胡風(fēng)戰(zhàn)，原婉瓊，王曉林，秦彩朋，盛正祚，杜依青，殷華奇，徐　濤△

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科， 北京　100044； 2. 北京大學(xué)人類疾病基因研究中心， 北京　100191)

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·論著·

敲減CMTM3增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞系PC3遷移與侵襲能力

胡風(fēng)戰(zhàn)1，原婉瓊2，王曉林2，秦彩朋1，盛正祚1，杜依青1，殷華奇1，徐濤1△

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科， 北京100044； 2. 北京大學(xué)人類疾病基因研究中心， 北京100191)

目的：應(yīng)用慢病毒載體shRNA對(duì)PC3細(xì)胞中的人趨化素樣因子超家族成員3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3，CMTM3)進(jìn)行敲減，以探究CMTM3對(duì)前列腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為改變的影響。方法： 研究分為兩組進(jìn)行，其中shN為未敲減CMTM3的PC3細(xì)胞系對(duì)照組，sh393為敲減CMTM3的PC3細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)組。運(yùn)用Western blot檢測PC3細(xì)胞系慢病毒shRNA敲減CMTM3后的表達(dá)，Transwell與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測敲減CMTM3對(duì)PC3細(xì)胞系遷移能力的影響，Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測敲減CMTM3對(duì)PC3細(xì)胞系侵襲能力的影響。結(jié)果： 前列腺癌細(xì)胞系PC3經(jīng)慢病毒敲減CMTM3后，sh393組CMTM3表達(dá)水平明顯低于shN組(0.004 0±0.000 4vs. 0.490 0±0.055 7，P<0.001)， 且sh393組侵襲(248.6±4.5vs. 113.0± 3.3)、遷移(203.6±1.9vs. 103.0±1.2)及遷移愈合能力(95.0±2.9vs. 33.0±1.5)均明顯強(qiáng)于shN組(P<0.001)。結(jié)論： 敲減CMTM3可以影響PC3細(xì)胞的遷移與侵襲能力，CMTM3下調(diào)與PC3細(xì)胞系腫瘤生物學(xué)特性的改變可能具有負(fù)相關(guān)性。

前列腺腫瘤；CMTM3；基因敲減技術(shù)；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；體外研究

前列腺癌是男性常見的泌尿生殖系腫瘤之一，在我國發(fā)病率雖低于歐美[1-2]，但隨著近年來經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，我國群眾的飲食和生活方式逐漸與西方接近，尤其是伴隨著人口老齡化的來臨，前列腺癌的發(fā)病率及病死率均出現(xiàn)較大程度地增加[3-4]，因此，加強(qiáng)對(duì)前列腺癌這一危害男性健康的惡性疾病的研究與治療刻不容緩[5-6]。

前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其向去勢(shì)抵抗轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制仍不清楚[7-8]，目前腫瘤免疫相關(guān)研究證實(shí)，前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能與四跨膜蛋白超家族(transmembrane-4 superfamily，TM4SF)密切相關(guān)，TM4SF包括MARVEL結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，在消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮重要作用[9-10]。CKLF樣MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3，CMTM3)是人趨化素樣因子超家族(chemokine-like factor super family member，CKLFSF)的一員，具有典型的四跨膜受體TM4SF結(jié)構(gòu)，研究顯示其作為腫瘤抑制性基因具有潛在的靶向治療研究價(jià)值[11-13]。CMTM3在進(jìn)化過程中高度保守，廣泛表達(dá)于人類正常組織，尤其在睪丸、脾、白細(xì)胞中高度表達(dá)，但在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系和組織中表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)，恢復(fù)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附和遷移等生物學(xué)行為。有研究顯示，CMTM3的表達(dá)水平與前列腺癌的分級(jí)、分期具有間接的負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]，在前列腺癌LNCaP細(xì)胞系中CMTM3與雄激素受體表達(dá)關(guān)系密切[15]，本研究擬對(duì)CMTM3在前列腺癌細(xì)胞系PC3中的作用做初步探討。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所用兔抗人CMTM3多克隆抗體由北京大學(xué)人類疾病基因組中心提供，靶向沉默人CMTM3基因位點(diǎn)的pGIPZ慢病毒shRNA微載體(sh393組)與無CMTM3基因位點(diǎn)沉默的pGIPZ慢病毒載體(shN組)由Thermo Fisher Scientific公司Open Biosystems合成。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清、100×青霉素鏈霉素雙抗、100×L-谷氨酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]等均購自美國Life Technology公司，前列腺癌細(xì)胞系PC3購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)， Transwell和Matrigel小室等購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

