馬 志， 孟慶海， 蒯美玉， 林 超， 張亞云， 孫 鑫， 姚 遠(yuǎn)， 張啟春，2， 卞慧敏，2*（.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京20023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京20023）

?

桑酮堿對(duì)2型糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

馬 志1， 孟慶海1， 蒯美玉1， 林 超1， 張亞云1， 孫 鑫1， 姚 遠(yuǎn)1， 張啟春1，2， 卞慧敏1，2*
（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023）

目的 觀察桑酮堿 （桑葉總黃酮和總生物堿）對(duì)2型糖尿病腎病大鼠的腎功能和腎TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響。方法 以高脂聯(lián)合鏈脲佐菌素復(fù)制2型糖尿病腎病大鼠模型，成模后分為模型組，二甲雙胍組，桑酮堿低、中、高劑量組，另設(shè)正常空白組10只。灌胃給藥，12周后測(cè)定各組大鼠空腹血糖及24 h尿量，尿液中白蛋白、肌酐的含有量；取血測(cè)定血清肌酐、尿素氮，并計(jì)算肌酐清除率；HE染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)的變化；Western bo1t方法測(cè)定TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、IV型膠原（CoIV）、E鈣黏蛋白（E-Ca）的蛋白表達(dá)水平；rea1 time PCR方法檢測(cè)Tgfb1、CoIV和E-Ca的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 桑酮堿給藥組能夠顯著降低糖尿病腎病大鼠空腹血糖、24 h尿量、尿白蛋白含有量及肌酐清除率，改善腎臟組織病理?yè)p傷，下調(diào)TGF-β1、p-Smad2/3、CoIV的表達(dá)，上調(diào)E-Ca表達(dá)。結(jié)論 桑酮堿能延緩2型糖尿病大鼠早期腎病并發(fā)癥的發(fā)生，其機(jī)制與調(diào)節(jié)腎臟TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。

桑酮堿；糖尿病腎病；腎小球?yàn)V過(guò)率；TGF-β1/Smad通路

糖尿病的發(fā)病率逐年升高，特別是2型糖尿病，占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%以上，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的健康［1］。糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，已成為導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因［2］。長(zhǎng)期的慢性高血糖和血脂代謝障礙導(dǎo)致腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常，加速腎功能損害和功能障礙，在糖尿病腎病早期其臨床表現(xiàn)為超濾。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在DN中被認(rèn)為是關(guān)鍵性因子［3］。前期研究表明桑酮堿不僅能夠抑制葡萄糖及多糖的腸吸收，還有增加胰島素敏感性，改善脂肪代謝等作用［4］。本研究則利用2型糖尿病腎病大鼠模型探討桑酮堿的防治作用及其對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響。

1　材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Daw1ey大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證編號(hào)：11400700025240。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0042。

1.2藥物和試劑 桑酮堿 （鎮(zhèn)江吉貝爾藥業(yè)有限公司，批號(hào)141119）。桑酮堿是由桑葉中總黃酮和總生物堿按6∶1的比例配比而成。總黃酮以綠原酸為對(duì)照，比色法測(cè)定含有量為50.4% （主要是綠原酸及其異構(gòu)體，其中還含少量蘆丁與異槲皮苷）?？偵飰A中以1-脫氧野尻霉素、蕎麥堿、表蕎麥堿總和計(jì)50.6%。二甲雙胍 （北京中惠藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130804）；葡萄糖試劑盒 （批號(hào)20130402147）、尿素氮試劑盒 （批號(hào)20140415）、白蛋白試劑盒 （批號(hào)20140427）、肌酐試劑盒 （批號(hào)20140404），均由南京建成生物研究所提供；水合氯醛 （南京寧試化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20131123）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒 （上海依科賽生物制品有限公司，批號(hào)IM000-C021）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)1001270674）；TGF-β1抗體、CoⅣ抗體、Smad2/3抗體、p-Smad2/3抗體、E-Ca抗體均由美國(guó)Santa Cruze公司提供；二抗羊抗兔IgG-HRP（EnoGene公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)#K1622）；Trizo1（美國(guó)Ambion公司，RET：15596026）；SYBE GREEN（德國(guó)Qiagen公司，Cat.NO.204054）；焦碳酸二乙酯水（BIO LINK，BL1005）。

1.3儀器 低速自動(dòng)平衡離心機(jī) （北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；BioTek酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；ULT1386-5-V42超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific［Ashevi11e］LLC）；164-5051 Western電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；5417R高速冷凍離心機(jī) （德國(guó)Eppendof公司）；梯度熱循環(huán)儀 （美國(guó)App1ied Biosystems）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2　方法

