陳善萍，郭　釗，韋寶斌，徐　沖，韋貴將，唐毓金，王俊利▲

(右江民族醫(yī)學(xué)院1.2013級醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)本科，2.2011級醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科，3.附屬醫(yī)院，百色533000)

廣西壯族人群IL-27基因位點(diǎn)rs4740與rs181206多態(tài)性研究

陳善萍1，郭釗2，韋寶斌1，徐沖1，韋貴將3，唐毓金3，王俊利3▲

(右江民族醫(yī)學(xué)院1.2013級醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)本科，2.2011級醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科，3.附屬醫(yī)院，百色533000)

目的分析廣西壯族人群中白細(xì)胞介素27(IL-27)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs4740和rs181206的各基因型及等位基因型的分布頻率，并對不同種族間的分布差異進(jìn)行分析。方法利用SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測150名廣西壯族人IL-27基因SNP位點(diǎn)rs4740和rs181206的基因型，與國際人類基因組單倍型圖譜計劃(HapMap)上的四個人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的SNP分型數(shù)據(jù)做對比，分析IL-27基因SNP位點(diǎn)rs4740和rs181206的基因型及等位基因頻率在以上五個人群之間的差異。結(jié)果在廣西壯族人群中可發(fā)現(xiàn)白介素基因rs4740和rs181206存在多態(tài)性，廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與非洲人群、日本人群的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而與歐洲人群、中國北京人群的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);廣西壯族人群白介素基因rs181206位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲人群、非洲人群、日本人群以及中國北京人群的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論廣西壯族人群中白介素SNP位點(diǎn)rs4740和rs181206基因型及等位基因型的分布頻率與其他地區(qū)人群相比存在差異，這種差異可能導(dǎo)致某些疾病在不同地區(qū)間的發(fā)病率和臨床表現(xiàn)存在差異。

白細(xì)胞介素27;單核苷酸多態(tài)性;基因型;種族

白細(xì)胞介素27(interleukin-27，IL-27)，新近發(fā)現(xiàn)的IL-6/IL-12家族的細(xì)胞因子，大部分由已活化的抗原提呈細(xì)胞(包括樹突狀以及單核巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生，是由p28和EBI3兩個亞基構(gòu)成的異源二聚體，通過與其受體IL-27R(WSX-1/gp130)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能［1］。IL-27具有親和與抗炎的特性，可以通過調(diào)節(jié)輔助T細(xì)胞的發(fā)展，抑制T細(xì)胞增殖，刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)B細(xì)胞同種型的轉(zhuǎn)換，并且還參與多種自身免疫病［2］。近年來隨著流行病學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)IL-27的多個位點(diǎn)與多種腫瘤密切相關(guān)［3，4］，它具有抗腫瘤活性和抗血管生成活性。因而，準(zhǔn)確分析不同地區(qū)及人群中的白介素基因多態(tài)性分布，可以為基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生收集更多數(shù)據(jù)并提供研究價值。我們采用SNaPshot SNP分型技術(shù)對150名廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)結(jié)果與國際人類基因組單倍型圖譜計劃(Hap-Map)公布的四個人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的SNP檢測結(jié)果對比，從而分析不同人種白介素基因的SNP是否存在差異，以期為與白介素相關(guān)的遺傳和疾病等方面的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)資料。

1　資料與方法

1.1一般資料從右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院選擇150名進(jìn)行健康體檢并且體檢結(jié)果健康者作為研究對象(2012年1～8月)。研究對象要在廣西長期居住(時間＞10年)，籍貫均為廣西，民族均為壯族。在150名研究對象中，男性87名，女性63名，年齡范圍25～84歲，各項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均正常。

1.2基因組DNA的提取每位受試者抽取靜脈血2 ml，使用碘化鈉法提取細(xì)胞基因組DNA，低溫保存待用。

1.3PCR技術(shù)通過在NCBI上查找到的白介素基因DNA序列，選擇包含rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的序列并輸入到Primer 5引物設(shè)計軟件，從而得到用于特異性擴(kuò)增包含rs4740與rs181206位點(diǎn)白介素基因的PCR上下游引物和延伸引物。其中，rs4740位點(diǎn)的上游引物序列為:5’-CAGTGGCCCCTCTCCATCTTCT-3’，下游引物序列為:5’-CGAGGACCCAGGTGCTGTCTG-3’，延伸引物序列為:5’-TTTTTTTTTTCGGCCCCGAGCCAGGTACTAC-3’。rs181206位點(diǎn)的上游引物序列為:5’-CAGCTGCATCCTCTCCATGTTG-3’，下游引物序列為:5’-GCTGAGGTGGGGGAAGAGCTAC-3’，延伸引物序列為:5’-TTTTGGTCCCCAGCCCTCCCAGC-3’。20 μL白介素基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:10×PCR反應(yīng)緩沖液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，HotStar Taq DNA聚合酶1.0 U，基因組DNA1.0 μL，不足體積20 μL用水補(bǔ)足。PCR產(chǎn)物4℃保存。PCR反應(yīng)條件為:94℃，15 min;94℃×30 s，60℃×30 s，72℃×20 s，共35個循環(huán);72℃×10 min。最后PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.4SNaPshot SNP分型技術(shù)用 ABI公司的SNaPshot Multiplex kit對經(jīng)過蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)，然后在ABI 3130XL對用蝦堿酶純化后的延伸產(chǎn)物進(jìn)行上樣，最后用Gene Mapper 4.0(Applied biosystems)來分析SNP分型。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法根據(jù)測序結(jié)果直接對白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率進(jìn)行計算，并從NCBI查找到HapMap公布的白介素基因rs4740以及rs181206位點(diǎn)在四個人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的分型結(jié)果，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，對比廣西壯族人群與四個人群的基因型和等位基因頻率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2　結(jié)　果

