趙 卿， 張 鵬， 白 宇， 張利軍， 侯郁青， 蔡定芳（.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海0006；.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海0006；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海0003；4.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，上海0003）

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松果菊苷通過(guò)調(diào)控GFRα1/AKT信號(hào)通路抑制MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能細(xì)胞SH-SY5Y凋亡

趙 卿1， 張 鵬2， 白 宇1， 張利軍1， 侯郁青1， 蔡定芳3，4
（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海200062；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200032；4.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，上海200032）

目的 研究肉蓯蓉提取物松果菊苷（echinacoside）對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導(dǎo)帕金森病模型SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。方法 SH-SY5Y細(xì)胞分別接受磷酸緩沖溶液 （PBS）、MPP+和/或松果菊苷處理后，分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用Western b1ot結(jié)合免疫熒光法分析各處理組細(xì)胞內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族受體α1（GFRα1）及其下游抗凋亡AKT（蛋白激酶B）磷酸化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）水平變化，并觀察AKT抑制劑LY249002對(duì)松果菊苷對(duì)SH-SY5Y的保護(hù)功能的影響。結(jié)果 松果菊苷可以顯著緩解MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡［MPP+vs MPP+/松果菊苷，（25.12±4.33）%vs（5.13±1.51）%，P＜0.01］。松果菊苷可以抑制MPP+下調(diào)SHSY5Y細(xì)胞內(nèi)GFRα1表達(dá)和AKT磷酸化。進(jìn)一步的研究表明特異性阻斷AKT信號(hào)通路可以取消松果菊苷促進(jìn)SHSY5Y在MPP+誘導(dǎo)損傷下生存的功能，但不影響松果菊苷提高GFRα1的表達(dá)。對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性分析的結(jié)果顯示，松果菊苷可以抑制MPP+誘導(dǎo)Caspase-3的活化［MPP+vs MPP+/松果菊苷，（7.22±1.51）vs（1.81±0.42），P＜0.01］，但是這一作用可以被AKT抑制劑阻斷。結(jié)論 松果菊苷通過(guò)上調(diào)GFRα1/AKT通路抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞存活的功能。

松果菊苷；SH-SY5Y細(xì)胞；1-甲基-4-苯基吡啶 （MPP+）；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體α1（GFRα1）；GFRα1/AKT信號(hào)通路；凋亡

隨著我國(guó)老年人口的不斷增加，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率也逐年提高。帕金森病（Parkinson's disease，PD）發(fā)病率在神經(jīng)退行性疾病中占第二位［1］。PD患者中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元重要神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺合成和釋放都急劇下降［2］使病人出現(xiàn)少動(dòng)、震顫、強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。如何抑制多巴胺能神經(jīng)元的減少和增加腦內(nèi)多巴胺含有量是治療PD的主要方案，而與多巴胺替代治療相比，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元和減少多巴胺能神經(jīng)元的凋亡是更加根本性的治療［3］。但到目前為止，臨床上還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性保護(hù)大腦多巴胺能神經(jīng)元的治療藥物。松果菊苷（echinacoside，ECH）是傳統(tǒng)中藥肉蓯蓉中提取的主要活性糖苷，已有研究表明松果菊苷具有較強(qiáng)的抗自由基能力［4］。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明松果菊苷可抑制大鼠神經(jīng)元樣細(xì)胞PC12［5］、小腸內(nèi)皮細(xì)胞［6］和人神經(jīng)元樣細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞 （又稱神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）［7］的凋亡；本課題組前期體內(nèi)研究表明，松果菊苷可以緩解1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methy1-4-pheny1-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的小鼠的PD癥狀，抑制PD小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，并促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（g1ia1ce11-derived neurotrophic factor，GDNF）的表達(dá)［8-9］。SH-SY5Y細(xì)胞具有合成多巴胺和多巴胺受體的特征，1-甲基-4苯基吡啶離子（1-methy1-4-pheny1pyridiniumion，MPP+）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究PD發(fā)病的分子機(jī)制和藥效學(xué)評(píng)價(jià)［7，10-11］。另有研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷可以通過(guò)保護(hù)線粒體發(fā)揮抑制MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡［12］。為了進(jìn)一步揭示松果菊苷保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制，本研究以MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡為PD細(xì)胞模型，研究神經(jīng)細(xì)胞增殖和促存活調(diào)控關(guān)鍵受體—GDNF受體α1（GDNF receptorα1，GFRα1）和其下游信號(hào)通路中重要激酶AKT是否參與松果菊苷保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控。

