張 雯， 蔡 敏， 余忠海， 向 軍， 蔡定芳*（.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200032）

?

羅布麻提取物對(duì)急性腦缺血大鼠血腦屏障的保護(hù)作用和機(jī)制

張 雯1， 蔡 敏1， 余忠海1， 向 軍2*， 蔡定芳1*
（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200032）

目的 觀察羅布麻提取物的急性腦缺血后血腦屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組 （sham），模型組 （I/R），羅布麻提取物小、中、大 ［125、250、500 mg/（kg·d）］劑量組。采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立局灶性腦缺血損傷模型，1.5 h后拔出線栓實(shí)施再灌注。采用TTC染色于缺血再灌注24 h計(jì)算腦梗死面積百分比；參照Z(yǔ)ea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)于缺血再灌注24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；透射電鏡檢測(cè)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)變化；采用Western b1ot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9/-2的表達(dá)。結(jié)果 羅布麻提取物能顯著減少腦梗死面積百分比，改善神經(jīng)功能缺損。抑制腦缺血后基質(zhì)金屬蛋白酶-9/-2的表達(dá)和活性。結(jié)論 羅布麻提取物可能通過(guò)抑制腦缺血后基質(zhì)金屬蛋白酶-9/-2的表達(dá)和活性而減輕血腦屏障損傷，進(jìn)而減少腦梗死，促進(jìn)神經(jīng)功能改善。

羅布麻提取物；腦缺血再灌注；血腦屏障；基質(zhì)金屬蛋白酶-9/-2

羅布麻Apocynum venetum L.屬夾竹桃科植物，生長(zhǎng)于我國(guó)華北、西北及黃河流域的河灘、草灘、鹽堿沙荒環(huán)境中，以干燥葉入藥，藥典記載其性味甘、苦、涼，歸肝經(jīng)，具有平抑肝陽(yáng)、清熱利水等功效［1］?，F(xiàn)代研究表明其具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用［2］，但其對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用尚不明確。我們擬利用腦缺血損傷大鼠模型，觀察其對(duì)急性腦缺血后血腦屏障的保護(hù)作用和機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，3月齡，體質(zhì)量280～300g，由上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2002-0010號(hào)。

1.1.2藥物與試劑 羅布麻提取物 （由日本河漢生藥研究所提供）；兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9/-2（Idun Pharmaceutica1s，美國(guó)）；兔抗鼠β-Actin、HRP羊抗兔IgG（Ce11Signa1ing Techno1ogy，美國(guó)）；兔抗鼠Active Caspase-8（Santa Cruz Biotechno1ogy，美國(guó)）；TTC（2，3，5-tripheny1 tetrazo1ium ch1oride，TTC，Sigma，美國(guó)）；ECL發(fā)光試劑盒（Pierce，美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，羅布麻提取物小 ［125 mg/（kg·d）］、中 ［250mg/（kg·d）］、大劑量組 ［500mg/（kg·d）］。大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后開(kāi)始給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，在給藥第8天造模。造模后繼續(xù)給藥，持續(xù)到大鼠被處死。羅布麻提取物組分別給予不同劑量的羅布麻提取物，假手術(shù)組和模型組給予等劑量的生理鹽水。

1.2.2 腦缺血模型的建立 SD大鼠術(shù)前12 h禁食，10%水合氯醛腹腔注射 （350 mg/kg，i.p.），麻醉后仰臥位固定，參照Z(yǔ)ea Longa［3］等的大腦中動(dòng)脈線栓法，造成右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞，缺血1.5 h后，拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.2.3神經(jīng)功能缺損評(píng)分 大鼠于缺血1.5 h再灌注24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，每組取5只大鼠進(jìn)行觀察。參照Z(yǔ)ea Longa［3］等的五級(jí)4分制：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.2.4腦梗死面積測(cè)定 神經(jīng)功能缺損評(píng)分完畢后，深度麻醉，斷頭取腦組織，切成5個(gè)連續(xù)冠狀切片。于1%TTC染液中37℃避光水浴15 min。拍照后軟件（Image Pro P1us，IPP 6.0）統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算腦梗死面積百分比。

1.2.5透射電鏡 大鼠于缺血1.5 h再灌注24 h檢測(cè)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)，每組取3只大鼠。深度麻醉，經(jīng)心臟灌注3%多聚甲醛+1%戊二醛固定液300 mL后取材，放置于2.5%戊二醛溶液（0.1 mo1/L PB緩沖液，pH 7.4配制）后固定24 h后，置于2%Osmium固定1.5 h，經(jīng)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂812包埋液浸透包埋，超薄切片鉆石刀將組織切成0.06μm的切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后保存。透射電鏡下觀察血腦屏障的亞顯微結(jié)構(gòu)并拍片。

