吳 娜， 趙重博， 胡美變， 彭 偉， 解達(dá)帥， 吳純潔（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137）

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BP-ANN結(jié)合正交試驗法優(yōu)化白附子多糖提取工藝

吳 娜， 趙重博， 胡美變， 彭 偉， 解達(dá)帥， 吳純潔*
（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137）

目的 采用反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) （BP-ANN）結(jié)合正交試驗法優(yōu)化白附子多糖提取工藝。方法 水提醇沉法提取多糖后，苯酚-硫酸法測定含有量?；趩我蛩卦囼灥幕A(chǔ)上，按照L9（34）正交表安排進(jìn)行試驗，考察提取溫度、提取時間、料液比對多糖得率的影響，BP-ANN技術(shù)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果 最佳條件為提取時間3.5 h，提取溫度90℃，料液比1∶20，多糖得率達(dá)5.20%。結(jié)論 該方法重復(fù)性良好，而且試驗次數(shù)少。

白附子；多糖；提取工藝；BP-ANN；正交試驗

白附子為天南星科植物獨(dú)角蓮Typhonium giganteum Eng1.的干燥塊莖，又名禹白附，為中醫(yī)臨床常用毒性中藥，具有祛風(fēng)痰、定驚搐、解毒散結(jié)止痛等功效，主要用于各種關(guān)節(jié)疼痛、中風(fēng)痰壅、口眼斜、破傷風(fēng)等癥狀的治療［1］。目前，對其化學(xué)成分的研究主要集中在腦苷、有機(jī)酸、甾體、揮發(fā)油、氨基酸以及毒性成分草酸鈣針晶等［2-6］。近年來，多糖已成為天然藥物研究開發(fā)的熱點(diǎn)，而且天南星科植物多糖已被證實具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理作用［7-9］，但有關(guān)白附子多糖提取工藝的研究尚未見報道。

反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）是模擬人大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能而建立的一種理論化的數(shù)學(xué)模型，由簡單處理元件構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，對于處理多變量、多響應(yīng)的非線性復(fù)雜信息具有表達(dá)能力強(qiáng)大等優(yōu)點(diǎn)，而且無需事先給出公式，通過自學(xué)習(xí)、自組織、自適應(yīng)［10-11］，然后自動總結(jié)出實驗數(shù)據(jù)中的規(guī)律，建立模型來擬合實際結(jié)果與期望結(jié)果。目前，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)已廣泛用于地質(zhì)勘探、化學(xué)、生物科學(xué)、食品、模式識別、圖像識別、醫(yī)藥等領(lǐng)域［12-16］，用于中藥提取工藝的優(yōu)化也越來越多［17-19］。

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以白附子多糖提取過程中的提取時間、提取溫度、料液比為優(yōu)化對象，以多糖得率為優(yōu)化指標(biāo)，采用正交試驗法設(shè)計，根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)，采用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和建模，以期得到比常規(guī)方法更為精確的工藝參數(shù)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

白附子飲片購自四川新荷花中藥飲片有限公司，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室李敏教授鑒定為天南星科植物獨(dú)角蓮Typhonium giganteum Eng1.的干燥塊莖。經(jīng)檢驗，符合 《中國藥典》要求。

D-無水葡萄糖對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號110833-200904）。濃硫酸、苯酚、乙醇均為分析純 （成都市科龍化工試劑廠）；實驗用水為純化水。

Autoscience AS 5150A超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；電熱式恒溫水浴鍋 （江蘇金壇宏凱儀器廠）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī) （上海醫(yī)用分析儀器廠）；UPT-11-10T優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；DB-206SC電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 （成都天宇試驗設(shè)備有限責(zé)任公司）；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī)（寧波新藝生物科技股份有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1白附子粗多糖的制備 取白附子飲片適量，粉碎，過20目篩，加入10倍量95%乙醇，回流提取5 h，脫脂，棄去濾液，藥渣自然揮干乙醇，作為多糖提取的樣品。

