邢亞群, 王迪生*, 王 群, 魏 令, 耿春輝, 祝子明, 徐玉祿(.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院,安徽 蚌埠040;.蚌埠市第三醫(yī)院骨科,安徽蚌埠000;.宣城市人民醫(yī)院,安徽宣城4000)
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精骨補腎顆粒對地塞米松誘導骨質(zhì)疏松癥大鼠的保護作用
邢亞群1, 王迪生1*, 王 群1, 魏 令2, 耿春輝1, 祝子明3, 徐玉祿1
(1.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院,安徽 蚌埠233040;2.蚌埠市第三醫(yī)院骨科,安徽蚌埠233000;3.宣城市人民醫(yī)院,安徽宣城242000)
目的 觀察精骨補腎顆粒(黃精、骨碎補、桑葚等)對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(g1ucocorticoid induced osteoporosis,GIOP)大鼠的骨密度(BMD)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、堿性磷酸酶 (ALP)、肌鈣蛋白 (Tn)、血清降鈣素 (CT)、雌二醇 (E2)的影響及可能的作用機制。方法 將72只雌性大鼠隨機分為正常對照組,模型對照組,陽性對照組 (仙靈骨葆膠囊),精骨補腎顆粒低、中、高劑量組。除正常對照組外,其余各組大鼠每周2次肌肉注射地塞米松2.5 mg/kg,同時每日灌胃給藥連續(xù)9周。實驗結(jié)束后眼球取血,用酶聯(lián)免疫法測定大鼠Tn、TRAP、ALP、CT、E2指標,用雙能X線骨密度儀對大鼠離體股骨上1/3 BMD進行檢測。結(jié)果 GIOP大鼠對照組的TRAP、ALP明顯升高,BMD、Tn、CT、E2明顯降低,與正常對照組比較,有顯著性差異 (P<0.01);精骨補腎顆粒低、中、高劑量組可顯著降低GIOP大鼠TRAP、ALP含有量,顯著升高BMD、Tn、CT、E2值,且存在一定的劑量依賴關系,與模型對照組比較有顯著性差異 (P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 精骨補腎顆粒對骨質(zhì)疏松癥大鼠具有一定的治療作用。
精骨補腎顆粒;糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(g1ucocorticoid induced osteoporosis,GIOP);骨密度(BMD);抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP);堿性磷酸酶 (ALP);肌鈣蛋白 (Tn);降鈣素 (CT);雌二醇 (E2)
骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)是常見的一種全身性骨代謝疾病,其顯著特征是骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化、骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折[1]。糖皮質(zhì)激素所致的骨質(zhì)疏松稱為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(g1ucocorticoid induced osteoporosis,GIOP)。在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中,GIOP其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后和老年性骨質(zhì)疏松癥而居第3位,因此越來越受到重視。本研究以糖皮質(zhì)激素 (GC)致大鼠骨質(zhì)疏松模型為研究對象,以BMD、Tn、TRAP、ALP、CT、E2為主要指標,考察精骨補腎顆粒對GIOP模型大鼠的保護作用,探討其作用機制。
1.1實驗藥物 受試藥物:精骨補腎顆粒 (Jinggu Bushen Granu1es),由黃精 15 g(批號1503028)、骨碎補 10 g(批號1502018)、桑葚15 g(批號1503119)、附子10 g(批號1502118)、淫羊藿15 g(批號1504047)、黃芪10 g(批號1502050)、川芎5 g(批號1503125)、地鱉蟲5 g(批號1504031)、決明子10 g(批號1502059)、茯苓10 g(批號1503152)組成,采用江陰天江藥業(yè)有限公司提供的單位濃縮顆粒均勻混合而成。陽性對照藥:仙靈骨葆膠囊,由貴州同濟堂制藥有限公司生產(chǎn),批號140911。上述藥物臨用時,用蒸餾水配成適當劑量使用。