1.2.6蛋白定量分析 采用Western b1ot法檢測(cè)血腦屏障損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)，每組取4只大鼠。大鼠缺血再灌注24 h，取缺血側(cè)皮層腦組織，提總蛋白。品經(jīng)SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，牛血清白蛋白封閉，與相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL反應(yīng)1 min，曝光、顯影，光密度定量分析，β-Actin作為內(nèi)參。

1.2.7統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析，兩組間用兩樣本t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1羅布麻提取物對(duì)急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 表1所示，模型組神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)250、500mg/（kg·d）羅布麻提取物預(yù)處理的大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯優(yōu)于模型組大鼠 （P＜0.05）。結(jié)果提示大、中劑量羅布麻提取物改善局灶性缺血再灌注后的神經(jīng)功能損害。

表1　腦缺血1.5 h再灌注24 h的神經(jīng)功能缺損評(píng)分

2.2羅布麻提取物對(duì)急性腦缺血大鼠腦梗死面積百分比的影響 大鼠腦缺血1.5 h再灌注24 h的TTC染色，模型組大鼠可見(jiàn)大面積的白色梗死區(qū)，250、500 mg/（kg·d）羅布麻提取物預(yù)處理的大鼠的梗死面積則較小，如表2所示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明大、中劑量羅布麻提取物能顯著減少腦梗死面積百分比 （P＜0.05）。

表2　腦缺血1.5 h再灌注24 h的神經(jīng)功能缺損評(píng)分

圖1　羅布麻提取物對(duì)急性腦缺血大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3羅布麻提取物對(duì)急性腦缺血大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖1所示，假手術(shù)組 （圖1A1、A2）大鼠皮層血腦屏障結(jié)構(gòu)正常，微血管形態(tài)規(guī)則，基底膜連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)均正常。腦缺血1.5 h再灌注24 h，模型組大鼠 （圖1B1、B2）血管管腔受壓變窄，毛細(xì)血管周圍水腫明顯，或呈空泡性改變。血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接開(kāi)放或消失。羅布麻提取物大劑量組 （圖1C1、C2）亦可見(jiàn)血腦屏障亞顯微結(jié)構(gòu)改變，但毛細(xì)血管內(nèi)皮完整，管腔正常，基底膜連續(xù)，微血管周圍水腫，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫均較模型組減輕。

2.4羅布麻提取對(duì)急性腦缺血大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9/-2表達(dá)的影響 如圖2所示，與假手術(shù)組比較，腦缺血1.5 h再灌注24 h模型組大鼠MMP-9/-2的表達(dá)均顯著上升，而大劑量羅布麻提取物預(yù)處理可明顯下調(diào)二者的表達(dá)。

圖2　大劑量羅布麻提取物對(duì)MMP-9/-2的表達(dá)的影響

3　討論

我們首先通過(guò)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比評(píng)定了不同劑量羅布麻提取物的腦缺血保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大、中劑量羅布麻提取物 ［500、250 mg/（kg·d）］具有顯著的腦缺血保護(hù)作用。隨后我們選取最優(yōu)劑量的羅布麻提取物觀察其對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用和機(jī)制。

血腦屏障由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足突繞構(gòu)成，是血與腦組織間復(fù)雜的動(dòng)態(tài)屏障，維持腦組織的穩(wěn)態(tài)，保證了神經(jīng)元正常功能活動(dòng)［4-5］。急性腦缺血可對(duì)其結(jié)構(gòu)成分造成損傷，血腦屏障通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫或向腦出血轉(zhuǎn)換而加重腦損傷［6-7］。因此，腦缺血后血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［8-9］。我們應(yīng)用透射電鏡證實(shí)急性腦缺血再灌注后血腦屏障超微結(jié)構(gòu)改變，微血管周圍水腫嚴(yán)重，星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫明顯，微血管被擠壓，而羅布麻可顯著減輕腦缺血再灌注導(dǎo)致的血腦屏障形態(tài)學(xué)改變。

