崔冬冰 范安然 何志旭,2* 舒莉萍

1.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心(貴陽(yáng)，550004);2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院兒科學(xué)教研室;3.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室

·基礎(chǔ)研究·

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)對(duì)染色體核型的影響

崔冬冰1范安然1何志旭1,2*舒莉萍3

1.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心(貴陽(yáng)，550004);2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院兒科學(xué)教研室;3.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室

目的：分離培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)并進(jìn)行體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)連續(xù)傳代的細(xì)胞形態(tài)、膜表面標(biāo)志、增殖、分化特性以及染色體核型進(jìn)行研究，以觀察體外培養(yǎng)對(duì)該細(xì)胞的影響，為其儲(chǔ)備和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法: 無(wú)菌條件下從新鮮人胎盤組織分離羊膜，采用組織貼壁法分離培養(yǎng)hAMSCs，并對(duì)原代細(xì)胞～P11代細(xì)胞利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其膜表面標(biāo)志物；取P3～P4代細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，免疫組化染色、PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況；采用染色體G顯帶法制備染色體核型。結(jié)果： hAMSCs形態(tài)似長(zhǎng)梭型，呈流水狀生長(zhǎng)，細(xì)胞活性高，凍存復(fù)蘇后仍能保持正常形態(tài)，并可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型; 細(xì)胞高表達(dá)CD90、CD73、CD44、CD105；細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可以向神經(jīng)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，神經(jīng)元特異性烯醇化酶和成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)檢測(cè)為陽(yáng)性，PCR檢測(cè)巢蛋白和骨橋蛋白基因表達(dá)為陽(yáng)性； P3～P10代的hAMSCs染色體核型均為正常二倍體核型。結(jié)論：hAMSCs在體外經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)后能保持間充質(zhì)干細(xì)胞的外顯和遺傳特性，并且未見(jiàn)染色體核型異常改變。

羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；傳代培養(yǎng)；核型

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因具有組織修復(fù)、免疫調(diào)控、支持造血、免疫原性低、易于分離培養(yǎng)、體外能大量擴(kuò)增及凍存等特點(diǎn)而受到關(guān)注，是干細(xì)胞研究及應(yīng)用的熱點(diǎn)[1]。細(xì)胞治療的安全性檢測(cè)方法包括：體外培養(yǎng)試驗(yàn)、裸鼠接種試驗(yàn)、高級(jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物移植試驗(yàn)、急性毒性反應(yīng)、慢性毒性反應(yīng)和器官組織學(xué)上的異物產(chǎn)生等[2]。由于體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境不同，在連續(xù)傳代擴(kuò)增的條件下，MSCs能否保持其生物學(xué)特性，染色體是否會(huì)發(fā)生變化，是其應(yīng)用的重要評(píng)估指標(biāo)。目前，對(duì)于hAMSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中遺傳學(xué)穩(wěn)定性的研究結(jié)果并不一致，也未見(jiàn)持續(xù)性的研究分析[3-4]。本研究通過(guò)對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分化特性及染色體核型的分析，以觀察體外培養(yǎng)對(duì)該細(xì)胞的影響，為其儲(chǔ)備和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

羊膜取自健康足月新生兒剖宮產(chǎn)手術(shù)后，經(jīng)家屬和產(chǎn)婦知情同意并簽署《胎盤處理協(xié)議書》后捐獻(xiàn)所得。

1.2 主要材料與儀器設(shè)備

L-DMEM(Gibco)、胎牛血清FBS(Hyclone)、胰蛋白酶(Hyclone)、神經(jīng)細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)劑(H-DMEM培養(yǎng)基、1mmol/l β-巰基乙醇)、神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑(H-DMEM、 2%DMSO、200μmol/l丁羥基茴香醚)、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(H-DMEM培養(yǎng)基、10mmol/l β-甘油磷酸鈉、50mg/l V-C、10-8mol/l地塞米松)、Human MSC Analysis Kit(BD 562245)、PCR試劑盒、引物(TaKaRa公司)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(NEST)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)、CO2培養(yǎng)箱( Thermo )、流式細(xì)胞儀(Backman MoFlo XDP)、倒置顯微鏡(Nikon TE-2000)、低溫冷凍離心機(jī)(eppendorf 5810)、PCR儀(eppendorf AG22331)、染色體核型分析系統(tǒng)(Leica)等。