1.2實驗試劑 地塞米松磷酸鈉注射液 (天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司,批號1101264);酸性磷酸酶 (批號 20141107)、堿性磷酸酶 (批號20141026)、肌鈣蛋白 (批號20141025)、降鈣素(批號20141106)、雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒 (批號20141228),均購于上海源葉生物科技有限公司。
1.3實驗儀器 XR-2626型雙能X線骨密度儀(美國,NORLAND);MK3全自動酶標分析儀(上海弘聯(lián)公司);-80℃超低溫冰箱 (美國Advantage);LDZ4型微量離心機 (北京醫(yī)用離心機廠);電子天平(美國METTLER TOLEDO);微量移液器(德國Eppendorf)。
1.4實驗動物 16周齡SPF級Wistar大鼠72只,雌性 (雌性未孕),購于南京醫(yī)科大學動物中心,合格證號:SCXK(蘇)2008-0004。低鈣飼料及全價飼料均購于安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司,合格證號SCXK(皖)2007-001。
2.1動物分組 取Wistar大鼠72只,雌性(未孕),體質(zhì)量200~250 g,實驗室適應性飼養(yǎng)7 d后,隨機均分為6組,每組12只,即正常對照組,模型對照組,陽性對照組 (仙靈骨葆膠囊,0.27 g/kg),精骨補腎顆粒低、中、高 (2.93、5.86、11.72 g/kg)劑量組。
2.2造模方法 除正常對照組外,其余各組大鼠于左后肢臀部肌肉注射地塞米松2.5 mg/kg體質(zhì)量,每周2次,并給予低鈣飼料 (配方:玉米面45%,白面30%,豆餅15%,麩子7.5%,雞蛋1%,豆油1%及酵母0.5%)喂養(yǎng),連續(xù)9周。正常對照組大鼠給予全價飼料 (配方:玉米面40%,豆餅10%,白面26%,麩子10%,魚粉10%,骨粉2%,復合維生素1%及鹽1%)喂養(yǎng)。
2.3給藥方法 各組大鼠適應飼養(yǎng)1周后按“2.2”項方法造模,同時陽性對照組和藥物組按照劑量1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給予相應藥物,每天1次,連續(xù)9周;正常對照組和模型對照組大鼠灌胃等容量蒸餾水。
2.4指標檢測方法 末次給藥后,各組大鼠禁食(不禁水)24 h,用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉,進行以下指標檢測。
2.4.1骨密度測定 組織取材:先用生理鹽水沖洗大鼠全股骨,將醫(yī)用紗布用生理鹽水浸漬后,對全股骨進行包裹,再用預先準備的錫紙包裹。大鼠離體股骨上1/3骨密度應用雙能X線骨密度儀進行檢測。實驗數(shù)據(jù)應用“The Sma11 Subject Scoutcan”小動物軟件進行分析。
測定方法:參數(shù)設置,掃描速度為60mm/s,掃描寬度為10cm,長度可任意調(diào)節(jié),分辨率為1.0mm×1.0mm,組內(nèi)CV(變異系數(shù))在0.82%~1.24%之間。實驗結(jié)果骨密度采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含有量表示(g/cm2)。
2.4.2肌鈣蛋白測定 取出大鼠右后肢腓腸肌的白肌部分,用人黑色素細胞刺激素 (MSH)緩沖液清洗、擦干、稱重后,用剪刀剪碎放入勻漿瓶中,將0.2g/mL組織加入勻漿液中,并加入蛋白酶抑制劑5μL/mg,以500r/min勻漿充分,將勻漿后的組織以2000r/min,離心10min,除去脂肪層和上清,再以5000r/min,離心15min,除上清,提取線粒體放入1mLEP管中。具體檢測步驟按試劑盒說明書進行。
2.4.3血清磷酸酶、降鈣素、雌二醇測定 腹主動脈取血8mL,靜置,3000r/min離心10min,取血清進行上述指標檢測。具體檢測步驟按試劑盒說明書進行。
2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 試驗數(shù)據(jù)以SPSS13.0for windows軟件包處理,結(jié)果以均數(shù)±標準差 (± s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗,以P<0.05為有顯著性差異,P<0.01為有高度顯著性差異。
3.1精骨補腎顆粒對GIOP大鼠BMD和Tn的影響 實驗結(jié)果顯示:GIOP模型對照組大鼠BMD明顯降低,Tn含有量明顯減少,與正常對照組比較,有顯著性差異 (P<0.01);精骨補腎顆粒低、中、高劑量組可顯著增加GIOP大鼠BMD值,提高Tn含有量,且存在一定的劑量依賴關系,與模型對照組比較有顯著性差異 (P<0.05或P<0.01)。詳見表1。
