趙 磊， 張啟立， 汪 潔， 夏 琦， 夏鵬飛， 張延英（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省高校中 ［藏］藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅省道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究與推廣工程實驗室，甘肅蘭州730000）

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中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化新大黃牡丹湯提取工藝

趙 磊， 張啟立， 汪 潔， 夏 琦， 夏鵬飛， 張延英*
（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省高校中 ［藏］藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅省道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究與推廣工程實驗室，甘肅蘭州730000）

目的 優(yōu)選新大黃牡丹湯 （大黃、丹皮、桃仁等）的提取工藝。方法 在單因素、析因設(shè)計、最速上升試驗的基礎(chǔ)上，以浸膏得率與總蒽醌得率的權(quán)重和為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選新大黃牡丹湯提取工藝。結(jié)果 最佳條件為回流提取60min，提取溶劑為40%乙醇，料液比為1∶40。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確有效，簡便可行，預(yù)測性良好。

新大黃牡丹湯；提取工藝；中心復(fù)合設(shè)計-響應(yīng)面法

大黃牡丹湯載于 《金匱要略·瘡癰腸癰浸淫病脈證并治》篇，由大黃、丹皮、桃仁、冬瓜仁、芒硝等5味藥物組成［1-3］，具有瀉熱破瘀，散結(jié)消腫的功效，傳統(tǒng)用于濕熱蘊結(jié)、氣血凝滯所致腸癰等癥，為瀉下、清利、破瘀為一體的有效方劑。通過對復(fù)方藥味隨癥加減，可以加強、削弱或改變?nèi)阶饔?，更加適合病情的需要［4］?，F(xiàn)代醫(yī)家在大黃牡丹湯原方的基礎(chǔ)上，加入黃柏、黃芪和丹參3味藥組成新大黃牡丹湯，增強了原方清熱解毒，活血化瘀的功效，新增補氣固表、托毒排膿、養(yǎng)血安神之功，更加有利于患者的術(shù)后恢復(fù)［5-6］，因其良好的效果在我校附屬醫(yī)院臨床得到了廣泛使用。為了更好地開發(fā)利用大黃牡丹湯，本實驗選擇浸膏得率與總蒽醌得率的 “權(quán)重和”為響應(yīng)值，在單因素考察的基礎(chǔ)上，結(jié)合析因設(shè)計與最速上升試驗，采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化新大黃牡丹湯的提取工藝，旨在為其進一步合理研究及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

1.1儀器 UV-2401PC紫外分光光度計（日本島津公司）；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BT125D電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；HH-S28s數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市大地自動化儀器廠）。

1.2試藥 1，8-二羥基蒽醌 （批號0829-9702，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院。水為超純水；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1浸膏得率的測定方法 精密稱定新大黃牡丹湯組方藥物，精密加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，稱定質(zhì)量，回流提取，放至室溫，提取溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，精密量取續(xù)濾液100 m L，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，置于干燥器中冷卻至室溫，精密稱定質(zhì)量，以此計算浸膏得率，并作為測定總蒽醌得率的原料。

2.2總蒽醌得率的測定方法［7-9］

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的1，8-二羥基蒽醌對照品，加95%乙醇制成每1 m L含1，8-二羥基蒽醌0.0172 mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方藥物，精密加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，回流提取60 min，放至室溫，補足質(zhì)量，抽濾，濾液濃縮至干，計算浸膏得率。從中精密稱取一定量浸膏粉末，加入95%乙醇溶液3 m L，超聲處理20 min，濾過，殘渣再加95%乙醇3 mL溶液，超聲處理20 min，濾過，合并兩次濾液，搖勻。精密量取1.5 mL，置于10 mL量瓶中，95%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3檢測波長的確定 取供試品與對照品溶液各約4 mL，以95%乙醇為空白對照，在紫外分光光度計上于200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，1，8-二羥基蒽醌的最大吸收波長為224.5 nm，而供試品為219.5 nm，均在 （222±3）nm范圍內(nèi)，而且周圍無干擾峰，故實驗選擇224 nm作為檢測波長，結(jié)果見圖1。

圖1　紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectrum

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取上述對照品溶液0.9、1.2、1.4、1.5、1.8、2.1 mL，分別置于10 mL量瓶中，95%乙醇定容至刻度，搖勻。以95%乙醇為空白對照，于224 nm波長處測定其吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y= 15.883X+0.085 3，r=0.997，表明對照品在15.48～36.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，在224 nm波長下連續(xù)測定6次，測得吸光度RSD為0.65%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗 吸取供試品溶液4 mL，分別于0、2、4、6、8、10、12 h，在224 nm波長下測定吸光度，測得吸光度RSD為0.89%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗 精密稱取同一批復(fù)方藥物6份，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，計算浸膏、總蒽醌得率以及權(quán)重和，測得 RSD為1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4加樣回收試驗 精密稱取總蒽醌含有量已知的浸膏粉末9份，每份0.006 4 g，精密加入1.8-二羥基蒽醌對照品 （相當(dāng)于浸膏粉末中總蒽醌含有量的80%、100%、120%），按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在224 nm波長下測定吸光度，計算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為100.06%，RSD為0.986 7%（n=9），符合相關(guān)要求。