2.1白介素基因位點(diǎn)rs4740和rs181206的檢測結(jié)果包含白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為250 bp和248 bp。從ABI 3130XL的SNP分型結(jié)果中可得，rs4740位點(diǎn)的基因型有三種，分別為AA、GG和AG，基因分型結(jié)果見圖1。rs181206位點(diǎn)的基因型有三種，分別為AA、GG和AG(該位點(diǎn)沒有基因型為G/G的樣本)，基因分型結(jié)果見圖2。

圖1　rs4740位點(diǎn)的基因分型結(jié)果

圖2　rs181206位點(diǎn)的基因分型結(jié)果

2.2廣西壯族人群白介素基因多態(tài)性分布根據(jù)檢測結(jié)果對白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率進(jìn)行計算，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，150份樣本的白介素基因位點(diǎn)rs4740和rs181206的基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，說明研究對象可以代表中國廣西地區(qū)人群白介素基因多態(tài)性分布情況，rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的統(tǒng)計結(jié)果分別如表1和表2所示，在廣西壯族人群中，白介素基因A等位基因型在以上兩個位點(diǎn)的頻率均為最高，其中在 rs4740位點(diǎn)約為51.0%，在rs181206位點(diǎn)約為53.0%;GA基因型在以上兩個位點(diǎn)最常見，其中在rs4740位點(diǎn)約為47.4%，在rs181206位點(diǎn)約為94.0%，并且可知白介素基因型及等位基因頻率男女組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3廣西壯族人群與其他四個人群白介素基因多態(tài)性的比較廣西壯族人群白介素基因多態(tài)性與其他四個人群的比較結(jié)果顯示，廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與非洲、日本人群的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而與歐洲、中國北京人群的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。廣西壯族人群白介素基因rs181206位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲、非洲、日本人群以及中國北京人群的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。比較結(jié)果如表3和表4所示。

表1　廣西壯族人群中rs4740位點(diǎn)的分布［n(%)］

表2　廣西壯族人群中rs181206位點(diǎn)的分布［n(%)］

表3　廣西壯族人群與不同人群白介素rs4740位點(diǎn)多態(tài)性的比較［n(%)］

表4　廣西壯族人群與不同人群白介素rs181206位點(diǎn)多態(tài)性的比較［n(%)］

3　討　論

IL-27由p28和EBI3亞基通過二硫鍵結(jié)合形成，其基因位于第16對染色體短臂上(16p11)，具有4個內(nèi)含子和5個外顯子［5］。早期發(fā)現(xiàn)p28單獨(dú)不能分泌，后研究發(fā)現(xiàn)兩亞基不完全同時表達(dá)，只有兩亞基同時表達(dá)才能高效分泌IL-27［6］。IL-27是Th1類細(xì)胞因子，由可溶性受體EBI3和螺旋狀蛋白IL-27 p28兩個亞基組成，通過廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞表面的IL-27受體 WSX-1 gp130發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［7］。

多數(shù)相關(guān)研究證實(shí)，IL-27基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與多種疾病具有相關(guān)性。喻紫晨［8］采用PCR以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測160例骨肉瘤患者(研究組)和 250例健康者(對照組)中 IL-27基因-964A/G，2905T/C和4730T/C，得出血清 IL-27p28低水平可能與骨肉瘤進(jìn)展有關(guān)，但I(xiàn)L-27基因-964A/ G，2905T/C和4730T/C多態(tài)性及它們的單倍型與骨肉瘤的風(fēng)險無關(guān)聯(lián)。黃艷平等［3］采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測41例初治MM患者(觀察組)和40例健康體檢者(對照組)血漿IL-27的表達(dá)，得出在初治MM中，IL-27表達(dá)下降，未發(fā)現(xiàn)總體生存時間有預(yù)測效能。馮佳等人［1］運(yùn)用Meta分析方法綜合評價中國人群IL-27 p28基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系，檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫等收集IL-27 p28基因多態(tài)性與腫瘤相關(guān)的文獻(xiàn)。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選合適文獻(xiàn)并提取所需數(shù)據(jù)，使用軟件(Stata12.0 Stata Corp，College Station，TX，USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，中國人群IL-27 p28基因多態(tài)性rs17855750位點(diǎn)G等位基因型和GG+GT基因型可能與腫瘤遺傳易感性有關(guān)。