導(dǎo)致血腦屏障破壞的因素和機(jī)制復(fù)雜，其中基質(zhì)金屬蛋白酶是目前關(guān)注的熱點(diǎn)之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)金屬基質(zhì)蛋白酶，可攻擊并降解細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接和基底膜導(dǎo)致血腦屏障破壞［5，7，10］。目前已證實(shí)，MMP-9、MMP-2在腦缺血再灌注時(shí)表達(dá)上調(diào)，降解緊密連接蛋白導(dǎo)致血腦屏障完整性破壞，二者也被認(rèn)為是血腦屏障損傷的標(biāo)志物之一［11-14］。我們的研究發(fā)現(xiàn)羅布麻提取物顯著下調(diào)腦缺血后MMP-9/-2的表達(dá)，提示與二者可能是羅布麻的血腦屏障保護(hù)作用靶點(diǎn)。

綜上所述，羅布麻可保護(hù)急性腦缺血再灌注后血腦屏障破壞，從而減少腦梗死，促進(jìn)神經(jīng)功能改善，作用機(jī)制可能與其下調(diào)MMP-9/-2的表達(dá)有關(guān)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：196-197.

［2］Zheng M Z，Liu C M，Pan FG，et al.Protective effects of f1avonoid extract from apocynum venetum 1eavesagainstcorticosterone-induced neurotoxicity in PC12 ce11s［J］.Cell Mol Neurobiol，2011，31（3）：421-428.

［3］Longa E Z，Weinstein PR，Car1son S，et al.Reversib1emidd1e cerebra1artery occ1usion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］RenúA，Amaro S，Laredo C，et al.Re1evance of b1ood-brain barrier disruption after endovascu1ar treatment of ischemic stroke：dua1-energy computed tomographic study［J］.Stroke，2015，46（3）：673-679.

［5］Vecsernyés M，F(xiàn)enyvesi F，Bácskay I，et al.Cyc1odextrins，b1ood-brain barrier，and treatment of neuro1ogica1 diseases［J］. Arch Med Res，2014，45（8）：711-729.

［6］Yang Y，Rosenberg G A.B1ood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascu1ar disease［J］.Stroke，2011，42（11）：3323-3328.

［7］Yang Y，Sa1ayandia V M，Thompson JF，et al.Attenuation of acute stroke injury in rat brain by minocyc1ine promotes b1oodbrain barrier remode1ing and a1ternative microg1ia/macrophage activation during recovery［J］.J Neuroinflammation，2015，12：26.

［8］Krueger M，Bechmann I，Immig K，et al.B1ood-brain barrier breakdown invo1ves four distinct stages of vascu1ar damage in variousmode1s of experimenta1 foca1cerebra1ischemia［J］.JCereb Blood Flow Metab，2015，35（2）：292-303.

［9］Liu W Y，Su D F.B1ood-brain barrier is nota barrier in the deve1opment of new drugs for ischemic stroke［J］.CNSNeurosci T-her，2014，20（12）：1013-1014.

［10］Jin R，Yang G，LiG.Mo1ecu1ar insights and therapeutic targets for b1ood-brain barrier disruption in ischemic stroke：critica1 ro1e ofmatrixmeta11oproteinases and tissue-type p1asminogen activator［J］.Neurobiol Dis，2010，38（3）：376-385.

［11］Wang Z F，Leng Y，Tsai L K，et al.Va1proic acid attenuatesb1ood-brain barrier disruption in a rat mode1 of transient foca1 cerebra1 ischemia：the ro1es of HDAC and MMP-9 inhibition［J］.JCere Blood Flow Met，2011，31（1）：52-57.

［12］Zhou J，Li J，Rosenbaum D M，et al.Thrombopoietin protects the brain and improves sensorimotor functions：reduction of stroke-induced MMP-9 upregu1ation and b1ood-brain barrier injury［J］.JCere Blood Flow Met，2011，31（3）：924-933.

［13］Song J，Wu C，Korpos E，Zhang X，et al.Foca1MMP-2 and MMP-9 activity at the b1ood-brain barrier promotes chemokineinduced 1eukocyte migration［J］.Cell Rep，2015，10（7）：1040-1054.

［14］Reuter B，Rodemer C，Grudzenski S，et al.Effect of simvastatin on MMPs and TIMPs in human brain endothe1ia1ce11sand experimenta1 stroke［J］.Transl Stroke Res，2015，6（2）：156-159.

R285.5

B

1001-1528（2016）06-1387-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.039

2015-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81202813）

張 雯 （1985—），男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)。Te1：（021）64041990-3444，E-mai1：zhang. wen1@zs-hospita1.sh.cn

向 軍 （1982—），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)。Te1：（021）64041990-3444，E-mai1：xiang. jun@zs-hospita1.sh.cn蔡定芳 （1956—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)。Te1：（021）64041990-3444，E-mai1：cai. dingfang@zs-hospita1.sh.cn