2.1動(dòng)物模型復(fù)制、分組及給藥 將SD雄性大鼠150只隨機(jī)分為對(duì)照組10只、高脂飲食組 （140只）。高脂飲食組給予高脂飼料 （配方：10%豬油，20%糖，2.5%蛋黃，67.5%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)，空白組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，8周后高脂飲食組大鼠一次性腹腔注射STZ（劑量為35 mg/kg）。模型組大鼠出現(xiàn)多尿癥狀后測(cè)定血糖，取血糖值＞16.7 mmo1/L的大鼠為成模大鼠。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性對(duì)照二甲雙胍180 mg/kg組，桑酮堿73.5、147、294 mg/kg 3個(gè)劑量組，每組20只共100只，實(shí)驗(yàn)中死亡大鼠不納入統(tǒng)計(jì)。每日一次灌胃給藥，連續(xù)12周，模型組和空白組灌胃等容積的水。

2.2標(biāo)本收集 灌胃給藥12周后，代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量，3 000 r/10 min取上清測(cè)量尿液中尿素氮、肌酐、白蛋白的含有量。末次給藥后，動(dòng)物禁食不禁水過(guò)夜，水合氯醛麻醉，頸總動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min取血清測(cè)定葡萄糖、肌酐、尿素氮；切取左側(cè)腎皮質(zhì)稱重，用于Western b1ot及rea1 time PCR檢測(cè)，剩余腎臟置于10%中性甲醛中固定用于病理檢查。

2.3腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 10%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)脫水、包埋、4μm切片，分別行蘇木素伊紅染色 （HE染色）。光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變情況。根據(jù)病變程度分為0級(jí)無(wú)病變“-”，一級(jí)輕度 “+”，二級(jí)中度 “++”和三級(jí)重度 “+++”，評(píng)分分別記為0、1、2、3分。

2.4Western bo1t 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，提取腎臟皮質(zhì)蛋白，每組3個(gè)樣本，BCA微量蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品50μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗4℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

2.5Rea1 time PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) Trizo1提取腎臟皮質(zhì)總mRNA，每組6個(gè)樣本，鑒定其濃度及純度 （A260/A280介于1.8～2.2之間為最佳）。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成250 ng/μL cDNA。利用SYBR GREEN檢測(cè)目的基因的表達(dá)。擴(kuò)增條件：預(yù)變性，95℃，10min，共一個(gè)循環(huán)；變性15 s，退火30 s，延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)；溶解程序，60℃，81個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer information

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，結(jié)果以±s表示，P＜0.05為有顯著差異。

3　結(jié)果

3.1桑酮堿對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、24 h尿量、血清肌酐、尿肌酐、和肌酐清除率、尿白蛋白、血清尿素氮的影響 給藥前，模型組血糖明顯升高（P＜0.01），給藥組與模型組間血糖無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。給藥12周后，模型大鼠血糖、尿白蛋白、尿素氮、24 h尿量、血清肌酐、尿肌酐、肌酐清除率明顯升高，與空白組比較，差異有高度顯著性 （P＜0.01）；各給藥組均能降低模型大鼠的血糖、24 h尿量、尿白蛋白、尿肌酐、血清肌酐和肌酐清除率，與模型組相比，差異均有高度顯著性 （P＜0.01）見(jiàn)表2～3。

表2　桑酮堿對(duì)給藥12周后DN大鼠血糖、尿白蛋白和血清尿素氮的影響 （±s）Tab.2 Effects of Sangtongjian m ixture on fasting blood glucose，urinary album in and BUN of serum in DN rats after 12 weeks（±s）

表2　桑酮堿對(duì)給藥12周后DN大鼠血糖、尿白蛋白和血清尿素氮的影響 （±s）Tab.2 Effects of Sangtongjian m ixture on fasting blood glucose，urinary album in and BUN of serum in DN rats after 12 weeks（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01

?

表3　桑酮堿給藥12周后對(duì)DN大鼠24 h尿量、血肌酐，尿肌酐和肌酐清除率的影響 （±s）Tab.3 Effects of Sangtongjian m ixture on 24 h urine volume，serum creatinine，urine creatinine and creatinine clearance in DN rats（±s）

表3　桑酮堿給藥12周后對(duì)DN大鼠24 h尿量、血肌酐，尿肌酐和肌酐清除率的影響 （±s）Tab.3 Effects of Sangtongjian m ixture on 24 h urine volume，serum creatinine，urine creatinine and creatinine clearance in DN rats（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01

?