本研究利用SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測150名廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型，并通過HapMap上四個人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的SNP分型數(shù)據(jù)，對比五個人群的白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率差異。通過對比結(jié)果顯示白介素基因型頻率男女組間比較差異無顯著性，說明此位點(diǎn)基因型分布與性別沒有關(guān)系;從對比廣西壯族人群位點(diǎn)rs4740與rs181206同歐洲、非洲、日本以及中國北京人群可知:廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與非洲、日本人群的差異顯著，而與歐洲、中國北京人群的差異不明顯。廣西壯族人群白介素基因rs181206位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲、非洲、日本人群以及中國北京人群的差異均有顯著性。因此說明白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率與人種有著密切關(guān)系。

研究結(jié)果不僅提供了白介素基因位點(diǎn)rs4740和rs181206在廣西壯族人群的多態(tài)性分布，并對比了白介素基因在不同人種的SNP差異，為與白介素相關(guān)的疾病研究提供了參考研究資料，也為人類學(xué)和群體遺傳學(xué)補(bǔ)充了重要數(shù)據(jù)。

［1］馮佳，夏燕，向詩非，等.IL-27基因多態(tài)性與腫瘤易感性關(guān)聯(lián)的Meta分析［J］.免疫學(xué)雜志，2015，31 (11):969-972.

［2］祁荊荊，王瑩，石冰玉，等.IL-27通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群參與干燥綜合征［J］.免疫學(xué)雜志，2015，31(12): 1056-1066.

［3］黃艷平，黃錦雄，楊飛燕，等.探討suPAR與IL－27對多發(fā)性骨髓瘤總體生存時間的預(yù)測效能［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2016，45(6):760-762.

［4］劉智豪，朱小彤，李明松，等.IL-27在腫瘤免疫治療中的潛在價值［J］.免疫學(xué)雜志，2016，32(1):89-92.

［5］Wang OC，Huang GL，Yang F，et al.IL-27 rs153109 polymorphism increases the risk of colorectal cancer in Chinese Han population［J］.Onco Targets Ther，2015(8): 1493-1497.

［6］王利娟，王滿俠.IL-27對輔助T細(xì)胞相關(guān)疾病的作用［J］.中國免疫學(xué)雜志，2016，32(2):284-288.

［7］邱熔芳，李際盛，高貴敏，等.IL27p28基因啟動子區(qū)域-964A＞G位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群支氣管哮喘的相關(guān)性［J］.山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，46(11):1022-1027.

［8］喻紫晨.IL-27基因多態(tài)性和血清IL-27p28水平與骨肉瘤風(fēng)險相關(guān)性分析［J］.實(shí)用癌癥雜志，2016，31(2): 183-186.

(編輯:潘明志)

A study of polymorphism of IL-27 gene locus rs4740 and rs181206 of Zhuang population in Guangxi

CHEN Shanping1，GUO Zhao2，WEI Baobin1，XU Chong1，WEI Guijiang3，TANG Yujin3，WANG Junli3▲
(1.Undergraduate of Medical Laboratory Technology of Grade 2013，2.Undergraduate of Laboratory Medicine of Grade 2011，3.Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China)

ObjectiveTo analyze distribution frequency of genotype and allele of interleukin-27(IL-27)single nucleotide polymorphism(SNP)locus rs4740 and rs181206 of Zhuang population in Guangxi，and to analyze distribution differences among different races.MethodsSNaPshot SNP typing technology was used to test IL-27 gene SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes in 150 cases of Zhuang population in Guangxi，and comparing the above-mentioned rs4740 and rs181206 genotypes to SNP typing data from four populations(Europe，Africa，Japan，and Beijing)on the international human genome haplotype map(HapMap).And then，differences between IL-27 gene SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes and allele frequencies among the above-mentioned five groups were analyzed.ResultsPolymorphism of interleukin gene rs4740 and rs181206 was found in Zhuang population in Guangxi.Difference of genotype and allele frequency of rs4740 locus in Zhuang population in Guangxi and those of African population and Japanese population was statistically significant(P＜0.05)，but difference of those of European population and Beijing population was not statistically significant(P＞0.05).However，differences of genotype and allele frequency of rs181206 locus in Zhuang population in Guangxi and those of European population，African population，Japanese population and Beijing population were all statistically significant(P＜0.05).Conclusion There is difference between SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes and allele distribution frequencies of Zhuang popula-tion in Guangxi and those of population in other areas，this difference may lead to differences in the incidence and clinical manifestations of certain diseases in different regions.

IL-27;single nucleotide polymorphism;genotype;race

R394

ADOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.03.001

國家自然科學(xué)基金(81541136)

陳善萍，女，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)本科在讀。E-mail:1308104223@qq.com
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王俊利。E-mail:baisewangjunli@163.com

2016－03－23

2016－06－12)