黃飛鴻， 朱林杰， 李迪迪， 于 婭， 瞿禮萍， 鄒文俊*， 吳建明（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都66000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000）

?

［藥 理］

生血寧片對環(huán)磷酰胺致貧血小鼠的作用及機(jī)制

黃飛鴻1， 朱林杰1， 李迪迪1， 于 婭1， 瞿禮萍1， 鄒文俊1*， 吳建明2*
（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都616000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000）

目的 考察生血寧片 （鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物）對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠的作用及其分子機(jī)制。方法 體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)正常小鼠及腹腔注射環(huán)磷酰胺小鼠的骨髓有核細(xì)胞 （BMC），不同劑量的生血寧片處理這些BMC，采用ATP生物發(fā)光法測定生血寧片對其BMC增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用腹腔注射環(huán)磷酰胺復(fù)制貧血模型，以低、中、高劑量的生血寧片進(jìn)行治療，給藥后第7、10、13天測定外周血白細(xì)胞 （WBC）、紅細(xì)胞 （RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積 （HCT）水平，第10天收集小鼠骨髓細(xì)胞，檢測其白介素 （Il3）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Gm-csf）、干細(xì)胞因子（Scf）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)顯示，生血寧片顯著提高兩類BMC的增殖率（P＜0.05，P＜0.01）；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，生血寧片500、353 mg/kg組可顯著升高小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT水平（P＜0.05，P＜0.01），生血寧片500、353、250 mg/kg組可顯著升高骨髓細(xì)胞Il3、Scf mRNA表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 生血寧片促進(jìn)Scf和Il3 mRNA的表達(dá)，從而緩解環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制。

生血寧片；骨髓抑制；環(huán)磷酰胺；貧血；mRNA表達(dá)；IL-3；SCF

生血寧片是以鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物為主要活性成分，用于治療缺鐵性貧血的五類中藥新藥。據(jù)臨床報(bào)道，本品聯(lián)用重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）治療腫瘤相關(guān)貧血可獲得良好的治療效果［1-2］。現(xiàn)有藥理學(xué)研究表明生血寧片具有促進(jìn)正常小鼠、失血性貧血大鼠、溶血性貧血小鼠骨髓造血的作用［3-4］，但未見其對骨髓抑制狀態(tài)下造血功能影響的報(bào)道。而放化療導(dǎo)致的骨髓抑制是腫瘤患者發(fā)生貧血的主要因素，生血寧片在臨床有著廣泛應(yīng)用，由此本研究為明確單用生血寧片在腫瘤相關(guān)貧血的治療價(jià)值，擬采用化療藥物環(huán)磷酰胺建立骨髓抑制性貧血模型，觀察生血寧片對骨髓抑制性貧血的治療作用，并從造血干細(xì)胞相關(guān)生長因子：白介素-3（Il3）、干細(xì)胞因子 （Scf）、及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Gm-csf）mRNA表達(dá)水平初步探討其分子機(jī)制，旨在為生血寧片的合理用藥提供一定科學(xué)依據(jù)與實(shí)驗(yàn)支撐。

1　材料

1.1動(dòng)物 KM小鼠，SPF級，體質(zhì)量（18～22 g），6～8周齡，雌雄各半，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-24。

1.2藥品 生血寧片及生血寧片原料藥 （鐵葉綠酸鈉及葉綠素衍生物，武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號 20150305）；重組人促紅素-β注射液（rhEPO，上海羅氏制藥有限公司分裝，批號H0791/01）；環(huán)磷酰胺 （江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號15071125）。

1.3儀器與試劑 多功能酶標(biāo)儀（美國Mo1ecu1ar Devices公司，型號SpectraMax M3）；熒光定量PCR儀（美國MJ Research公司，型號CFD-3220 Option 2）；血細(xì)胞分析儀 （邁瑞南京生物技術(shù)有限公司，型號BC-2900）；血細(xì)胞分析儀稀釋液（邁瑞南京生物技術(shù)有限公司，批號2015073004）；血細(xì)胞分析儀溶血?jiǎng)?（邁瑞南京生物技術(shù)有限公司，批號2015063008）；Fico11Paque Premium單核細(xì)胞分離液（美國GE hea1thcare公司，批號10055781）；RPMI 1640培養(yǎng)基 （美國Gibco公司，批號8115384）；Ce11Titer-G1oTM試劑盒（美國Promega公司，批號0000153673）；逆轉(zhuǎn)錄及qPCR試劑盒均購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Il3、Scf、Gm-csf、Gapdh引物均自行設(shè)計(jì)，于Invitrogen（美國）英濰捷基上海貿(mào)易公司合成。

