朱久新 劉 影 杜智敏

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)·150081）

·方藥研究·

常輕膠囊增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)研究

朱久新 劉 影 杜智敏

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)·150081）

目的： 研究常輕膠囊增強(qiáng)免疫力功能的作用。方法：采用雌性ICR小鼠，設(shè)定0.34,0.67，2.01g/kg三個(gè)劑量，每日灌胃給予相應(yīng)樣品，連續(xù)給予30天，檢測(cè)動(dòng)物體重、胸腺、脾臟、ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、DNFB誘導(dǎo)的DTH、溶血空斑數(shù)、血清半數(shù)溶血值、碳廓清指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞、NK細(xì)胞活性的影響。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，常輕膠囊0.67，2.01g/kg可明顯增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及增強(qiáng)小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)，0.67，2.01g/kg可提高小鼠的半數(shù)溶血值和高劑量能增加小鼠的抗體生成細(xì)胞, 2.01g/kg可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)論：根據(jù)“保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”中的判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為某品牌常輕膠囊具有增強(qiáng)免疫力的功能。

當(dāng)今自然環(huán)境日趨惡化，社會(huì)結(jié)構(gòu)和工作節(jié)奏發(fā)生了巨大的變化，疾病譜也發(fā)生了改變，一些惡性疾病（腫瘤等）發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，促使人們更加關(guān)注身體健康與飲食的相互關(guān)系，具有保健功能的食品越來(lái)越受到重視。保健食品在我國(guó)歷史悠久，這是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中有“藥食同源”的理論為指導(dǎo)所致，通過(guò)對(duì)已報(bào)道具有免疫調(diào)節(jié)作用“藥食同源”的傳統(tǒng)中藥進(jìn)行篩選，我們?cè)趥鹘y(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下，開(kāi)發(fā)出具有免疫調(diào)節(jié)功能的常輕膠囊，處方組成為黃芪、山楂、大棗、枸杞子和螞蟻。本文研究了常輕膠囊對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性的影響，為其作為保健品應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SPF 級(jí)雌性ICR小鼠200 只，體重(20±2) g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

藥品與試劑：綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、雞紅細(xì)胞、生理鹽水、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉 1.0g，高鐵氰化鉀0.2g，氰化鉀0.05g，加蒸餾水至1000ml）、印度墨汁、Na2CO3、Hank’s液(pH7.2～7.4)、RPMI 1640完全培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、氧化型輔酶I、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)、YAC-1細(xì)胞、1% NP40、2-巰基乙醇(2-ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、鹽酸、異丙醇、MTT、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、丙酮、甲醇、Giemsa染液等。

1.1.2 儀器與設(shè)備 動(dòng)物天平、分析天平、冰箱、離心機(jī)、722分光光度計(jì)、顯微鏡、潔凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、無(wú)菌手術(shù)器械、游標(biāo)卡尺(精密度0.01mm)、微量注射器(25μl)、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、紗布、試管、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、24孔培養(yǎng)板等。

1.2 方法

1.2.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測(cè)定 末次給藥后，無(wú)菌取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖反應(yīng)。

1.2.2 NK細(xì)胞活性測(cè)定(測(cè)定法) 末次給藥后，無(wú)菌取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，LDH法測(cè)定NK細(xì)胞活性。

NK%=(反應(yīng)孔OD－自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD－自然釋放孔OD)×100%

1.2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法） 每只鼠經(jīng)腹腔注射2%（V／V，用生理鹽水配制）壓積SRBC（2000rpm，10分鐘）0.2ml，致敏后4天，測(cè)量左后足跖部厚度，同一部位測(cè)量三次，取平均值。然后在測(cè)量部位皮下注射20%（V／V，用生理鹽水配制）壓積SRBC 20μl，于注射后24小時(shí)測(cè)量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度的差值（足跖腫脹度）來(lái)表示DTH的程度。

1.2.4 半數(shù)溶血值的測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4～5天2%(v/v)的綿羊紅細(xì)胞懸液進(jìn)行動(dòng)物免疫。免疫4～5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋250倍，取1ml置試管內(nèi)，依次加入10%（V／V，用SA緩沖液配制）壓積SRBC 0.5ml，補(bǔ)體1ml（用SA緩沖液按1:10稀釋）。另設(shè)不加血清的對(duì)照管（以SA緩沖液代替）。置37℃恒溫水浴中保溫30分鐘后，冰浴終止反應(yīng)。2000rpm離心10分鐘，取上清液1ml、加都氏試劑3ml，同時(shí)取10%（V／V，用SA緩沖液配制）的壓積SRBC 0.25ml、加都氏試劑至4ml于另一試管中，充分混勻，放置10分鐘后，于540nm波長(zhǎng)處以對(duì)照管作空白，分別測(cè)定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下式計(jì)算。

樣品HC50＝樣品光密度值／SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值×稀釋倍數(shù)