取已脫脂的白附子樣品5 g，加入一定量純化水，按照單因素及正交試驗設(shè)計，采用熱水提取，3 000 r/min離心，濾過，上清液濃縮至5～10 mL，加入乙醇使含醇量達(dá)80%，于4℃冰箱中沉淀過夜，濾過，沉淀于冷凍干燥機(jī)中干燥2 d，得白色粉末，即為白附子粗多糖［20-21］。

2.2多糖提取率的測定［8］

2.2.1對照品溶液的制備 葡萄糖對照品于105℃下恒溫干燥至恒定質(zhì)量，精密稱取20.08 mg，配成100 mL溶液，即得0.200 8 mg/mL葡萄糖對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取已干燥的白附子粗多糖樣品5 mg，置于50 mL量瓶中，超純水定容，加熱或超聲使其充分溶解，濾過，即得。

2.2.3最大吸收波長的選擇 精密移取對照品及供試品溶液各1.00 mL，置于不同具塞試管中，分別加入超純水至2 mL，再加入 5%苯酚溶液1.00 mL，搖勻，再沿試管壁迅速加入7 mL濃硫酸，立即振搖，沸水浴30 min，取出，冷水浴至室溫，以超純水代替供試品溶液配制空白，在400～600 nm處掃描。結(jié)果表明，對照品及供試品溶液在490 nm處均有最大吸收，而且空白溶液在此處無干擾，因此確定檢測波長為490 nm。

2.2.4線性關(guān)系考察 分別吸取葡萄糖對照品溶液0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 mL，置于10 m L具塞試管中，按 “2.2.3”項下方法操作，于490 nm波長處測定吸光度 （A），超純水作為空白試驗。以吸光度 （A）為縱坐標(biāo) （Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=52.67 X+0.068 9，R2=0.999，在0.003 01～0.010 04 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r= 0.999 5）。

2.2.5精密度試驗 精密移取對照品溶液0.35 mL，按 “2.2.3”項下方法顯色并測定吸光度，平行6次，測得RSD為0.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 精密移取供試品溶液，按“2.2.3”項下方法顯色，并分別在0、20、40、60、80、100 min測定吸光度，測得 RSD為0.59%，表明樣品在100 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗 精密稱取白附子粗多糖5 mg，共6份，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 mL，共6份，按“2.2.3”項下方法顯色并測定吸光度，測得RSD為2.21%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8加樣回收率試驗 精密稱取白附子粗多糖6份，每份5 mg，分別精密加入葡萄糖，超純水溶解，并定容于50 mL量瓶中，加熱或超聲使其充分溶解，取上清液，按 “2.2.3”項下方法測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.9多糖得率的測定 根據(jù)回歸方程，計算白附子多糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，計算多糖得率，公式為多糖得率Y=C×D×MC/（MS×m）× 100%。其中，C為樣品中葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL），D為稀釋倍數(shù)，MC為每份藥材提取得到粗多糖粉末的質(zhì)量 （g），m為稱取粗多糖的質(zhì)量 （mg），MS為藥材的質(zhì)量 （g）。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

2.3多糖提取工藝優(yōu)化 查閱文獻(xiàn) ［22-23］，發(fā)現(xiàn)影響多糖浸提的主要因素有提取次數(shù)、提取時間、提取溫度以及料液比。為了探索這4個因素對多糖得率的影響，以白附子多糖得率為指標(biāo)，固定其中3個因素，改變第4個因素，考察其對多糖得率的影響，尋找各個因素的取值水平。再根據(jù)各自取值水平設(shè)計并安排正交試驗，將所得相應(yīng)數(shù)據(jù)作為BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入和輸出數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)分析與建模，最終找出提取的最佳條件。

2.3.1單因素試驗

2.3.1.1提取次數(shù)對多糖得率的影響 按照“2.1”項下方法操作，提取溫度為80℃，提取時間為2 h，料液比為1∶15，考察提取次數(shù) （1～5次）對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1A。

2.3.1.2提取時間對多糖得率的影響 固定提取溫度80℃，提取2次，料液比1∶15，考察提取時間 （1.5、2、2.5、3、3.5 h）對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1B。

2.3.1.3提取溫度對多糖得率的影響 固定提取次數(shù)2次，提取時間2 h，料液比1∶15，考察提取溫度 （60、70、80、90、100℃）對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1C。