1　材料與方法

1.1藥物和試劑 松果菊苷（純度大于98%）購(gòu)買(mǎi)自成都普思生物科技有限公司 （PS0004-0100，20 mg）；雙苯酰亞胺（Hoechst 33342）、多聚L-賴氨酸和碘化1-甲基-4苯基吡啶 （水溶液中解離成MPP+）從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買(mǎi)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清從美國(guó)Gibco公司購(gòu)買(mǎi)；AKT磷酸化抑制劑LY294002從美國(guó)Santa Cruz公司購(gòu)買(mǎi)；化學(xué)發(fā)光底物從蘇州康為世紀(jì)公司購(gòu)買(mǎi)；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒從碧云天生物技術(shù)研究所購(gòu)買(mǎi)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和處理 SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞被培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)含飽和水氣和5%CO2。MPP+在使用前用滅菌水配制，松果菊苷被溶于滅菌的磷酸緩沖溶液 （PBS）溶液里。加藥處理前，細(xì)胞被種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×105，培養(yǎng)24 h后，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收樣。細(xì)胞用RIPA裂解液（購(gòu)買(mǎi)自上海多彩生物科技有限公司）裂解后用Western b1ot分析AKT磷酸化水平和GFRα1水平。

1.3細(xì)胞活力分析 細(xì)胞被種到24孔培養(yǎng)板中，每孔8×104，24 h后分別給與1 mmo1/L MPP+、40μg/mL的松果菊苷或40μg/mL松果菊苷+ 1 mmo1/L MPP+、PBS作為對(duì)照。在研究松果菊苷調(diào)控AKT磷酸化與SH-SY5Y細(xì)胞凋亡關(guān)系時(shí)，細(xì)胞藥物處理中全部加入1 mmo1/L的MPP+，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入40μg/mL松果菊苷、40μg/mL松果菊苷+20μmo1/L LY490002，空白對(duì)照僅加PBS對(duì)照，無(wú)任何藥物處理。所有細(xì)胞活力分析，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。

1.4Western b1ot分析 Western b1ot用常規(guī)方法，具體見(jiàn)參考文獻(xiàn) ［13］。兔抗AKT抗體、兔抗磷酸化AKT S473抗體和兔抗GFRα1抗體從美國(guó)CST公司購(gòu)買(mǎi)，按照1∶1 000稀釋倍數(shù)用于雜交轉(zhuǎn)印后的PVDF膜（購(gòu)自美國(guó)Pa11公司）。小鼠抗β-Actin單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz）按照1∶3 000稀釋倍數(shù)雜交轉(zhuǎn)印后的PVDF膜。HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG和HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG（購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research Laboratories）按照1∶10 000稀釋倍數(shù)用于Western b1ot。顯色采用化學(xué)發(fā)光的方法，用天能化學(xué)發(fā)光成像儀 （上海天能）采集和分析圖像。

1.5免疫熒光分析 細(xì)胞種到用多聚賴氨酸包被過(guò)的蓋玻片上，培養(yǎng)過(guò)夜，加入不同的藥物處理24 h后，用冷甲醇固定。小鼠抗α-Tubu1in單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）和兔抗GFRα1抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司）都按照1∶1 000稀釋到一抗稀釋液 （購(gòu)自上海多彩生物科技有限公司）中使用。具體方法按照抗體說(shuō)明書(shū)操作。二抗分別使用FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和A1ex565標(biāo)記的羊抗兔IgG（購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Life Techno1ogies公司），1∶2 000稀釋后使用，使用方法參照二抗說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞核用5μg/m L的Hoechst 33342室溫染色5 min，PBS洗滌4次后，用甘油封片。細(xì)胞爬片用萊卡SP8激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司制造）觀察和拍照。