2　方法

2.1生血寧片對正常小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的影響 參考文獻(xiàn)方法［5］，取KM種小鼠10只，雌雄各半，脫頸椎處死，分離雙側(cè)股骨，剪去股骨一端，另一端插入1 mL注射器針頭，用無菌1640培養(yǎng)基沖洗骨髓至股骨發(fā)白，將收集的骨髓懸液轉(zhuǎn)至離心管，待其自然沉降后取上清，將細(xì)胞懸液定容至4 mL，輕輕沿離心管壁加入3 mL單核細(xì)胞分離液，400×g離心30 min，收集交界面乳白色層骨髓有核細(xì)胞 （BMC）細(xì)胞，無血清1640培養(yǎng)基洗滌3次，然后加入1640培養(yǎng)基 （含雙抗、10% FBS、10%馬血清）重懸，即得小鼠BMC懸液，計(jì)數(shù)并按4×105/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)體系為180μL；使用DMSO溶解生血寧片原料藥 （由武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責(zé)任公司提供）至1 g/L，臨用前用1640培養(yǎng)基稀釋，每孔加入生血寧片原料藥20μL，起始質(zhì)量濃度100μg/m L，3倍連續(xù)稀釋至1.23μg/mL；對照組加入20μL培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行對照孔。常規(guī)培養(yǎng)5 d，采用ATP生物發(fā)光法測定小鼠BMC增殖［6］，按Ce11Titer-G1oTM試劑盒使用說明操作，使用M3多功能酶標(biāo)儀檢測熒光信號，采用相對發(fā)光單位 （RLU）表示，通過RLU即可計(jì)算細(xì)胞增殖率，增殖率=（RLU生血寧片組-RLU對照組）/RLU對照組×100%。

2.2生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠BMC增殖的影響 取20只KM小鼠，雌雄各半，腹腔注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d［7］，為環(huán)磷酰胺處理組；另取6只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，為對照組，于第5天脫頸椎處死，按 “2.1”項(xiàng)方法分離與培養(yǎng)兩種小鼠BMC，按4×105/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)體系為180μL。環(huán)磷酰胺處理組小鼠BMC加入20μL生血寧片原料藥（按“2.1”項(xiàng)方法配制），根據(jù) “2.1”項(xiàng)測定結(jié)果調(diào)整初始質(zhì)量濃度為 60μg/mL，2倍連續(xù)稀釋至3.75μg/mL；加入20μL培養(yǎng)基設(shè)為環(huán)磷酰胺處理組；對照組小鼠BMC，加入20μL培養(yǎng)基設(shè)為對照組，每組設(shè)置3個(gè)平行對照孔，常規(guī)培養(yǎng)11 d，使用ATP生物發(fā)光法測定第3、5、7、9、11天的BMC增殖。

2.3生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠的影響

2.3.1分組與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，取84只SPF級KM小鼠，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組：對照組，模型組，rhEPO組，生血寧片500、353、250 mg/kg劑量組，分別相當(dāng)于臨床給藥等效劑量的2、1.4、1倍，每組14只 （每組預(yù)留2只，于給藥后10 d收集骨髓）。rhEPO組頸部皮下注射rhEPO 1 000 IU/kg，每2 d給藥1次，其余組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥13 d。