2.3.1.4料液比對多糖得率的影響 固定提取溫度80℃，提取2次，每次2 h，考察料液比 （1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1D。

由圖可知，提取2次后，隨著提取次數(shù)的增加，多糖增加量變化不大，而且次數(shù)為非連續(xù)變量，故確定提取2次。提取時間在3 h前，多糖得率隨時間的增加而增加，3 h后趨于平衡。當(dāng)提取溫度達(dá)到90℃時，得率最大，隨著溫度進(jìn)一步增加，得率反而有所下降。當(dāng)料液比為1∶20前，得率隨加水量的增加而迅速增加，隨著加水量進(jìn)一步增加，得率變化不大。

圖1　各因素對多糖得率的影響Fig.1 Effects of various factors on the yield of polysaccharides

2.3.2正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取溫度 （A）、提取時間 （B）、料液比 （C）為變量，多糖得率為考察指標(biāo)，各因素設(shè)計3水平，采用L9（34）正交表設(shè)計并安排試驗，因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2　因素水平Tab.2 Factors and levels

表3　正交試驗結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal tests

表4　方差分析Tab.4 Analysis of variance

由表3可知，RA＞RC＞RB，即各因素對白附子多糖得率的影響程度依次為提取溫度＞料液比＞提取時間。表4顯示，提取溫度影響最大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），而提取時間和料液比的影響不顯著 （P＞0.05）。綜上所述，確定最佳提取工藝為A2B3C3，即稱取白附子粗粉5 g，加入藥材量25倍的水，90℃回流提取3.5 h。

2.3.3人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）分析與建模 由于具有三層結(jié)構(gòu)的（1個隱含層）BP-ANN已被證實能以任意精度逼近任何有理函數(shù)［15］，故本實驗以此來完成試驗數(shù)據(jù)的分析與建模，所用分析軟件為Mat1ab R2012a，結(jié)果見圖2。

圖2　BP-ANN結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of BP-ANN

2.3.3.1網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練 以正交試驗得到的9組數(shù)據(jù)為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)。

2.3.3.2網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與參數(shù) 以提取溫度（A）、提取時間 （B）、料液比 （C）為輸入數(shù)據(jù)，即輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)為3；以白附子多糖得率為輸出量，即輸出節(jié)點(diǎn)數(shù)為1。隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)按照經(jīng)典公式nh=計算，其中nh為隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)，n為輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)，m為輸出層節(jié)點(diǎn)數(shù)，a為 ［1，10］之間的常數(shù)。通過訓(xùn)練不同神經(jīng)元數(shù)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為10時，該網(wǎng)絡(luò)能達(dá)到一定的精確度，而且訓(xùn)練次數(shù)少，因此確定隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為10，其中訓(xùn)練函數(shù)為train1m，最大訓(xùn)練迭代次數(shù)為500，隱含層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為tansig，輸出層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為pure1in，其他各項參數(shù)為默認(rèn)值。

2.3.4利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型篩選最佳工藝 以正交試驗得到的數(shù)據(jù)為網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本值，以網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和實測值的誤差來評價模型的性能，發(fā)現(xiàn)實測值和預(yù)測值平均相對誤差小于1% （圖3），表明訓(xùn)練后的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測性能良好，可用于白附子多糖提取結(jié)果的預(yù)測。

在正交試驗的基礎(chǔ)上，對提取時間、提取溫度和料液比3個水平進(jìn)行任意組合，共列出27種可能的組合情況，以其作為輸入值，用已訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行仿真模擬，通過對比輸出值 （即白附子多糖得率），篩選出最佳提取工藝為提取時間3.5 h，提取溫度90℃，料液比1∶20，多糖得率達(dá)5.20%。正交試驗是采取部分試驗來代替全面試驗的方法，在減少試驗次數(shù)的同時，挑選出有代表性的試驗點(diǎn)來進(jìn)行試驗，通過對其結(jié)果的分析而得出結(jié)論［24］，而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在避免大量試驗的情況下，能仿真模擬所有試驗條件，最終能夠得出比正交試驗更為精確的結(jié)果。