骨轉(zhuǎn)移灶來源前列腺癌細(xì)胞系PC3采用RPMI-1640培養(yǎng)基加10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素以及1%(體積分?jǐn)?shù))HEPES緩沖液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)

將培養(yǎng)細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗2遍后加入RIPA裂解液，提取蛋白質(zhì)。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜；三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(triethanolamine buffered saline solution-Tween，TBS-T)洗膜后加入二抗(GAPDH抗體不加), 室溫1 h，TBS-T洗膜后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)，Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)顯影，分析結(jié)果并拍照。

1.4Transwell與Matrigel實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前先將兩組PC3細(xì)胞于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。第2天，將含有1×105(Matrigel實(shí)驗(yàn))或5×104(Transwell實(shí)驗(yàn))個(gè)細(xì)胞的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基接種到上室，小室下壁未覆蓋Matrigel(Transwell實(shí)驗(yàn))或覆蓋Matrigel(Matrigel實(shí)驗(yàn))，下室加入0.5 mL含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃孵育，合適時(shí)間點(diǎn)后取出上室，4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定10 min，2%(體積分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色10 min，100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)將PC3細(xì)胞培養(yǎng)于2%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，以期最大限度減少增殖對(duì)細(xì)胞遷移愈合能力的影響，先用記號(hào)筆在6孔板背后，用直尺均勻地劃橫線，大約每隔0.5～1.0 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線，在孔中加入約0.5×105個(gè)細(xì)胞，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%。第2天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)?？稍?、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)取樣并拍照，具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定，使用Image J軟件打開圖片，隨機(jī)劃取6～8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，腫瘤生物學(xué)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用t檢驗(yàn)分析各組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CMTM3在前列腺癌細(xì)胞系PC3中的表達(dá)水平

Western blot實(shí)驗(yàn)表明，sh393組CMTM3表達(dá)水平明顯低于shN組(0.004 0±0.000 4vs. 0.490 0±0.055 7，P<0.001，圖1)。

圖1敲減CMTM3后的PC3細(xì)胞系中CMTM3的表達(dá)水平
Figure 1The expression of CMTM3 after knockdown of CMTM3 in PC3 cell

2.2敲減CMTM3后PC3細(xì)胞系侵襲能力增強(qiáng)

Matrigel實(shí)驗(yàn)表明，sh393組侵襲能力明顯強(qiáng)于shN組(248.6±4.5vs. 113.0± 3.3，P<0.001，圖2A)。

2.3敲減CMTM3后PC3細(xì)胞系遷移能力明顯增強(qiáng)

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，sh393組遷移能力明顯強(qiáng)于shN組(203.6±1.9vs. 103.0±1.2，P<0.001，圖2B)。

2.4敲減CMTM3后PC3細(xì)胞系相對(duì)遷移愈合能力明顯增強(qiáng)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh393組相對(duì)遷移愈合能力明顯強(qiáng)于shN組(95.0±2.9vs. 33.0±1.5，P<0.001，圖3)。

圖2敲減CMTM3后PC3細(xì)胞系侵襲(A)和遷移(B)能力增強(qiáng)
Figure 2Knockdown of CMTM3 promotes invasion(A) and migration(B) of PC3 cell

3　討論

本研究結(jié)合已有的關(guān)于CMTM3在前列腺癌中的研究報(bào)道，進(jìn)一步豐富了CMTM3在前列腺癌細(xì)胞系腫瘤生物學(xué)行為方面的研究內(nèi)容，對(duì)于趨化素樣因子在人類前列腺癌腫瘤基因治療方面的作用有了進(jìn)一步的了解。

在染色體定位上，CKLF和CMTM1～4定位于16q22.1，CMTM6～8定位于3p22.3，形成兩個(gè)基因簇，而CMTM3位于16q22.1，該位點(diǎn)與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，而且此前研究已證實(shí)CMTM3具有腫瘤抑制基因作用[16]。CMTM3在人體正常組織中呈廣譜表達(dá)，且位于人類染色體16q22.1上的CMTM3基因缺失、甲基化等表觀遺傳學(xué)的改變可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。對(duì)于其在多種不同來源的腫瘤組織和相應(yīng)細(xì)胞系(如胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、腎癌與睪丸癌)中的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，CMTM3表達(dá)水平較對(duì)照組表達(dá)下調(diào)或者缺如，應(yīng)用腺病毒或其他載體系統(tǒng)過表達(dá)CMTM3基因可以對(duì)腫瘤細(xì)胞系的遷移、侵襲、增殖能力產(chǎn)生影響，且在不同組織來源的腫瘤細(xì)胞系其效果不同，而選擇性下調(diào)CMTM3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞系的遷移、侵襲能力等腫瘤惡性程度指標(biāo)具有增強(qiáng)作用。在這些腫瘤，尤其是前列腺癌中，CMTM3作為潛在的抑癌基因具有治療靶點(diǎn)的應(yīng)用價(jià)值。