2.3.2造模與指標(biāo)檢測 給藥第0、2天，除對照組外其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg，給藥第6、9、12天，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，給藥容量為10 mL/kg；空白組注射等體積生理鹽水。分別于給藥后第7、10、13天，小鼠眼底靜脈叢取血20μL，使用血細(xì)胞分析儀檢測各組小鼠外周血白細(xì)胞 （WBC）、紅細(xì)胞 （RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積 （HCT）等指標(biāo)。第13天給藥1 h后，脫頸椎處死小鼠，取右側(cè)股骨，無菌1640培養(yǎng)基沖洗骨髓至股骨發(fā)白，移液器輕輕吹打，形成單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液，定容至1 mL，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.3.3qPCR測定骨髓細(xì)胞中Il3、Scf、Gm-csf mRNA的表達(dá) 給藥后第10天，根據(jù) “2.3.2”項(xiàng)方法收集骨髓細(xì)胞，Trizo1法常規(guī)提取總RNA，使用TransScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以Gapdh為內(nèi)參，進(jìn)行qPCR檢測。Il3引物：正向引物為5′-GCTCCCAGAACCTGAACT-3′，反向引物為5′-TCATTCGCAGATGTAGGC-3′，產(chǎn)物片段180 bp。Scf引物：正向引物為5′-CGGGAATCCTGTGACTGA-3′，反向引物為5′-CTCGGGACCTAATGTTGA-3′，產(chǎn)物片段430 bp。Gm-csf引物：正向引物為5′-TCCTGGGCATTGTGGTCT-3′，反向引物為5′-CCTGGGCTTCCTCATTTT-3′，產(chǎn)物片段415 bp。反應(yīng)條件均為：55℃，30 min（逆轉(zhuǎn)錄）；95℃、10 min，95℃，15 s，60℃、1 min（擴(kuò)增），40個(gè)循環(huán)，72℃，5 min最后延伸。以2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)為與對照組進(jìn)行比較后的相對值，對照組設(shè)為1。

3　結(jié)果

3.1生血寧片對正常小鼠BMC增殖的影響 與對照組相比，生血寧片原料藥33.3、11.1、3.7、1.23μg/mL對小鼠BMC的增殖率分別為32.01%、41.48%、26.50%、21.85%，相對發(fā)光單位值顯著高于對照組 （P＜0.05，P＜0.01），表明生血寧片原料藥具有促進(jìn)正常小鼠BMC增殖的作用。而生血寧片原料藥100μg/mL組對正常小鼠BMC表現(xiàn)出抑制作用，提示生血寧片質(zhì)量濃度太高可引起一定的增殖抑制作用。結(jié)果見表1。

表1　生血寧片對正常小鼠BMC增殖的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of Shengxuening Tablets on the proliferation of BMC in normalm ice（±s，n=3）

表1　生血寧片對正常小鼠BMC增殖的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of Shengxuening Tablets on the proliferation of BMC in normalm ice（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　　質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）　RLU　　　增殖率/ %對照組　　　—71 544.00±2 178.60　0生血寧片原料藥　　100.00　55 544.00±7 219.94　-22.36生血寧片原料藥　　33.30　94 445.33±5 869.39**　　32.01生血寧片原料藥　　11.10　101 225.33±16 640.03*　　41.48生血寧片原料藥　　3.70　90 504.00±6 699.23**　　26.50生血寧片原料藥　　1.23　87 182.67±1 634.28*21.85

3.2生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠BMC的影響 與對照組相比，自第3天起，環(huán)磷酰胺處理組BMC相對發(fā)光單位值逐漸降低，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞數(shù)目明顯減少。與環(huán)磷酰胺處理組相比，第7、9、11天，生血寧片原料藥60、30、15μg/m L能顯著升高環(huán)磷酰胺造模后小鼠骨髓細(xì)胞相對發(fā)光單位值 （P＜0.05，P＜0.01），提示生血寧片原料藥60、30、15μg/m L能促進(jìn)環(huán)磷酰胺造模后小鼠骨髓細(xì)胞增殖，結(jié)果見圖1；顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，環(huán)磷酰胺處理組BMC形態(tài)逐漸發(fā)生改變，第7、11天，生血寧片原料藥60μg/mL組，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且多為未發(fā)生形態(tài)變化的細(xì)胞，結(jié)果見圖2。

圖1　生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠BMC增殖的影響Fig.1 Effects of Shengxuening Tablets on the p roliferation of BMC in m yelosuppressive m ice induced by cyclophospham ide

圖2　生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠BMC增殖的影響 （200×）Fig.2 Effects of Shengxuening Tablets on the p roliferation of BMC in myelosuppressivem ice induced by cyclophospham ide（200×）

3.3生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠的影響

3.3.1生血寧片對骨髓抑制性貧血小鼠外周血常規(guī)的影響 與對照組相比，給藥后第10、13天，模型組小鼠WBC、RBC、HGB、HCT顯著降低（P＜0.01），提示貧血模型建立成功；給藥第10天，與模型組相比，生血寧片353、250 mg/kg組小鼠WBC數(shù)目顯著升高 （P＜0.05），給藥第10、13天，與模型組相比，生血寧片500、353 mg/kg組小鼠HGB、RBC、HCT數(shù)目顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），rhEPO組小鼠RBC、HGB、HCT數(shù)目顯著升高 （P＜0.01），提示生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠外周血象具有明顯改善作用，結(jié)果見表2。

