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(天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津　300203)

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Aβ蛋白淀粉樣變成分在正常人血小板膜的表達

李曉亮蘭杰葛鵬蘇桂新趙琢1盧金海1鄭芳孫續(xù)國

(天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津300203)

目的探討正常人血小板中是否存在Aβ蛋白淀粉樣變成分。方法篩選正常人群340例，采用Sysmex-200型血細胞分析儀測定血液血小板數(shù)量(PLT)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、血小板比容(PCT)和大型血小板比例(P-LCRs)，進一步提純血小板，將血小板分成兩部分，一部分用于提取血小板膜蛋白，另一部分用硫磺素T(ThT)熒光探針檢測血小板膜上淀粉樣變?？笰β抗體檢測淀粉樣變前多肽的免疫反應。Western印跡觀察Aβ蛋白分子聚合。結(jié)果ThT熒光探針檢測血小板幾乎全部顯示陽性反應。進一步抗Aβ免疫組織化學實驗發(fā)現(xiàn)綠色熒光與Aβ抗體反應陽性部位重疊。SDS-PAGE分析血小板提取的蛋白成分含有大分子Aβ聚合物。結(jié)論正常人血小板中存在Aβ淀粉樣變成分，可能參與AD患者淀粉樣變的發(fā)生。

淀粉樣變；血小板；探針；熒光

阿爾茨海默病(AD)患者腦組織和血管中有大量淀粉樣變沉積，且證實淀粉樣變成分為Aβ多肽〔1〕，最近報道血液中Aβ多肽主要來源于血小板，血小板可能參與AD淀粉樣變的形成〔2〕。淀粉樣前體蛋白(APP)形成淀粉樣變，血液中存在Aβ成分，多數(shù)學者主張，利用硫磺素T(ThT)探針能夠檢測淀粉樣變聚合物和淀粉樣變纖維成分，本組已經(jīng)多次發(fā)表論文顯示，T熒光探針能夠清晰與淀粉樣變結(jié)合〔3,4〕，結(jié)果提示與淀粉樣變結(jié)合特異，用于確定淀粉樣變成分。利用淀粉樣變熒光探針研究分析血小板淀粉樣變成分，進一步結(jié)合抗Aβ免疫組織化學確定淀粉樣變類型，為解析AD淀粉樣變形成的分子機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料收集志愿者340例，均經(jīng)過天津醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗檢查和臨床檢查，無肝腎心腦代謝病等疾病，按年齡分為0～20歲和60～80歲兩組，采集EDTA抗凝血4 ml用于血小板分析，血液2 ml分離血漿用于生物化學標志物檢測。

1.2血小板分離試劑、血小板膜蛋白成分的分離利用Sysmex-100型血細胞分析儀(希森美康，日本)及配套試劑按照說明進行操作，測定末梢血液血小板計數(shù)(PLT)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、血小板比容(PCT)和大型血小板比例(P-LCRs)指標。分離血小板，抗凝血離心(15 min)，取上層富含血小板血漿(PRP),然后離心(15 min),去掉上清血漿，底部沉淀即為血小板，收集血小板，制備血小板涂片，配制0.1 mol/L硫磺素T(ThT)溶液，溶液與血液的比例為3∶1，室溫作用5 min，利用熒光顯微鏡判定淀粉樣變熒光〔5〕。

1.3Western印跡法測定血小板膜中Aβ成分分別用兩組不同年齡段(0～20歲、60～80歲)研究對象血漿、血小板膜蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western印跡分析4%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍溶液對蛋白進行染色。免疫印跡實驗，鼠抗A單克隆抗體孵育60 min，10 mmol/L PBS(pH7.4)緩沖液洗滌，酶標記二抗體孵育60 min，多色熒光化學發(fā)光系統(tǒng)(CE)成像。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件、組間比較進行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1血小板數(shù)量及血小板指數(shù)分析老年人PLT明顯減少(P<0.05)，而其余四項指標在成熟末梢血小板中未見有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