表1 精骨補腎顆粒對GIOP大鼠BMD和Tn的影響(±s)Tab.1 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofBMDinserumofosteoporosisrats(±s)
表1 精骨補腎顆粒對GIOP大鼠BMD和Tn的影響(±s)Tab.1 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofBMDinserumofosteoporosisrats(±s)
注:與正常對照組比較,#P<0.01;與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別 劑量/(g·kg-1) 動物數(shù)/只 BMD/[g·(cm2)-1] Tn/(mg·L-1)正常對照組-12 0.170±0.015 35.7612±2.6613模型對照組 - 12 0.136±0.014# 13.8181±1.2591#陽性對照組 0.27 12 0.149±0.011* 23.5758±2.0461**精骨補腎顆粒低量組 2.93 12 0.147±0.007* 22.1958±1.9512**精骨補腎顆粒中量組 5.86 12 0.154±0.008** 24.1860±1.5703**精骨補腎顆粒高量組 11.72 12 0.159±0.008** 25.5066±1.2143 **
3.2精骨補腎顆粒對GIOP大鼠TRAP、ALP、CT、E2的影響 實驗結(jié)果顯示:GIOP模型對照組大鼠TRAP、ALP明顯升高,CT、E2明顯降低,與正常對照組比較,有顯著性差異 (P<0.01);精骨補腎顆粒低、中、高劑量組可顯著降低GIOP大鼠TRAP、ALP含有量,增加CT、E2含有量,且存在一定的劑量依賴關系,與模型對照組比較有顯著性差異 (P<0.05或P<0.01)。詳見表2。
表2 精骨補腎顆粒對骨質(zhì)疏松模型大鼠血清TRAP、ALP、CT、E2的影響(±s,n=12)Tab.2 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofTRAP,ALP,CT,E2inserumofosteoporosisrats(±s,n=12)
表2 精骨補腎顆粒對骨質(zhì)疏松模型大鼠血清TRAP、ALP、CT、E2的影響(±s,n=12)Tab.2 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofTRAP,ALP,CT,E2inserumofosteoporosisrats(±s,n=12)
注:與正常對照組比較,#P<0.01;與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別 劑量/(g·kg-1) TRAP/(U·L-1) ALP/(U·L-1) CT/(μg·mL-1) E2/(pg·mL-1)正常對照組-13.82±1.33 61.65±2.48 55.37±3.63 141.971±7.641模型對照組 - 18.52±1.34# 87.17±4.11# 44.87±2.14# 100.126±4.86#陽性對照組 0.27 14.68±1.55** 71.93±3.94** 50.14±3.14** 127.392±5.951**精骨補腎顆粒低量組 2.93 17.36±1.24* 74.31±6.35** 49.74±1.96** 130.750±3.266**精骨補腎顆粒中量組 5.86 15.98±1.51** 72.83±5.39** 51.79±2.29** 133.702±1.696**精骨補腎顆粒高量組 11.72 14.90±1.23** 72.52±6.86** 52.77±2.52** 135.959±2.877**
現(xiàn)代醫(yī)學認為骨質(zhì)疏松癥是一種以全身骨量減少 (即骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)等比例減少)為主要特征的全身性骨代謝疾病,分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性3類。在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松中,糖皮質(zhì)激素(GC)在臨床的廣泛使用是其主要誘因,因其促進腎臟對鈣的排除、抑制小腸對鈣的吸收等作用,故長期使用易引起低血鈣癥,導致骨質(zhì)疏松。應用外源性GC后一年的病人,GIOP的發(fā)生率可達0.6%~6%[2]。因此,盡管采用去勢法切除雙側(cè)卵巢可成功復制大鼠骨質(zhì)疏松證模型[3-4],但本實驗采糖皮質(zhì)激素配合低鈣飼料復制的GIOP大鼠模型更符合臨床實際。