3.3.2生血寧片對骨髓抑制性貧血小鼠BMC的影響 給藥后第13天，與對照組相比，模型組小鼠BMC數(shù)目顯著降低 （P＜0.05）；與模型組相比，生血寧片250 mg/kg組BMC數(shù)目顯著升高（P＜0.05），生血寧500、353 mg/kg組BMC數(shù)目表現(xiàn)出升高趨勢，結(jié)果見表3。

表2　生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠外周血常規(guī)的影響 （±s，n=12）Tab.2 Effects of Shengxuening Tablets on peripheral blood cell counts in myelosuppressive anem icm ice induced by cyclophospham ide（±s，n=12）

表2　生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠外周血常規(guī)的影響 （±s，n=12）Tab.2 Effects of Shengxuening Tablets on peripheral blood cell counts in myelosuppressive anem icm ice induced by cyclophospham ide（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表3　生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠BMC數(shù)目的影響 （±s，n=12）Tab.3 EffectsofShengxueningTabletsonBMCcountin myelosuppressiveanemicmiceinducedbycyclophosphamide（±s，n=12）

表3　生血寧片對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠BMC數(shù)目的影響 （±s，n=12）Tab.3 EffectsofShengxueningTabletsonBMCcountin myelosuppressiveanemicmiceinducedbycyclophosphamide（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別　　劑量/（mg·kg-1）　BMC/（×106·mL-1）對照組　-　1.97±0.35*模型組　-　1.35±0.32 rhEPO組　1000IU/kg　1.34±0.40生血寧片組　500　1.51±0.28生血寧片組　353　1.51±0.20生血寧片組　250　1.72±0.41*

3.3.3生血寧片對貧血小鼠骨髓中Il3、Scf、GmcsfmRNA表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組小鼠Il3mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，給藥10d，生血寧片500、353、250mg/kg組能升高小鼠Scf、Il3mRNA表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01），其中生血寧片500、353、250mg/kg組Il3mRNA的表達(dá)水平為模型組5、8、7倍，Scf mRNA的表達(dá)水平約為模型組2、6、3倍，Gm-csf mRNA的表達(dá)水平約為模型組1.2、1.8、1.2倍，結(jié)果見圖3。

圖3　生血寧片對環(huán)磷酰胺致貧血小鼠骨髓細(xì)胞中Gmcsf、Il3、ScfmRNA水平的影響Fig.3 EffectsofShengxueningTabletsonthemRNAexpressionsofGm-csf，Il3，Scfinanemicmiceinducedbycyclophosphamide

4　討論

腫瘤相關(guān)性貧血（cancerre1atedanemia，CRA）是惡性腫瘤常見的伴隨疾病之一，發(fā)病因素主要包括腫瘤病理因素 （如失血、溶血、骨髓受侵犯）與腫瘤治療因素 （如化療藥物作用、放射治療等）［8］，其中化療藥物會直接損傷骨髓造血功能引起貧血。文獻(xiàn)報(bào)道，2009年對435例腫瘤患者觀察發(fā)現(xiàn)化療第4周期后，貧血發(fā)生比例達(dá)到66.0%［8］；2012年中國CRA調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，7972例腫瘤患者中貧血發(fā)生率60.83%，而隨著化療周期延長，貧血發(fā)生率還將進(jìn)一步提升。由上觀之，化療藥物導(dǎo)致骨髓抑制是引發(fā)腫瘤相關(guān)性貧血的重要因素。

二十世紀(jì)初，醫(yī)學(xué)界已關(guān)注到葉綠素及其衍生物對貧血的治療作用［9-10］，研究發(fā)現(xiàn)鐵葉綠酸鈉由于其結(jié)構(gòu)與血紅素相近，能以內(nèi)吞的形式直接被十二指腸及小腸上段粘膜細(xì)胞吸收，發(fā)揮補(bǔ)鐵作用［11］，近年來葉綠素衍生物葉綠酸銅鈉也逐漸用于治療再生障礙性貧血［12］，此外，研究發(fā)現(xiàn)葉綠素衍生物能提高輻射小鼠骨髓造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞豐度［13］。而生血寧片以中藥蠶砂作為原料，常溫提取葉綠素，經(jīng)皂化、鐵代，形成其主要成分鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物。前期研究提示，生血寧片除補(bǔ)鐵作用外，還具有促進(jìn)正常小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞增殖的作用，因此推測生血寧片也可能通過干預(yù)化療患者的骨髓造血功能進(jìn)而治療腫瘤相關(guān)貧血。本研究在驗(yàn)證生血寧對正常小鼠BMC作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合體外和體內(nèi)環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血模型，觀察其對化療藥物導(dǎo)致骨髓抑制性貧血的治療作用，結(jié)果表明生血寧片能促進(jìn)骨髓抑制小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖，升高外周血WBC、RBC、HGB、HCT的作用，表明生血寧片具有促進(jìn)骨髓抑制性貧血小鼠造血功能的作用。

