20的增殖，而且促進其細胞凋亡。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素能夠有效抑制食管鱗癌EC9706細胞增殖。作者的研究結(jié)果表明β-胡蘿卜素對食管鱗癌EC1細胞增殖同樣具有明顯的抑制效果，且能夠促進細胞凋亡的發(fā)生，將細胞阻滯在G0/G1期。

近年來，上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用及其相關(guān)機制的研究逐漸成為熱點。腫瘤細胞發(fā)生上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化時除了細胞形態(tài)、細胞極性、抗凋亡能力等形態(tài)學(xué)及生物學(xué)行為改變外，同時通常伴有細胞表面蛋白表達異常，如上皮性-鈣黏蛋白[15]。近期研究[16]顯示,通過調(diào)節(jié)NF-κB、AKT、JNK等蛋白的磷酸化水平能夠增加E-cadherin的表達，進而降低腫瘤細胞的遷移能力。另外，研究[3]發(fā)現(xiàn),β-胡蘿卜素能夠抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲和遷移。該實驗證實β-胡蘿卜素作用于食管鱗癌EC1細胞后，細胞遷移數(shù)量顯著減少，并且黏附因子E-cadherin表達量明顯升高，說明β-胡蘿卜素能夠抑制食管鱗癌EC1細胞的遷移能力，且提高細胞黏附能力。

大量實驗研究[2，6，17]表明，β-胡蘿卜素可以通過多種機制抑制腫瘤細胞的增殖，包括激活Caspases、釋放細胞色素C、上調(diào)PPAR-γ、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS水平等。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，Cav-1在β-胡蘿卜素促進結(jié)腸癌細胞和前列腺癌細胞凋亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Cav-1是一種膜整合蛋白，相對分子質(zhì)量為21 000～24 000，能夠與多種信號分子結(jié)合形成復(fù)合體，進而調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與多種生命活動，如分化、增殖、腫瘤發(fā)生等[11]。一項臨床病例分析[18]表明Cav-1在食管鱗癌細胞株TE1-15中高表達，而正常食管上皮細胞Het-1A中不表達。因此，作者推測Cav-1可能參與β-胡蘿卜素誘導(dǎo)食管鱗癌EC1細胞凋亡的過程。此外，還有研究[13,19]表明Cav-1在PI3K/AKT信號通路中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此，作者檢測了β-胡蘿卜素作用食管鱗癌EC1細胞后細胞中Cav-1及AKT信號通路關(guān)鍵因子表達變化情況，結(jié)果表明，β-胡蘿卜素能夠顯著降低Cav-1的表達，并且抑制AKT活性。作為AKT下游靶蛋白，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在多種腫瘤細胞中呈高表達，并且受AKT磷酸化調(diào)節(jié)。此外，研究[2，6]發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素可以通過不同的作用機制激活Caspase活性并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，從而促進細胞凋亡。而該實驗研究結(jié)果證實β-胡蘿卜素能夠通過抑制AKT磷酸化水平，進而降低NF-κB的活性，下調(diào)Bcl-2的表達，并激活Caspase-3，從而發(fā)揮其促進食管鱗癌EC1細胞凋亡的作用。

綜上所述，β-胡蘿卜素能夠有效抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，將細胞阻滯在G0/G1期，同時降低細胞的遷移能力，且Cav-1介導(dǎo)的AKT/NF-κB信號通路參與了β-胡蘿卜素對食管鱗癌EC1細胞的促凋亡作用。

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(2015-05-04收稿責(zé)任編輯趙秋民)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.001

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com

中圖分類號R735.1

關(guān)鍵詞β-胡蘿卜素；食管鱗癌；Cav-1/AKT/NF-κB；凋亡

Effects of β-carotene on proliferation, apoptosis, migration and cell cycle of EC1 cells

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsβ-carotene;esophageal squamous cell carcinoma;Cav-1/AKT/NF-κB;apoptosis

AbstractAim: To investigate the effects of β-carotene on the proliferation, apoptosis, migration and cell cycle of human esophageal cancer EC1 cells and to study its related molecular mechanism.Methods: After treatment with different concentrations (1, 5, 10, 20, 30 and 50 μmol/L) of β-carotene for 12, 24, 36, 48, 60 and 72 h, the proliferation rate was tested by CCK-8 assay to determine the optimal time and concentration,EC1 cells were allocated into 3 groups: negative control group, blank control group and treatment group. Then the cell cycle and apoptosis were detected by FCM and Annexin V-FITC/PI staining respectively; the cell migration was measured by Transwell assay; effects of the β-carotene on protein expressions of Cav-1, p-Akt, p-NF-κB, Bcl-2, Caspase-3 and E-cadherin were detected by Western blot. Results: After screening, the optimal dose of β-carotene and treatment time for EC1 cells were determined as 50 μmol/L and 48 h. After treatment with β-carotene,compared with negative control group and blank control group,EC1 cells in treatment group had a higher apoptosis rate(P<0.001),the cell cycle changed significantly with an increase in G0/G1 phase cells (P<0.001) and a decrease in S phase cells (P<0.001),and the number of migrating cells was significantly less(P<0.001). Meanwhile, the expression of E-cadherin in the treatment group was increased significantly(P<0.001),p-Akt, p-NF-κB and Bcl-2 decreased,and Caspase-3 was activated(P<0.001).Conclusion: β-carotene can effectively induce apoptosis of EC1 cells, which may be mediated by Cav-1 via AKT/NF-κB signaling pathway.

*國家自然科學(xué)基金資助項目81071008，81471306,U1404313；河南省科技創(chuàng)新人才計劃154200510008；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃15IRTSTHN022；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項目142107000008

*：與陰性對照組相比，P<0.05。

*：與陰性對照組相比，P<0.05。

*：與陰性對照組相比，P<0.05。