1.6TUNEL標(biāo)記細(xì)胞凋亡分析 細(xì)胞爬片制備和藥物處理和免疫熒光相同。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、40μg/m L松果菊苷、1 mmo1/L MPP+、MPP+/松果菊苷組。細(xì)胞處理24 h后，用冷PBS洗滌2次后，冷甲醇固定。根據(jù)Tune1試劑盒 （羅氏診斷公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)果用尼康熒光顯微鏡（NIKON，日本）拍照，每個(gè)爬片選取不連續(xù)的5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.7Caspase-3活性分析 細(xì)胞被種到6孔培養(yǎng)板中，每孔5×105，24 h后分別給與1 mmo1/L MPP+、40μg/mL的松果菊苷或40μg/m L松果菊苷+1 mmo1/LMPP+，PBS作為對(duì)照。在研究松果菊苷調(diào)控AKT磷酸化與SH-SY5Y細(xì)胞凋亡關(guān)系時(shí)，細(xì)胞藥物處理中全部加入1 mmo1/L的MPP+，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入 40μg/m L松果菊苷、40μg/m L松果菊苷+20μmo1/L LY490002，空白對(duì)照僅加PBS對(duì)照，無(wú)任何藥物處理。細(xì)胞加藥后24 h，用Caspase-3試劑盒的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，并定量蛋白后，按照說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8結(jié)果統(tǒng)計(jì) 所有Western b1ot結(jié)果用天能圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，并以內(nèi)參蛋白作為對(duì)照，結(jié)果為目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度的比值。磷酸化水平表示為以磷酸化信號(hào)與總蛋白信號(hào)的比值。數(shù)據(jù)處理用微軟EXCEL完成，并使用學(xué)生氏t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果

2.1松果菊苷減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)SH-SY5Y的凋亡

已有多個(gè)研究表明MPP+可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，本研究中通過(guò)SH-SY5Y生長(zhǎng)曲線顯示，MPP+也顯著抑制了SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)，處理3 d時(shí)抑制率為80.4% （圖1A～B），并明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖1C～D）。單獨(dú)加入松果菊苷對(duì)SHSY5Y細(xì)胞的正常生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響，但是對(duì)于存在MPP+時(shí)，松果菊苷可以顯著的減少SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，保護(hù)了SH-SY5Y細(xì)胞和恢復(fù)了在MPP+存在時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng) （圖1A）。細(xì)胞的形態(tài)顯示松果菊苷保護(hù)了細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞凋亡（圖1B）。采用TUNEL標(biāo)記法分析凋亡細(xì)胞水平顯示，MPP+顯著地誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡［MPP+處理組vs對(duì)照組，（25.12±4.33）%vs（3.01±0.51）%，P＜0.01］。而且松果菊苷可以顯著的降低凋亡細(xì)胞比例（MPP+vs MPP+/松果菊苷，（25.12±4.33）%vs（5.13±1.51）%，P＜0.01）。這些結(jié)果表明松果菊苷可以的保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞，抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖1C～D）。

2.2松果菊苷抑制MPP+誘導(dǎo)的GFRα1水平下降和AKT磷酸化水平的降低 AKT作為GDNF/ GFRα1信號(hào)通路下游的重要蛋白磷酸化激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凋亡方面發(fā)揮重要的調(diào)控功能。因此，本研究調(diào)查MPP+是否也調(diào)控了SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的GFRα1水平，結(jié)果顯示，MPP+下調(diào)了GFRα1水平，同時(shí)，MPP+也可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的AKT磷酸化水平 （圖2）。松果菊苷處理可以有效地抑制MPP+的這一功能，部分恢復(fù)由于MPP+導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞中GFRα1水平下降和AKT磷酸水平降低 （圖2）。這個(gè)結(jié)果和GFRα1的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果相一致。松果菊苷可以部分恢復(fù)SH-SY5Y細(xì)胞在MPP+存在的條件下GFRα1的表達(dá) （圖3）。

圖1　松果菊苷保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞和抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fig.1 ECH protects cells against cell apop tosis induced by MPP+

圖2　W estern blot分析松果菊苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GFRα1水平和AKT磷酸化水平變化的影響Fig.2 Effects of ECH on changes of GFRα1 and phosphorylated AKT regulated by M PP+in SH-SY5Y cells