3.2桑酮堿對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化的影響 HE染色顯示，正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)腎小球肥大，腎小球基底膜系膜基質(zhì)未見(jiàn)明顯異常改變，腎小管結(jié)構(gòu)完整；模型組可見(jiàn)腎小球系膜及基底膜顯著增厚，與空白組比較有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。桑酮堿組病理改變程度明顯減輕，腎小球基底膜增厚程度顯著改善，腎小球系膜基質(zhì)增生程度減輕，與模型組比較，有顯著性差異 （P＜0.05，P＜0.01），如圖1，病理評(píng)分見(jiàn)表4。

圖1　桑酮堿對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響 （HE，×400）Fig.1 Effects of Sangtongjian m ixture on pathomorphology in kidney of DN rats（HE，×400）

表4　桑酮堿對(duì)DN大鼠腎臟病理評(píng)分的影響（±s，分）Tab.4 Effects of Sangtongjian m ixture on the grade of renal pathology in DN rats（±s，score）

表4　桑酮堿對(duì)DN大鼠腎臟病理評(píng)分的影響（±s，分）Tab.4 Effects of Sangtongjian m ixture on the grade of renal pathology in DN rats（±s，score）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　n　　　劑量/（mg·kg-1）系膜及基底膜增生腎小管變性壞死空白組　　10　　-　　0.00±0.00**　　0.00±0.00**模型組　　12　　-　　1.33±0.49　　2.33±0.49二甲雙胍組　　14　　180　　0.50±0.52**　　1.50±0.52**桑酮堿組　　12　　73.5　　0.92±0.29*　　1.92±0.29*桑酮堿組　　13　　147　　0.92±0.28*　　1.92±0.28*桑酮堿組　　12　　294　　0.50±0.52**　　1.50±0.52**

3.3桑酮堿對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 根據(jù)Western bo1t結(jié)果顯示，12周后模型大鼠腎臟的TGF-β1、CoⅣ、p-Smad2/3的表達(dá)升高，E-Ca表達(dá)明顯降低。桑酮堿給藥后能夠不同程度的降低TGF-β1、CoⅣ、p-Smad2/3的蛋白表達(dá)，提高E-Ca的蛋白表達(dá)，與模型組比較，有顯著性差異 （P＜0.05，P＜0.01），如圖2。

圖2　桑酮堿對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟TGF-β1、Smad、CoⅣ、E-Ca蛋白表達(dá)的影響（n=3）Fig.2 Expression of Sangtongjian m ixture on TGF-β1/Smad signal pathway and E-Ca，CoⅣprotein in renal of DN rats（n=3）

3.4桑酮堿對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟Tgfb1、CoIV和E-Ca mRNA表達(dá)的影響 Rea1 time PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟Tgfb1、CoIV的mRNA水平顯著升高，E-Ca的mRNA水平顯著降低，與空白組比較，有顯著性差異 （P＜0.05）。桑酮堿給藥組能夠不同程度的降低Tgfb1、CoIV的mRNA水平，提高E-Ca的mRNA水平，與模型組比較有顯著性（P＜0.05），如圖3。

圖3　桑酮堿對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟Tgfb1、E-Ca、CoIV m RNA的表達(dá)（n=6）Fig.3 Expression of Sangtongjian m ixture on Tgfb1，E-Ca and CoIV mRNA in renal of DN rats（n=6）

4　討論

用高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ復(fù)制糖尿病大鼠模型，是應(yīng)用最為廣泛的糖尿病動(dòng)物模型，再經(jīng)12周后逐步發(fā)展成腎病并發(fā)癥。該方法復(fù)制的糖尿病腎病大鼠模型與人類早期腎病的改變十分相似，如濾過(guò)率升高和蛋白尿增多，腎小球基底膜超微結(jié)構(gòu)的改變以及腎小球系膜擴(kuò)張［5］。在DN早期，除腎小球結(jié)構(gòu)改變之外，更為顯著的是近端小管增生［6］，小管增生后加強(qiáng)重吸收，通過(guò)小管反饋使腎小球?yàn)V過(guò)率升高［7］。因此，在DN早期腎小球清除率升高，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即模型組大鼠與空白組比較肌酐清除率顯著升高。