SCF、IL-3、GM-CSF屬于多譜系生長因子，SCF能促進(jìn)多能干細(xì)胞向三系髓樣干細(xì)胞和淋巴干細(xì)胞分化，IL-3、GM-CSF能促進(jìn)三系髓樣干細(xì)胞向定向祖細(xì)胞分化及定向祖細(xì)胞的進(jìn)一步增殖分化，最終形成成熟的粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板［14-16］。本研究為了確認(rèn)生血寧片能否通過促進(jìn)骨髓細(xì)胞中造血干細(xì)胞增殖，進(jìn)而發(fā)揮其升高外周血WBC、HGB、RBC、HCT的作用，采用熒光定量PCR對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制性貧血小鼠的骨髓細(xì)胞中Il3、Scf、Gm-csf mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生血寧片能促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞中Scf、Il3 mRNA的表達(dá)，提示生血寧片可能通過這種分子機(jī)制促進(jìn)骨髓抑制小鼠骨髓中造血干細(xì)胞向三系髓樣干細(xì)胞分化，進(jìn)而分化為成熟的紅細(xì)胞、白細(xì)胞，最終升高外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白數(shù)目。

綜上，生血寧片對化療藥物環(huán)磷酰胺導(dǎo)致骨髓抑制性貧血具有治療作用，其作用機(jī)制可能通過提升細(xì)胞生長因子Scf、Il3 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖、分化，從而緩解環(huán)磷酰胺引起的骨髓抑制，起到升高外周血細(xì)胞，改善化療引起的貧血作用。此外，本研究只在mRNA水平上進(jìn)行了研究，后續(xù)還將通過流式細(xì)胞技術(shù)及形態(tài)方法學(xué)進(jìn)一步分析骨髓中造血干細(xì)胞、紅系祖細(xì)胞、粒系祖細(xì)胞相對變化，深入研究生血寧片促進(jìn)骨髓造血功能的分子機(jī)制。

［1］程 輝，余 丹，張 婷，等.生血寧治療腫瘤相關(guān)性血細(xì)胞減少的臨床研究［J］.湖北中醫(yī)雜志，2008，30（1）：17-18.

［2］唐烽明，趙 棟，寧 佳，等.生血寧防治多發(fā)性骨髓瘤貧血 32例分析［J］.中國保健營養(yǎng)：臨床醫(yī)學(xué)學(xué)刊，2008，22（17）：34-35.

［3］陳云亮，錢伯初，王根才，等.生血寧片治療貧血模型鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7（1）：11-13.

［4］劉雪莉，陳 凱，史 紅，等.鐵葉綠酸鈉對正常小鼠祖細(xì)胞集落和實(shí)驗(yàn)性貧血的影響［J］.中華血液學(xué)雜志，1997，18（5）：234-236.

［5］Pierini M，Dozza B，Lucare11i E，et al.Efficient iso1ation and enrichment of mesenchyma1 stem ce11s from bone marrow［J］.Cytotherapy，2012，14（6）：686-693.

［6］高小平，吳建明，鄒文俊，等.地榆促造血作用的有效部位篩選［J］.中國天然藥物，2006，4（2）：137-140.

［7］Diaz-Montero C M，Wang Y，Shao L，et al.The g1utathione disu1fide mimetic NOV-002 inhibits cyc1ophosphamide-induced hematopoietic and immune suppression by reducing oxidative stress［J］.Free Radic BiolMed，2012，52（9）：1560-1568.

［8］馬 軍，王杰軍，張 力，等.腫瘤相關(guān)性貧血臨床實(shí)踐指南 （2015—2016版）［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2015，35（11）：921-930.

［9］胡龍勤，許德余.葉綠素衍生物在醫(yī)藥上的應(yīng)用［J］.世界臨床藥物，1987，8（3）：147-153.