圖3　共聚焦分析松果菊苷逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中GFRα1水平下降 （×630）Fig.3 ECH recovers GFRα1 expression in SH-SY5Y cells during MPP+treatment（×630）

2.3AKT磷酸化水平影響松果菊苷保護(hù)SH-SY5Y效果 考慮到AKT在GDNF/GFRα1信號(hào)通路中的重要地位，本研究進(jìn)一步調(diào)查了AKT磷酸化在松果菊苷發(fā)揮抗神經(jīng)元樣細(xì)胞凋亡功能中的作用。結(jié)果顯示，給予AKT磷酸化抑制劑LY294002可以有效的阻斷松果菊苷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)功能（圖4A）。Western b1ot結(jié)果顯示，LY294002有效的抑制AKT的磷酸化，對(duì)GFRα1表達(dá)沒(méi)有明顯的影響（圖4B～C）。

2.4松果菊苷抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活化 為了進(jìn)一步研究松果菊苷抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，本研究檢測(cè)了松果菊苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要細(xì)胞凋亡調(diào)控Caspase-3的活性。結(jié)果顯示，松果菊苷顯著地抑制了MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性增加（MPP+vs MPP+/松果菊苷是7.22±1.51 vs 1.81±0.42，P＜0.01）。此外，抑制AKT的磷酸化可以取消松果菊苷的上述作用。這些結(jié)果和松果菊苷保護(hù)SH-SY5Y結(jié)果相一致。見(jiàn)圖5。

圖4　AKT抑制劑阻斷松果菊苷保護(hù)SH-SY5Y功能Fig.4 AKT inhibitor blocks ECH function of protecting SH-SY5Y cells apoptosis induced by M PP+

3　討論

PD作為世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病和衰老具有重要的相關(guān)性。組織和分子病理研究顯示，GDNF水平的下降和多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制在PD的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［14-16］。其直接的病理表現(xiàn)為α-突觸核蛋白（α-synuc1ein）聚集，形成路易氏小體，多巴胺能神經(jīng)元的功能逐漸喪失和凋亡［1］。最新的研究表明，當(dāng)GDNF/Ret通路被阻斷后，GDNF/GFRα1可以發(fā)揮與GDNF/Ret相同的對(duì)多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)的保護(hù)功能［17］。此外，更多的研究也證明了GFRα1相對(duì)于其他GDNF的受體，對(duì)于多巴胺能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化和增殖發(fā)揮了更重要的調(diào)控功能［18-19］。祖國(guó)醫(yī)學(xué)早在 《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已經(jīng)出現(xiàn)了震顫類(lèi)疾病的記載，其發(fā)病機(jī)制多與“肝腎不足、陰虛風(fēng)動(dòng)”有關(guān)。臨床中使用 “補(bǔ)腎養(yǎng)肝”方藥治療帕金森病患者能明顯延緩癥狀的加重［20］，其中具有代表性的中藥肉蓯蓉素有 “沙漠人參”之美譽(yù)，具有極高的藥用價(jià)值，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材。肉蓯蓉味甘、性溫，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、填精補(bǔ)髓、養(yǎng)血潤(rùn)燥等功效。松果菊苷是其主要活性成分之一。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明松果菊苷能上調(diào)PD小鼠模型中腦組織GDNF表達(dá)，本研究借助細(xì)胞模型深入探討松果菊苷對(duì)GDNF相關(guān)受體和信號(hào)通路的調(diào)控。本研究中觀察到的松果菊苷可以提高SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)GFRα1，并對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致。最近研究已經(jīng)證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路作為GDNF/GFRα1通路的下游，參與GFRα1多種生物學(xué)功能的調(diào)控，尤其是促增殖與抗凋亡［21-22］。MPP+可以通過(guò)抑制AKT磷酸化來(lái)發(fā)揮誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的功能［23］。本研究結(jié)果顯示了在SH-SY5Y細(xì)胞里，MPP+不僅抑制AKT的磷酸化，同時(shí)還下調(diào)了GFRα1的表達(dá)（圖2）。松果菊苷可以顯著的逆轉(zhuǎn)MPP+抑制AKT磷酸化與GFRα1表達(dá)的功能。但通過(guò)使用AKT抑制劑阻斷AKT磷酸化后，松果菊苷雖然仍然可以提高GFRα1的表達(dá)，但其促進(jìn)SH-SY5Y存活的功能并沒(méi)有恢復(fù) （圖4）。這些結(jié)果表明，AKT的磷酸化是松果菊苷保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞、抑制MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控激酶。綜合結(jié)果，本研究揭示了松果菊苷保護(hù)SH-SY5Y一個(gè)新的分子機(jī)制 （圖5B），即通過(guò)上調(diào)GFRα1表達(dá)來(lái)激活A(yù)KT來(lái)實(shí)現(xiàn)松果菊苷對(duì)SHSY5Y細(xì)胞的保護(hù)，AKT信號(hào)通路處于松果菊苷發(fā)揮保護(hù)功能的關(guān)鍵地位。