研究表明，桑葉中含黃酮類，生物堿類，多糖和酚類化合物等，均具有不同程度的降糖作用［8］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑酮堿能夠顯著降低DN大鼠血糖，進(jìn)一步減輕由高糖導(dǎo)致的超濾，顯著降低肌酐清除率即腎小球?yàn)V過(guò)率，改善腎小球基底膜、系膜增生以及腎小管變性壞死情況，減輕大鼠腎臟代償作用，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。桑酮堿改善腎功能的作用與桑葉總生物堿中的特有成分1-脫氧野尻霉素有關(guān)，已有文獻(xiàn)報(bào)道1-脫氧野尻霉素能夠改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠的空腹和餐后血糖，改善受損的腎功能［9］。桑葉中的總黃酮有良好的降糖和抗氧化作用，還能夠激活肝臟中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPAR-γ和PPAR-α提高胰島素敏感性［10］。桑酮堿中黃酮與生物堿發(fā)揮多靶點(diǎn)多效應(yīng)的作用，通過(guò)降低2型糖尿病大鼠血糖，進(jìn)一步改善其腎功能。

小管間質(zhì)纖維化是推動(dòng)糖尿病腎病進(jìn)程的主要因素之一［11-12］。在糖尿病腎病的狀態(tài)下發(fā)生的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithe1ia1-mesenchyma1 transition，EMT）是小管間質(zhì)纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)。在EMT過(guò)程中發(fā)生上皮細(xì)胞黏附分子如E-Ca蛋白的缺失，細(xì)胞失去黏附性，細(xì)胞骨架重塑并且發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管基底膜的破壞［13］。目前已經(jīng)證實(shí)抑制TGF-β1的表達(dá)能夠延緩DN的病程［14］。在DN中，通過(guò)TGF-β1激活Smad信號(hào)通路參與腎臟纖維化，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)膠原沉積，降低細(xì)胞黏附分子鈣黏蛋白E（E-Ca）水平［15-16］。TGF-β1也能夠通過(guò)Smad3和Smad2調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞肥大、足細(xì)胞凋亡，加速腎小球硬化，加重由糖尿病以及其他原因?qū)е碌哪I臟疾?。?7-18］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的腎臟TGF-β1、p-Smad2/ 3、CoⅣ的表達(dá)水平升高，E-Ca的表達(dá)水平降低。在給予桑酮堿后，能夠不同程度的調(diào)節(jié)小管間質(zhì)纖維化，改善腎小球系膜及基底膜增生的情況，與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路關(guān)系密切。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了桑酮堿能夠改善早期DN大鼠腎功能，其機(jī)制與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。桑酮堿對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病及腎病并發(fā)癥保護(hù)作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

［1］Wi1d S，Rog1ic G，Green A，etal.G1oba1preva1ence of diabetes：estimates for the year 2000 and projections for 2030［J］. Diabetes Care，2004，27（5）：1047-1053.

［2］Forbes JM，Cooper M E.Mechanisms of diabetic comp1ications［J］.Physiol Rev，2013，93（1）：137-188.

［3］Sharma K，Ziyadeh F N.Hyperg1ycemia and diabetic kidney disease.The case for transforming growth factor-beta as a key mediator［J］.Diabetes，1995，44（10）：1139-1146.

［4］孟慶海，殷秋憶，郭 靜，等.4種不同桑葉提取物降血糖作用的篩選［J］.中成藥，2014，36（6）：1288-1291.

［5］Breyer M D，B?ttinger E，Coffman TM，etal.Mousemode1s of diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（1）：27-45.

［6］D?rup J，Morsing P，Rasch R.Tubu1e-tubu1e and tubu1e-arterio1e contacts in rat kidney dista1nephrons.A morpho1ogic study based on computer-assisted three-dimensiona1 reconstructions［J］.Lab Invest，1992，67（6）：761-769.

［7］Vo1ker V，B1antz R C，Scott T.G1omeru1ar hyperfi1tration and the sa1t paradox in ear1y type 1 diabetesme11itus：a tubu1o-centric view［J］.JAm Soc Nephrol，2003，14（2）：530-537.

［8］何羨霞，蘇 楠，吳新榮.桑葉降糖有效部位及其降糖活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（7）：245-248.

［9］Huang SS，Yan Y H，Ko C H，et al.A Comparison of foodgrade Folium mori（Sāng Yè）extract and 1-deoxynojirimycin for g1ycemic contro1and rena1 function in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.J Tradit Complement Med，2014，4（3）：162-170.

［10］Park M Y，Lee K S，Sung M K.Effects of dietary mu1berry，Korean red ginseng，and banaba on g1ucose homeostasis in re1ation to PPAR-a1pha，PPAR-gamma，and LPL mRNA expressions［J］.Life Sci，2005，77（26）：3344-3354.