1.2.5 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)。制備脾細(xì)胞懸液，采用(Jerne改良玻片法)測(cè)定溶血空斑數(shù)。

1.2.6 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和臟/體比值的測(cè)定。小鼠按0.1ml/10g體重尾靜脈注射1:3.5倍稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。注入墨汁后2、10分鐘，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2mL Na2CO3溶液中。將小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取肝臟、脾臟和胸腺去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。用722分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)α：

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。半體內(nèi)法按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬率%=（吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞*100

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/ 100個(gè)巨噬細(xì)胞

1.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。如方差齊，計(jì)算F值。F值＜F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值≥F0.05,P≤0.05，再用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 常輕膠囊對(duì)小鼠脾臟及胸腺系數(shù)的影響

表1 常輕膠囊對(duì)小鼠脾臟及胸腺系數(shù)的影響

由表1可見(jiàn)，常輕膠囊對(duì)小鼠脾臟及胸腺臟器系數(shù)無(wú)影響（p＞0.05）。

2.2 常輕膠囊對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

表2 常輕膠囊對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

表2 常輕膠囊對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

注：與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異*P＜0.05。

?

由表2可見(jiàn)，常輕膠囊中、高劑量組顯著增加小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（p＞0.05）。

2.3 常輕膠囊對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

表3 常輕膠囊對(duì)小鼠半數(shù)溶血值（HC50）、抗體生成細(xì)胞的影響

表3 常輕膠囊對(duì)小鼠半數(shù)溶血值（HC50）、抗體生成細(xì)胞的影響

注：與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異*P＜0.05,**P＜0.01。

?

由表3可見(jiàn)，常輕膠囊中、高劑量可顯著提高小鼠的半數(shù)溶血值（p＜0.05及p＜0.01），常輕膠囊高劑量可顯著提高小鼠的抗體生成細(xì)胞能力（p＜0.05）。

2.4 常輕膠囊對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞功能的影響

表4 常輕膠囊對(duì)小鼠碳廓清、雞紅細(xì)胞吞噬功能的影響

表4 常輕膠囊對(duì)小鼠碳廓清、雞紅細(xì)胞吞噬功能的影響

注：與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異*P＜0.05,**P＜0.01。

?

由表4可見(jiàn)，常輕膠囊中、高劑量可顯著提高小鼠的碳廓清指數(shù)（p＜0.05），常輕膠囊高劑量可顯著提高小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力（p＜0.01）。

2.5 常輕膠囊對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

表5 常輕膠囊對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

表5 常輕膠囊對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

由表5可見(jiàn)，常輕膠囊對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性無(wú)影響（p＞0.05）。

?

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)條件下，我們發(fā)現(xiàn)常輕膠囊0.67，2.01g/ kg·BW可明顯增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及增強(qiáng)小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)，0.67，2.01g/kg·BW可提高小鼠的半數(shù)溶血值和高劑量能增加小鼠的抗體生成細(xì)胞, 2.01g/kg·BW可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。根據(jù)“保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”中的判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為某品牌常輕膠囊具有增強(qiáng)免疫力的功能。

黃芪多糖可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)的體液因子，具有增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫因子的產(chǎn)生[1]；大棗多糖可作為免疫促進(jìn)劑，能夠控制細(xì)胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與衰老；抑制抗體激活促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖作用[2,3]。枸杞多糖能夠明顯的提高吞噬細(xì)胞的功能，提高T淋巴細(xì)胞的增殖能力，增加血清IgG含量，增強(qiáng)補(bǔ)體活性等作用[4，5]。山楂水提取物能夠顯著增強(qiáng)體液免疫及細(xì)胞免疫的作用，具有增強(qiáng)補(bǔ)體活性，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的活性[6,7]。食用螞蟻含有多種藥用成分。據(jù)廣西中醫(yī)學(xué)院等檢測(cè)到，鼎突多刺蟻含有多種氨基酸，再加上蛋白質(zhì)水解的蛋氨酸，共種27氨基酸，其中多數(shù)為人體必需的氨基酸。

本研究評(píng)價(jià)了常輕膠囊增強(qiáng)免疫力的功能，結(jié)果表明其有一定的增強(qiáng)免疫力功能，適合免疫力低下人群食用以增強(qiáng)體質(zhì)，為其作為保健食品開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

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[2] 吳海霞,李娜,孫元琳.大棗多糖的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2009年06期.

[3] 張慶雷，林生、林勤保等.大棗多糖體外抗補(bǔ)體活性劑促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用[J].中藥藥理與臨床,1998，14(5)：19-22.

[4] 董進(jìn)文,胡慶和,高天順,趙迅霞.枸杞多糖的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,1998年05期.

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[6] 翁毅力.山楂的藥理作用[J].中國(guó)藥業(yè),2005年12期.

[7] 江愛(ài)龍,劉榮華,陳蘭英等.山楂藥理與臨床研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,18(2): 154-158.

（2017-04-11 收稿）