2.3.5驗證試驗 以正交試驗和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最終得到的優(yōu)化條件為白附子多糖提取工藝參數(shù)，各平行5次。結(jié)果，在應(yīng)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化的提取工藝中，多糖得率與正交試驗結(jié)果基本一致，白附子多糖得率基本保持在5.15%，與預(yù)測值基本一致，RSD為1.23%，重復(fù)性較好，顯示BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模結(jié)合正交試驗優(yōu)化工藝參數(shù)的可行性。

圖3　實測值與預(yù)測值的比較Fig.3 Com parison of experimental values and predicted values

3　討論

本實驗通過單因素試驗，綜合考察了提取時間、提取溫度、提取次數(shù)以及料液比對白附子水溶性多糖得率的影響，并篩選出各因素正交試驗的取值水平。由于次數(shù)為非連續(xù)變量，考慮到產(chǎn)率和成本，故固定提取2次。然后，采用L9（34）正交試驗設(shè)計表對提取時間、提取溫度、料液比作進(jìn)一步優(yōu)化，再將所得數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入和輸出數(shù)據(jù)，進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模，通過訓(xùn)練得到3-10-1的網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu)，具有訓(xùn)練時間短，模型精度高，預(yù)測能力強(qiáng)，無需公式，操作簡單，能夠?qū)τ邢迋€不連續(xù)點(diǎn)的函數(shù)進(jìn)行逼近的優(yōu)點(diǎn)。

傳統(tǒng)的中藥提取工藝的優(yōu)化常采用正交試驗、均勻設(shè)計、星點(diǎn)試驗等［25-27］，但常需要大量的驗證性工作，并且存在優(yōu)化工藝參數(shù)不能反映多因素多水平間復(fù)雜的非線性關(guān)系。目前，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合多種傳統(tǒng)工藝的優(yōu)化方法能夠反映多因素多水平間的變化規(guī)律，在中藥工藝優(yōu)化方面應(yīng)用越來越廣泛。

用已建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對27種可能的提取條件組合進(jìn)行仿真模擬，以白附子多糖得率為考察指標(biāo)，篩選出最佳工藝。驗證試驗發(fā)現(xiàn)，試驗值與預(yù)測值基本一致，表明該方法可行，重復(fù)性較好，而且無需增加試驗次數(shù)，可為進(jìn)一步研究白附子多糖奠定一定的科學(xué)依據(jù)。

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Optim izing the extraction of polysaccharides from Typhonii Rhizoma by BP-ANN combined with orthogonal test

WU Na， ZHAO Chong-bo， HU Mei-bian， PENGWei， XIE Da-shuai， WU Chun-jie*

（College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

AIM To optimize the extraction of po1ysaccharides from TyphoniiRhizoma by back-propagation artificia1neura1network（BP-ANN）combined with orthogona1 test.METHODS For po1ysaccharides extracted by aqueous extraction-a1coho1 precipitation techno1ogy，the content was determined by pheno1-su1furic acid method. Based on sing1e factors experiments，the L9（34）orthogona1 testwas conducted to investigate the effects of extraction temperature，extraction time，and so1id-1iquid ratio on po1ysaccharides extraction yie1d.Subsequent1y，the extraction was optimized by BP-ANN.RESULTS Provided at a 5.20%high yie1d of po1ysaccharides，the best conditionswere thus determined to be 90℃for extraction temperature，3.5 h for extraction time，and 1∶20 for so1id-1iquid ratio.CONCLUSION The work proves that thismethod has good reproducibi1ity and the advantage with fewer test times.

Typhonii Rhizoma；po1ysaccharides；extraction；BP-ANN；orthogona1test

R284.2

A

1001-1528（2016）06-1248-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.010

2015-09-29

四川省教育廳科技基礎(chǔ)性工作專項分項目 （2014FY111100-4）

吳 娜 （1988—），女，碩士生，從事中藥炮制與制劑研究。Te1：（028）61801001，E-mai1：wunagood_2008@163.com

吳純潔 （1965—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥炮制與制劑研究。Te1：（028）61801001，E-mai1：wcj-one@ 263.net