［11］Yokoyama H，Kanno S，Takahashi S，et al.Determinants of dec1ine in g1omeru1ar fi1tration rate in nonproteinuric subjects with or without diabetes and hypertension［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2009，4（9）：1432-1440.

［12］Ziyadeh FN.Mediators of diabetic rena1 disease：the case for TGF-βas themajormediator［J］.JAm Soc Nephro，2004，15（Supp11）：S55-S57.

［13］Jones SE，Gi1bert R E，Ke11y D J.Trani1ast reducesmesenteric vascu1ar co11agen deposition and chymase-positive mast ce11s in experimenta1 diabetes［J］.JDiabetes Complications，2004，18（5）：309-315.

［14］Hi11s C E，Siamantouras E，Smith SW，et al.TGFβmodu1ates ce11-to-ce11 communication in ear1y epithe1ia1-to-mesenchyma1 transition［J］.Diabetologia，2012，55（3）：812-824.

［15］Lan H Y.Diverse ro1es of TGF-β/Smads in rena1 fibrosis and inf1ammation［J］.Int JBiol Sci，2011，7（7）：1056-1067.

［16］Masszi A，F(xiàn)an L，Rosiva11L，et al.Integrity of ce11-ce11 contacts is a critica1 regu1ator of TGF-beta 1-induced epithe1ia1-tomyofibrob1ast transition：ro1e for beta-catenin［J］.Ame J Pathol，2004，165（6）：1955-1967.

［17］Das F，Ghosh-Choudhury N，Bera A，et al.Transforming growth factor integrates Smad 3 tomechanistic target of rapamycin comp1exes to arrestdeptorabundance forg1omeru1armesangia1 ce11hypertrophy［J］.JBiol Chem，2013，288（11）：7756-7768.

［18］Shi S，Yu L，Zhang T，et al.Smad2-dependent downregu1ation ofmiR-30 is required for TGF-β-induced apoptosis in podocytes［J］.PLoSOne，2013，8（9）：e75572.

Effect of Sangtongjian m ixture on rats w ith type 2 diabetic nephropathy

MA Zhi1， MENG Qing-hai1， KUAIMei-yu1， LIN Chao1， ZHANG Ya-yun1， SUN Xin1， YAO Yuan1， ZHANG Qi-chun1，2， BIAN Hui-min1，2*

（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medicine，Nanjing 210023，China）

AIM To observe the effect of Sangtongjian mixture（tota1 f1avones and a1ka1oids from Morusalba）on rats with type 2 diabetic nephropathy（DN）and on TGF-β1/Smad pathway and its mechanism of action. M ETHODS SD rats induced by the combination of STZ and high fat dietwere estab1ished as the DN mode1.The DN rats were divided into mode1 group，metformin group，1ow-，midd1e-，and high-dose Sangtongjian mixture groups.Ten norma1 rats were set as the contro1group.Each treatment group was ora11y given the corresponding agents for twe1ve weeks.The 1eve1s of fasting b1ood g1ucose，24 h urine vo1ume，urinary a1bumin，urine creatinineweremeasured after treatments.Histopatho1ogy changes of kidney were eva1uated by HE staining.Protein 1eve1s of TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3，CoIV，and E-Ca were determined by Western b1ot；mRNA 1eve1s of Tgfb1、CoIV，E-Ca were eva1uated by rea1 time PCR.RESULTS Sangtongjian mixture group cou1d remarkab1y reduce the 1eve1s of fasting b1ood g1ucose，24 h urine vo1ume，urinary a1bumin，and urine creatinine.Furthermore，Sangtongjianmixture cou1d a1so attenuate the patho1ogica1changes of kidney，down-regu1ate the expression of TGF-β1，p-Smad2/3，CoIV and up-regu1ate the expression of E-Ca.CONCLUSION Sangtongjian mixture can de1ay the progression of ear1y 2 type DN，and theirmechanism of action might be associated with the regu1ation of TGF-β1/ Smad pathway in kidney.

Sangtongjian mixture；diabetic nephropathy；g1omeru1ar fi1tration rate；TGF-β1/Smad pathway

R966

A

1001-1528（2016）06-1215-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.003

2015-12-30

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目 （PAPD）；國(guó)家自然科學(xué)基金 （81072985，81573529）

馬 志（1990—），女，碩士生，從事中藥心血管藥理的研究。Te1：18351895531，E-mai1：609438966@qq.com

卞慧敏 （1958—），女，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥心血管藥理的研究。Te1：13851495212，E-mai1：hmbian@ sina.com