CMTM3在前列腺癌及其細(xì)胞系(PC3、LNCaP)中的作用尚不明確，本課題組發(fā)表的文章闡釋了CMTM3的表達(dá)水平與前列腺癌組織病理分期、分級(jí)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時(shí)應(yīng)用低表達(dá)CMTM3的LNCaP細(xì)胞系進(jìn)行腺病毒感染過表達(dá)CMTM3，從恢復(fù)CMTM3表達(dá)的角度驗(yàn)證了CMTM3對(duì)前列腺癌腫瘤生物學(xué)行為的抑制作用[17-20]?；謴?fù)CMTM3表達(dá)不僅可在體外抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖與遷移，還可在體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長。本研究對(duì)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充和完善，通過對(duì)骨轉(zhuǎn)移灶來源的前列腺癌細(xì)胞系PC3的慢病毒shRNA沉默以及進(jìn)一步的腫瘤生物學(xué)遷移、侵襲等相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)，表明CMTM3對(duì)前列腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力具有明顯的抑制作用，提示CMTM3可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

圖3敲減CMTM3后PC3細(xì)胞系相對(duì)遷移愈合能力增強(qiáng)
Figure 3Knockdown of CMTM3 promotes relative migration ability of PC3 cell

前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CMTM家族成員中的CMTM5、CMTM7和CMTM8 均可通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體而抑制下游信號(hào)分子的活化，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的作用[21-23]，但本文并未對(duì)CMTM3在前列腺癌的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行研究,這是本研究的不足之處。

綜上，CMTM3的表達(dá)缺失可能參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，CMTM3對(duì)前列腺癌進(jìn)展及向激素非依賴狀態(tài)和骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的轉(zhuǎn)變所起到的作用，還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina, 2015[J].CACancerJClin, 2016, 66(2): 115-132.

[2]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics, 2016[J].CACancerJClin, 2016, 66(1): 7-30.

[3]TorreLA,BrayF,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics, 2012[J].CACancerJClin, 2015, 65(2): 87-108.

[4]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin, 2011, 61(2): 69-90.

[5]MarquesRB,DitsNF,Erkens-SchulzeS,etal.Bypassmechanismsoftheandrogenreceptorpathwayintherapy-resistantprostatecancercellmodels[J].PLoSOne, 2010, 5(10):e13500.

[6]ZhangL,WuS,GuoLR,etal.Diagnosticstrategiesandtheincidenceofprostatecancer:reasonsforthelowreportedincidenceofprostatecancerinChina[J].AsianJAndrol, 2009, 11(1): 9-13.

[7]ZhuML,KyprianouN.Androgenreceptorandgrowthfactorsignalingcross-talkinprostatecancercells[J].EndocrRelatCancer, 2008, 15(4): 841-849.

[8]PezaroC,RosenthalMA,GurneyH,etal.Anopen-label,single-armphasetwotrialofgefitinibinpatientswithadvancedormetastaticcastration-resistantprostatecancer[J].AmJClinOncol, 2009, 32(4): 338-341.

[9]朱林靜，來翀.TM4SF與整合素共同調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2009, 38(2): 208-214.

[10]WangS,LiY,HanF,etal.IdentificationandcharacterizationofMARVELD1,anovelnuclearproteinthatisdown-regulatedinmultiplecancersandsilencedbyDNAmethylation[J].CancerLett, 2009, 282(1): 77-86.

[11]HemlerME.Tetraspaninproteinspromotemultiplecancerstages[J].NatRevCancer, 2014, 14(1): 49-60.

[12]LeeSA,KimYM,KwakTK,etal.Theextracellularloop2ofTM4SF5inhibitsintegrinalpha2onhepatocytesundercollagentypeIenvironment[J].Carcinogenesis, 2009, 30(11): 1872-1879.

[13]LeeD,LeeJW.Self-renewalandcirculatingcapacitiesofmetastatichepatocarcinomacellsrequiredforcollaborationbetweenTM4SF5andCD44[J].BMBRep, 2015, 48(3): 127-128.