中國傳統(tǒng)醫(yī)學認為骨質(zhì)疏松癥屬于骨枯、骨痿、骨蝕、骨痹、骨極等范疇,在歷代中醫(yī)文獻均有記載?!端貑枴ゐ粽摗吩疲骸澳I主身之骨髓……腎氣熱,則腰脊不舉,骨枯而髓減,發(fā)為骨痿”。《景岳全書·痿論》云:“腎者,水臟也,今水不勝火,則骨枯而髓虛,故足不能任身,發(fā)為骨痿”。因此,中醫(yī)學認為腎虛是骨質(zhì)疏松癥的根本病機,因腎精乏源、骨骼失養(yǎng)、骨骼脆弱無力可致骨質(zhì)疏松癥。從中醫(yī)理論認識GC,它應屬于 “純陽”之品,長久使用,勢必耗損陰精與氣血,中醫(yī)陰精是與機體有關的活性物質(zhì),構(gòu)成骨質(zhì)的活性物質(zhì)屬于陰精范疇,因此,“純陽”之品過量必將導致骨質(zhì)疏松證。此外,“久病及腎”,腎中精氣虧虛,陰陽失衡進一步加重腎虛,“主骨生髓”失職,骨髓生化無源,誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥是必然的。對此,中醫(yī)治療該證多從補腎調(diào)腎論治[5-7]。因此,中醫(yī)對GIOP大鼠模型的認識與現(xiàn)代醫(yī)學的研究是一致的,GIOP大鼠模型與中醫(yī)腎虛性骨質(zhì)疏松模型比較接近,可以作為研究治療補腎治療骨質(zhì)疏松癥的實驗模型[8-9]。
骨密度全稱是骨骼礦物質(zhì)密度,是骨骼強度及骨質(zhì)量的一個重要指標,可以反映骨質(zhì)疏松程度,是預測骨折危險性的重要依據(jù)[10]對早期診斷、預防骨質(zhì)疏松及評估干預措施效果等方面有重要意義。肌鈣蛋白存在于骨骼肌和心肌中,調(diào)節(jié)肌肉的收縮和舒張狀態(tài),肌鈣蛋白C亞型可與Ca2+結(jié)合活化ATP酶,從而引起肌肉肌球蛋白收縮,調(diào)節(jié)收縮過程;肌鈣蛋白T亞型將肌鈣蛋白復合體連接到原肌球蛋白和肌動蛋白分子上,調(diào)控肌原纖維的收縮;肌鈣蛋I亞型抑制肌動蛋白-肌凝蛋白互動的ATP酶活性,從而抑制肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合,阻止肌肉收縮[11]。因此肌鈣蛋白在臨床中多用為骨骼肌損傷和骨質(zhì)疏松的特異性標志物。本實驗結(jié)果顯示,精骨補腎顆粒可以顯著增加GIOP大鼠BMD值,提高肌鈣蛋白含有量,提高肌肉組織能力代謝有效保護骨組織[12]。
現(xiàn)代醫(yī)學對于骨質(zhì)疏松的治療原則[13],主要為抑制骨吸收,促進骨形成??咕剖崴嵝粤姿崦福═RAP)是由破骨細胞分泌,是破骨細胞功能的標志,骨吸收時,TRAP參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解。而堿性磷酸酶 (ALP)則是由成骨細胞生成,ALP含有量的變化可以預示骨細胞增殖的程度,是骨重建活躍性和成骨細胞活動性增加的特異性指征[14]。降鈣素 (CT)是一種破骨細胞的抑制劑,CT可通過受體CTR介導作用于破骨細胞,減少其活性和數(shù)量,對調(diào)節(jié)成骨細胞的活性、促進骨生成具有重要意義[15]。雌激素 (E2)在維持骨量平衡、穩(wěn)定中具有重要作用。研究表明骨組織形成和溶解都受到雌激素的調(diào)節(jié),成骨細胞與破骨細胞上都存在雌激素受體。當雌激素與成骨細胞上的受體相結(jié)合,可介導成骨細胞膠原蛋白合成、鈣鹽的沉積和類骨質(zhì)的形成,從而形成骨組織[16];而當雌激素與破骨細胞上的受體相結(jié)合時,則可抑制破骨細胞的溶骨功能。
精骨補腎顆粒在醫(yī)院多年使用的驗方的基礎上加味所得,以溫補肝腎精陰的黃精、骨碎補、桑葚等為主藥,填精補髓,治病求本;采取 “陽中求陰”治法,選用附子、淫羊藿補腎陽,陰陽雙補,相得益彰,本實驗結(jié)果顯示,精骨補腎顆粒能提高大鼠骨密度、肌鈣蛋白含有量,降低堿性磷酸酶和酸性磷酸酶含有量,提高血清降鈣素水平及恢復雌激素的平衡,對骨質(zhì)疏松模型大鼠具有一定的治療作用,為中醫(yī) “腎主骨”中醫(yī)理論防治骨質(zhì)疏松提供了實驗依據(jù)。
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Protective effects of Jinggu Bushen Granules on dexamethasone-induced osteoporosis rats
XING Ya-qun1, WANGDi-sheng1*, WANGQun1, WEILing2, GENGChun-hui1, ZHU Zi-ming3,XU Yu-1u1
(1.The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233040,China;2.The Third People's Hospital of Bengbu,Bengbu 233000,China;3.The People's Hospital of Xuancheng City,Xuancheng 242000,China)