1.3 hAMSCs分離和培養(yǎng)

無(wú)菌條件下將臍帶根部的胎盤剪下，剝離羊膜，用無(wú)菌NS清洗數(shù)次直至液體清亮，將其轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中用眼科剪剪成約0.2～0.5mm，記為P0代。轉(zhuǎn)入T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶放置10～15個(gè)組織塊，間隔0.5cm，加入約2.5～3ml培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)見(jiàn)組織塊周圍有細(xì)胞爬出后，隔天換液1次；細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)時(shí)，可挑出羊膜組織塊并移入新的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶用PBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液，當(dāng)見(jiàn)細(xì)胞皺縮、變圓，立即加入培養(yǎng)液中止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落并轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，800rpm離心3min，沉淀用培養(yǎng)液重懸，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，記為P1；當(dāng)傳代細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)可再次傳代，記為P2、P3…Pn。

1.4 hAMSCs的鑒定

1.4.1 免疫表型鑒定 取P0～P11代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面分子：CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5和CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。

1.4.2 細(xì)胞增殖特性 取P3～P10細(xì)胞按照1.0×106個(gè)/cm2接種于24孔板；次日長(zhǎng)成單層后，每日取1孔計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，連續(xù)7日；每代細(xì)胞重復(fù)5次，繪制增殖曲線。

1.4.3 分化潛能及其鑒定 消化體外擴(kuò)增的P3、P10細(xì)胞，按2.0×103/cm2接種于六孔板中；待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液分別換成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑(H-DMEM培養(yǎng)基、2%DMSO、200μmol/l BHA)和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑(H-DMEM培養(yǎng)基、10mmol/l β-甘油磷酸鈉、50mg/l V-C、8mol/l地塞米松)，分別培養(yǎng)4～6h和14d，免疫組化法檢測(cè)NSE和茜素紅染色檢測(cè)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)。

1.4.4 PCR檢測(cè) 分別收集誘導(dǎo)6h的神經(jīng)細(xì)胞、誘導(dǎo)14d的成骨細(xì)胞和未誘導(dǎo)細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, PCR儀擴(kuò)增，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。正反引物及擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度如下:Nest檢測(cè)引物：F:5'-ctggagctgcaattccctaggaccc-3';R:5'-gtgagacctctagaaaaagaggct-3'(791bp；Osteopontin 檢測(cè)引物F: 5'-ttcagacccttccaagtaagtcca-3'；R: 5'-tacatatgtaagtgatgtagttat-3'(782bp) ,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯影。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)7d左右可見(jiàn)組織塊周圍有細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為短粗梭形或三角形(圖1-a、b)?？尚纬杉?xì)胞集落，約培養(yǎng)15d細(xì)胞融合達(dá)70%～80%。原代培養(yǎng)時(shí)有羊膜上皮細(xì)胞(hAEC)，形態(tài)為卵圓形，鋪路石樣(圖1-c)，傳代后可去除。hAMSCs傳代后增殖迅速，形態(tài)一致，呈長(zhǎng)梭狀平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)(圖2)，并能在體外連續(xù)傳代15代以上。

2.2 hAMSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

從流式檢測(cè)的結(jié)果可見(jiàn)：P0代細(xì)胞CD90、CD73、CD44、CD105的陽(yáng)性表達(dá)較低，P1代后逐漸增加，P2～P8代細(xì)胞則穩(wěn)定高表達(dá)CD90、CD73、CD44、CD105，P9～P11代細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)稍低，而所有代次的細(xì)胞均不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR(圖3)。

2.3 hAMSCs細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，P3～P10傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線總體上呈“S”形，即第1～2d為潛伏期，細(xì)胞緩慢貼壁生長(zhǎng)，第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到增殖高峰，持續(xù)約4d，到第7d進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。提示傳代細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，增殖能力強(qiáng)，符合MSCs的生長(zhǎng)特點(diǎn)。

2.4 hAMSCs分化實(shí)驗(yàn)