致謝 感謝上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院袁運(yùn)生博士在細(xì)胞培養(yǎng)和其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面提供的幫助。

圖5　松果菊苷通過(guò)AKT通路抑制MPP+誘導(dǎo)的Caspase-3活化和調(diào)控SH-SY5Y細(xì)胞凋亡Fig.5 ECH inhibits Caspase-3 activation and cell apoptosis induced by M PP+in SH-SY5Y cells

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Echinacoside inhibits apoptosis of SH-SY5Y cell through GFRα1/AKT pathway

ZHAO Qing1， ZHANG Peng2， BAIYu1， ZHANG Li-jun1， HOU Yu-qing1， CAIDing-fang3，4

（1.Department of Neurology，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；2.Central Laboratory，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；3.Department of Integrative Medicine，Zhongs-

han Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China；4.Institute of Integrative Medicine，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China）

AIM To study the protective effects of echinacoside，extracted from Cistanches Herba，on 1-methy1-4-pheny1pyridiniumion（MPP+）-induced SH-SY5Y ce11s of Parkinson's disease mode1.M ETHODS After SH-SY5Y ce11s were treated with phosphate buffer sa1ine（PBS），40μg/mL echinacoside，1 mmo1/L MPP+，and/or both of echinacoside and MPP+，ce11pro1iferation was detected，and GFRα1，phosphory1ated AKTmo1ecu1e（protein kinase B）aswe11as Caspase-3 protein 1eve1were ana1yzed byWestern b1ot and immunof1uorescence. Echinacoside's protective effects were a1so eva1uated when AKT phosphory1ation was b1ocked by an AKT specific inhibitor，LY49002.RESULTS Echinacoside significant1y decreased ce11 apoptosis induced by MPP+in SHSY5Y ce11s［MPP+vs MPP+/echinacoside，（25.12±4.33）%vs（5.13±1.51）%，P＜0.01］.Data indicated that echinacoside cou1d up-regu1ate the expression of GFRα1，a critica1pro-surviva1 receptor，and improve AKT phosphory1ation after SH-SY5Y ce11swere exposed to MPP+.Further study suggested that LY49002 cou1d abrogate echinacoside's function of improving ce11surviva1butnotaffecting its effectof increasing GFRα1.Echinacoside a1-so cou1d inhibit Caspase-3 activation induced by MPP+in SH-SY5Y［MPP+vs MPP+/ECH，（7.22±1.51）vs（1.81±0.42），P＜0.01］.But its function depended on AKT activation.CONCLUSION In summary，our data strong1y support that echinacoside protects ce11 against MPP+-induced apoptosis through GFRα1/AKT signa1 pathway in SH-SY5Y ce11s.

echinacoside；SH-SY5Y ce11；MPP+（1-methy1-4-pheny1pyridiniumion）；g1ia1 ce11-derived neurotrophic factor fami1y receptorα1（GFRα1）；GFRα1/AKT singa1pathway；apoptosis

R966

A

1001-1528（2016）06-1225-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.005

2015-12-04

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 （81202814）；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年課題 （20124y116）

趙 卿 （1978—），博士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科相關(guān)疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。Te1：（021）22233222-58082，E-mai1：qingzhao2010@hotmai1.com