2.2利用ThT探針分析血小板淀粉樣變成分熒光探針顯示所有研究對象的血小板均存在熒光染色陽性，見圖1。

2.3Western印跡檢測Aβ淀粉樣變提取分離血小板的膜蛋白成分，經(jīng)過SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色結(jié)合抗Aβ抗體免疫反應，發(fā)現(xiàn)血漿中存在淀粉樣變蛋白，血小板膜中Aβ蛋白反應陽性，在43 kD和22 kD附近出現(xiàn)蛋白分子帶，提示有Aβ聚合物的存在，見圖2。

表1　不同年齡組末梢血血小板相關(guān)指標比較±s)

A：可見光觀察血小板(箭頭所示)；B：ThT熒光，箭頭所示ThT染色血小板圖1　熒光顯微鏡觀察ThT熒光染色(×400)

A、B：分別加入0～20歲和60～80歲血漿樣本；C、D：0～20歲和60～80歲血小板膜蛋白標本圖2　Western印跡分析血小板膜Aβ多肽成分

3　討　論

研究表明Aβ來自其前體蛋白APP〔6〕，通過β和 γ分泌酶作用于APP，產(chǎn)生各種長度Aβ片段和一個較小的碳末端片段(CTFγ)〔7〕。人類血小板表達所有APP形成Aβ的酶，血小板可能通過細胞內(nèi)信號激活參與AD淀粉樣變的形成。最近報道血小板通過自身生物功能參與AD患者淀粉樣變形成〔8〕，但是未明確是否參與淀粉樣變形成。探討血小板來源Aβ是否參與AD患者淀粉樣變形成將有利于解析其淀粉樣變形成的分子機制。前期我們報道了測定組織淀粉樣變的方法〔9〕，為分析細胞淀粉樣變奠定了技術(shù)基礎。本文發(fā)現(xiàn)血小板膜中存在與Aβ抗體發(fā)生免疫反應區(qū)帶，分子量明顯高于(Aβ40、Aβ42)多肽，提示存在Aβ集合分子，血小板特異性熒光染色陽性，說明血小板存在淀粉樣變成分。

1Hampel H,Shen Y,Walsh DM,etal.Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕.Exp Neurol,2010;223(2):334-46.

2Randriamboavonjy V,Sopova K,Stellos K,etal.Platelets as potential link between diabetes and Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2014;11(9):862-8.

3孫續(xù)國，劉金平，王慶艷，等.過氧化修飾與淀粉樣沉積形成〔J〕.中國煤炭工業(yè)雜志，2007；10(12)：1345-7.

4蘭杰，李曉亮，薛蓉，等.AD患者血漿淀粉樣變程度、血清總膽固醇水平、全血黏度變化及其相關(guān)性〔J〕.山東醫(yī)藥，2014；27(54)：11-3,17.

5Meyer-Luehmann M,Spires-Jones TL,Prada C,etal.Rapid appearance and local toxicity of amyloid-beta plaques in a mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.Nature,2008；451(179):720-4.

6Dobrowolska JA,Kasten T,Huang Y,etal.Diurnal patterns of soluble amyloid precursor protein metabolites in the human central nervous system〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e89998.

7Purandare N,Burns A,Morris J,etal.Association of cerebral emboli with accelerated cognitive deterioration in Alzheimer's disease and vascular dementia〔J〕.Am J Psychiatry,2012；169(3):300-8.

8Plagg B,Marksteiner J,Kniewallner KM,etal.Platelet dysfunction in hypercholesterolemia mice,two Alzheimer's disease mouse models and in human patients with Alzheimer's disease〔J〕.Biogerontology,2015;16(4):543-58.

9趙輝,潘濤,胡可勝,等.老年性關(guān)節(jié)病變關(guān)節(jié)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)TTR淀粉樣變〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(2)：239-41.

〔2016-01-07修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.080

國家自然科學基金(30973157)

孫續(xù)國(1965-)，男，教授，博士，博士生導師，主要從事淀粉樣變的發(fā)病機制與分子診斷的研究。

李曉亮(1988-)，男，碩士，主要從事血小板淀粉樣變成分的研究。

R741.03

A

1005-9202(2016)14-3524-02；

1天津檢驗檢疫理化檢驗中心