如圖5所示，a圖為對(duì)照組，是未進(jìn)行誘導(dǎo)分化的細(xì)胞；b 圖為將該細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)4h后，細(xì)胞變短，體積變小，出現(xiàn)雙極或多極，免疫組化檢測(cè)NSE，染色為黃色；c圖是向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的結(jié)果，細(xì)胞被誘導(dǎo)14d后，匯合聚集后呈多層重疊生長(zhǎng)，形成成骨細(xì)胞特有的礦化結(jié)節(jié)，周圍折光性增強(qiáng)，茜素紅染色呈紅色。

2.5 PCR檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞被誘導(dǎo)后PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：Nestin和Osteopontin檢測(cè)均呈陽(yáng)性，第3、4泳道分別可見(jiàn)分子量為791bp和782bp陽(yáng)性反應(yīng)帶(圖6)。而未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞不表達(dá)該基因。

2.6 染色體核型分析

P3～P10代的hAMSCs染色體核型均為正常二倍體核型，未見(jiàn)染色體重復(fù)、缺失、易位等異常改變核型。

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下可以分化成多種功能細(xì)胞。由于具有增殖和分化的特性，干細(xì)胞作為“種子”細(xì)胞可參與細(xì)胞替代和組織再生。干細(xì)胞給某些疑難疾病的治療帶來(lái)了希望，受到廣泛關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，因其來(lái)源廣泛，在圍產(chǎn)期組織如臍血、胎盤、羊水和臍帶中含量豐富，易于獲得，不受倫理學(xué)限制等優(yōu)勢(shì)而受到研究者的青睞。

間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)已有很多報(bào)道，但是尚缺乏統(tǒng)一的遺傳標(biāo)志以及后續(xù)功能與應(yīng)用的深入研究[5-6]，尤其是關(guān)于人源的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。就培養(yǎng)方法而言，目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法，所分離培養(yǎng)出的MSCs形態(tài)特征、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞表面標(biāo)記物等無(wú)明顯差異。但操作方面各有利弊：酶消化法耗時(shí)較短，但成本較高，過(guò)程繁瑣，污染概率大，同時(shí)消化時(shí)間的長(zhǎng)短也影響細(xì)胞的活性。而組織塊法所獲得的細(xì)胞形態(tài)均一，增殖能力強(qiáng)，但細(xì)胞爬出的時(shí)間較長(zhǎng)。與傳統(tǒng)的組織塊法不同的是，本研究將羊膜組織塊接種于培養(yǎng)瓶底部后，自然干燥1～2h，使其緊貼培養(yǎng)瓶底部，然后再加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，避免了組織塊漂浮。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種方法能夠縮短細(xì)胞長(zhǎng)出的時(shí)間，提高獲得細(xì)胞的數(shù)量。

間充質(zhì)干細(xì)胞是最具有應(yīng)用前景的干細(xì)胞之一，目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了包括骨關(guān)節(jié)疾病、肝硬化、GVHD、脊髓損傷[7]及退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病等多項(xiàng)臨床應(yīng)用研究。我國(guó)已出臺(tái)了《關(guān)于干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》[8]， 意味著間充質(zhì)干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用即將成為可能。但是，體外培養(yǎng)都只能是模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，與體內(nèi)環(huán)境相比仍有很大區(qū)別，因而連續(xù)傳代擴(kuò)增的條件下，細(xì)胞的遺傳信息是否會(huì)發(fā)生改變，是臨床應(yīng)用安全性的重要指標(biāo)。美國(guó)FDA關(guān)于MSCs安全性評(píng)估體系中提出了染色體核型檢測(cè)要求，同時(shí)，核型分析的異常結(jié)果比癌基因的表達(dá)特異性更高[9]。因此在應(yīng)用細(xì)胞進(jìn)行治療前，染色體核型分析非常重要。大量研究表明，許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與染色體核型的變化密切相關(guān)[10]。hAMSCs經(jīng)體外長(zhǎng)期傳代后，細(xì)胞染色體是否會(huì)發(fā)生改變，以往文獻(xiàn)報(bào)道中大多只選擇了少數(shù)幾個(gè)代次進(jìn)行分析，多代次的報(bào)道較少[11]。本研究對(duì)P3～P11代hAMSCs的染色體核型分析結(jié)果提示，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)并未引起hAMSCs細(xì)胞染色體核型改變。另外從本研究的流式結(jié)果看出，原代培養(yǎng)的細(xì)胞就具有了間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，而且在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中，這種特性可以穩(wěn)定維持，但是穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間還有待進(jìn)一步研究。

[1] Marolt D,Augst A,Freed LE ,et a1. Bone and cartilage tissue constructs grownusing human bone marrow stromal cells,silk scaffolds and rotating bioreactors[J]．Biomaterials, 2006, 27(36)：6138-6149.

