馬 琳， 張耀洲*， 唐楚沉（.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津30007；.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州3008）

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超聲提取麻花秦艽花中龍膽苦苷的最佳工藝

馬 琳1， 張耀洲1*， 唐楚沉2
（1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津300072；2.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018）

目的 研究麻花秦艽花中龍膽苦苷的最佳超聲提取工藝。方法 采用UPLC結(jié)合響應(yīng)面法對麻花秦艽花中龍膽苦苷超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 最佳條件為提取時(shí)間80min，料液比1∶24，甲醇體積分?jǐn)?shù)93%，提取3次。供試液中龍膽苦苷峰面積的實(shí)測值為2 164.60，與預(yù)測值 （2 120.64）相差僅2.05%。結(jié)論 該模型預(yù)測性良好，而且優(yōu)化條件可靠。

麻花秦艽花；龍膽苦苷；超聲提取；UPLC；響應(yīng)曲面法

麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.為多年生草本，屬龍膽科龍膽屬秦艽組，主要分布于陜西、甘肅、四川、青海和內(nèi)蒙古等地，大多生長于高山草甸、山地草場、亞高山或高山灌叢和林園陽坡等地［1］。該植物以花入藥，性味苦、平，有祛風(fēng)濕、清濕熱、止麻痹等功效，臨床上用于治療風(fēng)濕痹痛、筋脈痙攣、日曝潮熱和小兒瘡積發(fā)熱等癥［2-3］。藥理研究表明，秦艽中含有以龍膽苦苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類活性成分，對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有顯著療效，可治療消化不良，對多種肝損傷起到保護(hù)作用，還具有利膽、利尿、抗菌、抗炎、抗過敏、抗病原蟲、退熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤及減輕CC14毒性等活性［4-6］。為合理開發(fā)利用這一藥材資源，最大限度地提取其有效成分，本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、料液比和甲醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素為影響因子，應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以供試液中龍膽苦苷的峰面積為響應(yīng)值，得到龍膽苦苷超聲提取的最佳工藝。

1　儀器、試劑與材料

1.1儀器 Acquity UPLC色譜儀，包括Acquity UPLC PDA檢測器、Empower 2色譜工作站（美國Waters公司）；AL204型電子天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；JP300型超聲提取器 （武漢嘉鵬電子有限公司）。

1.2試劑 龍膽苦苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號1107702200308，純度＞98%，20mg/支）；UPLC用甲醇 （色譜純）、提取用甲醇 （分析純）（天津康科德試劑有限公司）。

1.3材料 麻花秦艽花于2013年購自陜西省漢中藥材市場，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所王啟蘭副研究員鑒定為龍膽屬植物麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.的花。60℃下干燥，粉碎，過40目篩，密封備用。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm× 2.1mm，1.7μm）；柱溫40℃；樣品室溫度8℃；流動(dòng)相為甲醇∶水 （30∶70）；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量3μL。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品55mg，置于100 mL燒杯中，適量色譜純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，色譜純甲醇定容，搖勻，即得5.5 mg/mL對照品溶液，備用。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取 “2.2”項(xiàng)下對照品溶液1、3、5、7、9μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y），得到回歸方程Y=1 266.84X+1.04（r2=1），表明龍膽苦苷在5.5～49.5μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4樣品的提取 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取次數(shù)為3次。根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇提取時(shí)間 （X1）、料液比 （X2）和甲醇體積分?jǐn)?shù) （X3）作為考察因素，每個(gè)因素3個(gè)水平。見表1。

表1　因素水平

取密封保存的麻花秦艽花粉末1.00 g，超聲提取，過濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓干燥，干浸膏用甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移到25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22μm微孔濾膜過濾，作為供試樣品溶液。對照品及樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1　龍膽苦苷對照品

圖2　麻花秦艽花樣品

2.5響應(yīng)面試驗(yàn) 采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以供試液樣品溶液中龍膽苦苷的峰面積值 （Y）為響應(yīng)值，共設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，Design Expert 7.0.0軟件對龍膽苦苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化［7-9］。結(jié)果見表2。

2.6響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.6.1供試液中龍膽苦苷的峰面積回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) Design Expert7.0.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式擬合，得到回歸方程

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系顯著 （r=0.978 6）；模型顯著水平P＜0.000 1，說明該模型非常顯著；模型失擬項(xiàng)P=0.38＞0.000 5不顯著，表明該方程擬合度良好，誤差小。因此，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)來進(jìn)行分析和預(yù)測。X2的F值小于0.000 1，表明其對龍膽苦苷提取的影響非常顯著；X3的F值小于0.001，表明影響很顯著；X1的F值小于0.01，表明影響較顯著。各二次項(xiàng)因素按影響大小排序，依次為；交互項(xiàng)按影響大小排序，依次為 X2X3、 X1X3、X1X2，表明各因素對龍膽苦苷提取的影響不是簡單的線性關(guān)系，響應(yīng)曲面圖見圖4～6。

表3　方差分析

2.6.2響應(yīng)面及等高線分析 圖3A～5A是提取時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的響應(yīng)面圖，可反映出任意兩因素及其交互作用對麻花秦艽花中龍膽苦苷提取的影響?；貧w方程在所選范圍的極大值可以用響應(yīng)面曲線圖的最高點(diǎn)標(biāo)示，而兩個(gè)變量之間的交互作用是否顯著可以從等高線 （圖3B～5B）的形狀來判斷。等高線圖越趨近于圓形，表示交互作用越不顯著；越趨于橢圓形，表示交互作用越強(qiáng)［10］。

圖3　提取時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)對龍膽苦苷的影響

圖4　料液比和提取時(shí)間對龍膽苦苷的影響

為了確定龍膽苦苷最佳的提取工藝，利用Design Expert7.0.0軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果作進(jìn)一步優(yōu)化，以龍膽苦苷峰面積為指標(biāo)，得到最佳條件為提取時(shí)間80 min，料液比1∶24，甲醇體積分?jǐn)?shù)93%。此條件下，龍膽苦苷峰面積為2 120.64。

圖5　甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對龍膽苦苷的影響

2.7最佳工藝條件驗(yàn)證 平行試驗(yàn)3次，結(jié)果見表4。由表可知，該模型預(yù)測性良好 （與預(yù)測值2 120.64相差僅2.05%），優(yōu)化工藝條件可靠。

表4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC法對麻花秦艽花藥材中龍膽苦苷的含有量進(jìn)行測定，與常用的HPLC法相比，在保持較高準(zhǔn)確度和精密度的同時(shí)，還提高了分析效率。同樣流動(dòng)相下，龍膽苦苷的保留時(shí)間從9.8min銳減到2.5 min，分析時(shí)間大幅度縮短，從而減少了溶劑損耗及廢液處理成本，可為麻花秦艽花的質(zhì)量控制及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一種更快捷、精準(zhǔn)的測定方法。

同時(shí)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，所得最佳條件 （提取時(shí)間80 min，料液比1∶24，甲醇體積分?jǐn)?shù)93%，提取3次）與實(shí)際結(jié)果的吻合性較好，說明該方法在操作上可靠，而且重復(fù)性良好。

［1］中國科學(xué)院 《中國植物志》編輯委員會(huì).中國植物志：第79卷［M］.北京：科學(xué)出版社，2009.

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R284.2

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1001-1528（2016）06-1412-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.046

2015-04-20

馬 琳 （1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離與提取。E-mai1：yuyu88196@163.com

張耀洲 （1964—），男，教授，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)、天然產(chǎn)物分離與提取。E-mai1：zyz_tjedu@126.com