［10］Kephart J C.Ch1orophy11 derivatives—Their chemistry，commercia1preparation and uses［J］.Econ Bot，1955，9（1）：3-38.

［11］耿麗娜，李亞永，于 鵬，等.血紅素鐵的腸鐵吸收及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2012，42（4）：269-276.

［12］王守軍，魏克民.葉綠素銅鈉鹽聯(lián)合中藥拆方對免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響［J］.中國中醫(yī)藥科技，2014，20（6）：618-619.

［13］Suryavanshi S，Sharma D，Checker R，et al.Ame1ioration of radiation induced hematopoietic syndrome by an antioxidant ch1orophy11in through increased stem ce11activity andmodu1ation of haematopoiesis［J］.Free Radic Biol Med，2015，85：56-70.

［14］Cop1ey M，Beer P，Eaves C.Hematopoietic stem ce11heterogeneity takes center stage［J］.Cell Stem Cell，2012，10（6）：690-697.

［15］Go1an David E，Tashjian Armen H，Armstrong Ehrin，等.藥理學(xué)原理：藥物治療學(xué)的病理生理基礎(chǔ)［M］.杜冠華，譯.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：793-807.

［16］Hattangadi SM，Wong P，Zhang L，et al.From stem ce11 to red ce11：regu1ation oferythropoiesis atmu1tip1e 1eve1s bymu1tip1e proteins，RNAs，and chromatin modifications［J］.Blood，2011，118（24）：6258-6268.

Effect of Shengxuening Tablets on m ice w ith cyclophospham ide-induced anem ia and itsmechanism

HUANG Fei-hong1， ZHU Lin-jie1， LI Di-di1， YU Ya1， QU Li-ping1， ZOU Wen-jun1*， WU Jian-ming2*

（1.School of Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 616000，China；2.School of Medicine，Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）

AIM To investigate the effectof Shengxuening Tab1ets（sodium iron ch1orophy11in，ch1orophy11derivatives）on mice with cyc1ophosphamide-induced anemia and itsmechanism of action.METHODS In vitro，the bone marrow mononeuc1ear ce11s（BMC）were iso1ated from the norma1mice and mye1osuppressive mice that have received intraperitonea1 injection of cyc1ophosphamide.BMC obtained were treated with the different dose of Shengxuening Tab1ets for e1even days.The pro1iferation of BMC wasmeasured by ATP bio1uminescence assay.In vivo，anemia was estab1ished by intraperitonea1 injection cyc1ophosphamide，the anemia mice was treated with the 1ow-，midd1e-，and high-dose of Shengxuening Tab1ets for thirteen days.On the 7th，10thand 13thday，the periphera1b1ood was co11ected from fundus venous p1exus to count WBC，RBC，HGB and HCT.On the 10thday，the bone marrows were co11ected to measure the mRNA expressions of Il3，Scf and Gm-csf by qPCR ana1ysis.RESULTS In vitro，Shengxuening Tab1ets cou1d significant1y improve the pro1iferation of the norma1mice BMC and that ofmye1osuppressivemice induced by cyc1ophosphamide（P＜0.05）.In vivo，the WBC，RBC，HGB and HCT in midd1e-，and high-dose of Shengxuening Tab1ets groups and themRNA expressions of Il3，Scf in 1ow-，midd1e-，and high-dose of Shengxuening Tab1ets groupswere significant1y increased，compared with those of themode1group（P＜0.05）.CONCLUSION Shengxuening Tab1ets can a11eviate cyc1ophosphamide-induced mye1osuppressive anemia in mice.Its therapeutic mechanism is possib1y re1ated to the improvement of the mRNA expressions of Il3 and Scf.

Shengxuening Tab1ets；mye1osuppressive；cyc1ophosphamide；anemia；mRNA expression；IL-3；SCF

R285.5

A

1001-1528（2016）06-1205-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.001

2015-12-30

黃飛鴻（1991—），男，碩士生，從事中藥臨床與應(yīng)用研究。E-mai1：hfhbest@gmai1.com

吳建明 （1981—），男，博士，副教授，從事藥物篩選及分子藥理研究。Te1：（0830）3162291，E-mai1：wjmbj@126.com鄒文俊 （1966—），女，博士，教授，從事中藥臨床與應(yīng)用研究。Te1：（028）82855465，E-mai1：zouwenjun@vip. 163.com