[2] 李六金,李秦,施新猷,等.五種動(dòng)物傳代細(xì)胞系對(duì)裸鼠的致瘤性[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000, 21(6): 738-740.

[3] Stewart MC,Stewart AA．Mesenchymal stem cells: characteristics，sources，and mechanisms of action[J]. Vet Clin N Am Equine Pract,2011,27( 2) : 254-261．

[4] Hua JL,Qiu BP,Zhu HJ,et al. Multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord: Potential differentiation of germ cells[J]. Afric J of Biochem Res,2011, 5(4):113-123.

[5] 付蒙,張艷梅,王佃亮,等．人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及臨床前研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志,2011,31 ( 12 ) : 115-119.

[6] 叢姍, 宋瑾, 張惠娟, 等．人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)的分離、體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015, 23(1): 20-31.

[7] Beatrice Dionigi, Azra Ahmed, David Zurakowski，et al．Partial or complete coverage of experimental spina bifida by simple intra-amniotic injection of concentrated amniotic mesenchymal stem cells[J]．Journal of Pediatric Surgery, 2015,50 : 69-73.

[8] 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》[s].國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委(2015)

[9] 張立新,陳亞寶,葉軍,等．臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型制備及安全評(píng)估[J].海南醫(yī)學(xué),2012,23(13):11-12．

[10] Frrhling S, Drhner H. Chromosomal abnormalities in cancer[J]. NEngl J Med, 2008, 359(2): 722-734．

[11] Ra JC,Shin IS,Kim SH,et al．Safety of intravenous infusion of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in animals and humans[J]．Stem Cells Dev, 2011,20( 8):1297-1308．

[責(zé)任編輯：王麗娜]

The effects of human amniotic mesenchymal stem cells in vitro culture on chromosome karyotype

CUI Dongbing1, FAN Anran1, HE Zhixu1,2*, SHU Liping3

1.TheCenterofStemCellandTissueEngineeringResearch,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004；2.DepartmentofPediatrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity; 3.Departmentofimmunology,GuizhouMedicalUniversit

*Correspondingauthor:HEZhixu,Email:hzx@gmc.edu.cn

Objective: After isolated and established human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs), and cultured for long-term in vitro, then to study in vitro subculture influence on hAMSCs by observing morphology of hAMSCs, the membrane surface marks, proliferation and differentiation, and its chromosome karyotype. And to provide the experimental evidences for reserving and clinical application of hAMSCs. Methods: The hAMSCs were isolated from human placenta tissues through tissue attachment culture methods. The immunophenotypes were detected by flow cytometry. The cells were induced to differentiate into nerves and osteoblasts by different culture system. The osteopontin and nestin genes were measured by PCR and Karyotype analysis was carried out with chromosome Giemsa banding method. Results: hAMSCs were dominated as long spindle cells and had grown in water shaped with high cell activity. After cryopreservation, hAMSCs could be recovered normal morphology, proliferated stably and showed typical 'S' curve of propagation. Positive expression of CD90, CD73, CD44and CD105 in hAMSCs were all high. After induction, hAMSCs could be differentiated into the nerve cell and osteoblast. The cells had positive of alizarin red staining and neuron specific enolase. Nestin and osteopontin genes were also positive in these cells. The chromosome karyotype of hAMSCs kept normal dipoid karyotype after P3 to P10 in vitro culture. Conclusion: After several generations in vitro subculture, hAMSCs can keep explicit features, genetic characteristics of mesenchymal stem cells and has no any change in chromosome karyotype.

Amniotic mesenchymal stem cells; Subculture; Karyotype

貴州省科學(xué)技術(shù)廳貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金計(jì)劃項(xiàng)目 黔科合LH字[2014]7078

2015-11-27

2016-03-15

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.04

*通訊作者：hzx@gmc.edu.cn