[14]DiMeoS,AiroldiI,SorrentinoC,etal.Interleukin-30expressioninprostatecanceranditsdraininglymphnodescorrelateswithadvancedgradeandstage[J].ClinCancerRes, 2014, 20(3): 585-594.

[15]WangY,LiT,QiuX,etal.CMTM3canaffectthetranscriptionactivityofandrogenreceptorandinhibittheexpressionlevelofPSAinLNCaPcells[J].BiochemBiophysResCommun, 2008, 37(1): 54-58.

[16]WangY,LiJ,CuiY,etal.CMTM3,locatedatthecriticaltumorsuppressorlocus16q22.1,issilencedbyCpGmethylationincarcinomasandinhibitstumorcellgrowththroughinducingapoptosis[J].CancerRes2009, 69(12): 5194-5201.

[17]RichieJP.Re:CMTM3inhibitshumantesticularcancercellgrowththroughinducingcell-cyclearrestandapoptosis[J].JUrol, 2015, 194(3): 706-707.

[18]HuF,YuanW,WangX,etal.CMTM3isreducedinprostatecancerandinhibitsmigration,invasionandgrowthofLNCaPcells[J].ClinTranslOncol, 2015, 17(8): 632-639.

[19]DelicS,ThuyA,SchulzeM,etal.SystematicinvestigationofCMTMfamilygenessuggestsrelevancetoglioblastomapathogenesisandCMTM1andCMTM3asprioritytargets[J].GenesChromosomesCancer, 2015, 54(7): 433-443.

[20]SuY,LinY,ZhangL,etal.CMTM3inhibitscellmigrationandinvasionandcorrelateswithfavorableprognosisingastriccancer[J].CancerSci, 2014, 105(1): 26-34.

[21]謝京，蕭云備，劉振華，等. 腎透明細(xì)胞癌組織中CMTM家族的表達(dá)及意義[J]. 中華泌尿外科雜志, 2013, 34(2): 123-125.

[22]胡浩, 陳京文, 許克新, 等.CMTM8與E-cadherin在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2013, 45(4): 537-541.

[23]袁也晴, 蕭云備, 劉振華, 等. 趨化素樣因子超家族成員5研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 34(6): 625-628.

(2016-03-09收稿)

(本文編輯：趙波)

Knockdown of CMTM3 promotes migration and invasion of PC3 cellinvitro

HU Feng-zhan1, YUAN Wan-qiong2, WANG Xiao-lin2, QIN Cai-peng1, SHENG Zheng-zuo1, DU Yi-qing1, YIN Hua-qi1, XU Tao1△

(1. Department of Urology, Peking University People’ s Hospital, Beijing 100044, China; 2．Peking University Center for Human Disease Genomics,Beijing 100191, China)

Objective：To investigate the change of biological characteristics after stable knockdown of CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3 (CMTM3) expression in PC3 by lentivirus shRNA and to reveal new therapeutic targets. Methods: The research includes two groups: sh393 is the experimental group in whichCMTM3 is knocked down in PC3 cell line; shN is the control group in whichCMTM3 is negatively knocked down. The expression ofCMTM3 was detected by Western blot. The migration ability of PC3 after stable knockdown was detected by Transwell and Wound healing assay. The invasion ability of PC3 was detected by Matrigel assay. Results were obtained from at least three indivi-dual experiments. Results: The expression ofCMTM3 in sh393 group is significant lower than shN group (0.004 0±0.000 4vs. 0.490 0±0.055 7,P<0.001) detected by Western blot. It also had statistical significance in Matrigel assays (248.6±4.5vs. 113.0± 3.3), Transwell (203.6±1.9vs. 103.0±1.2) and Wound healing assays (95.0±2.9vs. 33.0±1.5) that knockdown ofCMTM3 promoted migration, and invasion of PC3 cellsinvitro(P<0.001). Conclusion: Negative correlation exists between the stable knockdown ofCMTM3 and change of biological characteristics in PC3 cells, and knocking downCMTM3 affects migration, and invasion ability in PC3 cells.

Prostatic neoplasms;CMTM3; Gene knockdown techniques; Cell migration assays;Invitro

國家自然科學(xué)基金(81072099)資助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81072099)

R737.25

A

1671-167X(2016)04-0594-04

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.005

△ Corresponding author’s e-mail,xutao@medmail.com.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-2914:18:36網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160629.1418.020.html