AIM To study the effects of Jinggu Bushen Granu1es(Polygonati Rhizoma,Drynariae Rhizoma,Mori Fructu,etc.)on g1ucocorticoid induced osteoporosis(GIOP)in rat bone minera1 density(BMD),tartrate resistant acid phosphatase(TRAP),a1ka1ine phosphatase(ALP),troponin(Tn),ca1citonin(CT),estradio1(E2),and to exp1ore themechanism of it preventing and treating osteoporosis to serve an experimenta1basis for c1inica1app1ications.METHODS Seventy-two Wistar-Kyoto strain rats were random1y divided into six groups:norma1group,contro1group,positive group with Xian1ing Gubao Capsu1es,experimenta1groupswith Jinggu Bushen Granu1es 1ow-,medium-and high-dose.Except for the norma1group,a11of the groupswere injected with dexamethasone for two weeks and fed respective1y with correspondingmedicines for nine weeks.After the 1ast administration,rats'eyeba11s were picked up to obtain b1ood.The assay of Tn,TRAP,ALP,CT and E2in serum were measured by ELISA;in vitro the BMD proxima1one third of the femurwas determined by dua1-energy X-ray absorp-tiometry.RESULTS In GIOPmode1group,the contents of TRAP,ALP increased and BMD,Tn,CT,E2reduced with significant differences compared to those of the norma1 group(P<0.01).In three experimenta1 groups,the contents of TRAP,ALP reduced and the BMD,Tn,CT,E2increased.There were significant differences compared to the mode1group(P<0.05 or P<0.01).CONCLUSIONS The experimenta1 resu1ts have suggested that Jinggu Bushen Granu1es have certain protective effects against GIOP rats.
Jinggu Bushen Granu1es;GIOP(g1ucocorticoid induced osteoporosis);BMD(bone minera1 density);TRAP(tartrate resistant acid phosphatase);ALP(a1ka1ine phosphatase);Tn(troponin);CT(ca1citonin);E2(estradio1)
R285.5
A
1001-1528(2016)06-1221-05
10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.004
2016-01-30
安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥管理局科研計劃 (2014XY39)
邢亞群 (1975—),女,碩士,副主任藥師,研究方向為藥物代謝動力學。Te1:(0552)3111625,E-mai1:17072530@ qq.com
王迪生 (1956—),男,碩士,主任藥師,副教授,碩士生導師,研究方向為中藥新藥研究與開發(fā)。Te1:(0552)3111625,E-mai1:Wangdisheng2168@a1iyun.com