2.4大黃牡丹湯新組方提取工藝的優(yōu)化

2.4.1單因素試驗 篩選乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間及料液比等因素的水平范圍，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）、提取時間（30、45、60、75 min）及料液比 （1∶10、1∶20、1∶30、1∶40）對浸膏及總蒽醌得率權(quán)重和 （權(quán)重和=浸膏得率×60%+總蒽醌得率×40%，下同）的影響，結(jié)果見圖2。

由圖可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時，浸膏得率較低，權(quán)重和較小，故選擇在40%～60%之間。在30～50 min提取時間內(nèi)，兩者得率隨時間延長而增加，而50 min與60 min時對結(jié)果影響較小，為全面考察提取時間對其的影響，故選擇在30～60 min。料液比1∶10與1∶40對兩者得率影響較大，故選擇1∶20～1∶30作為考察區(qū)間。綜合考慮，得出各因素水平范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～60%，提取時間30～60min，料液比1∶20～1∶30。

2.4.2二級全析因設(shè)計［10］析因設(shè)計可以有效控制或消除其他混雜因素對反應(yīng)變量的干擾，分析更準(zhǔn)確，能同時研究幾個因素之間的交互作用，使分析結(jié)果更可靠和穩(wěn)定，為選擇最優(yōu)處理組合提供科學(xué)依據(jù)。以浸膏得率為考察指標(biāo)，篩選對復(fù)方藥物提取率有顯著影響的因素，試驗安排及結(jié)果見表1及表2。由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比，對浸膏得率有顯著性影響 （P＜0.05），而提取時間為非顯著性影響因素 （P＞0.05），故將提取時間確定為60 min，對乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比兩個因素進行優(yōu)化。

圖2　單因素試驗結(jié)果Fig.2 Results of single factor tests

表1　析因設(shè)計及結(jié)果Tab.1 Factorial design and results

2.4.3最速上升試驗［11-13］最速上升試驗是沿著最速上升路徑及響應(yīng)有最大增量的方向逐步移動的方法。根據(jù)析因設(shè)計結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）與料液比 （B）試驗，以浸膏與總蒽醌得率的權(quán)重和為評價指標(biāo)，確定兩者的基本步長分別為5%與1∶5，試驗設(shè)計和結(jié)果見表3。由表可知，權(quán)重和最高值在第3組 （浸膏得率29.21%，總蒽醌得率1.178 1%），故將其作為響應(yīng)面試驗的中心實驗點。

表2　方差分析Tab.2 Analysis of variance

表3　最速上升設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Steepest ascent design and results

2.4.4中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)最速上升試驗確定的響應(yīng)面實驗中心點，以浸膏與總蒽醌得率的權(quán)重和為評價指標(biāo)進行設(shè)計，Design Expert8.0軟件對結(jié)果進行分析處理，因素和水平見表4，設(shè)計和結(jié)果見表5。

表4　因素和水平Tab.4 Factors and levels

表5　設(shè)計和結(jié)果Tab.5 Design and results

利用Design Expert軟件，對表5數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得回歸方程Y=0.17-7.466×10-3A+ 0.029B-0.033AB，（r=0.914 9，P＜0.000 1）。

根據(jù)確立的多項式模型，繪制乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對綜合評分的二維等高線圖和三維效應(yīng)曲面圖，并優(yōu)選兩個因素的最佳取值范圍，結(jié)果見圖3。

圖3　等高線圖和效應(yīng)曲面圖Fig.3 Contour m ap and response surface graph

由圖可知，最佳提取條件為回流提取，提取時間60 min，提取溶劑40%乙醇，料液比1∶40。然后進行驗證實驗，平行3次，浸膏與總蒽醌平均得率分別為37.43%和1.31%，權(quán)重和為0.23，預(yù)測值為0.239 2，RSD為2.77%，表明模型預(yù)測性良好，提取條件重復(fù)性理想。

3　討論

新大黃牡丹湯方中，大黃具有瀉熱逐瘀，蕩滌腸中熱毒瘀滯的功效，為原方君藥［14］。藥理學(xué)研究表明，大黃中的蒽醌類成分具有抗腫瘤、抗衰老、增加消化及免疫功能等作用［15］，是主要藥效物質(zhì)。浸膏得率能夠較為綜合地反映提取工藝的優(yōu)劣，故本實驗選擇物理指標(biāo) （浸膏得率）和化學(xué)指標(biāo) （總蒽醌得率）的權(quán)重和作為評價指標(biāo)，首先通過單因素試驗篩選乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間及料液比3個因素的水平范圍，再采用析因設(shè)計確定顯著性因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比，接著通過最速上升試驗確定兩者合適的取值，最后以此為中心實驗點，中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化這兩個參數(shù)，得到最佳提取條件為回流提取，提取時間60 min，提取溶劑40%乙醇，料液比1∶40。

在提取工藝優(yōu)化過程中，中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法能夠克服正交設(shè)計、均勻設(shè)計預(yù)測性較差、精確度不高的缺點，通過非線性模型擬合來預(yù)測最佳實驗條件，使得工藝得到最大程度的優(yōu)化。本實驗采用中心組合設(shè)計對新大黃牡丹湯的提取工藝進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)預(yù)測值與實測值相對偏差較小，可為其開發(fā)利用奠定實驗基礎(chǔ)。

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Optim izing the extraction of modified Dahuang M udan Decoction by central com posite design-response surfacemethod

ZHAO Lei， ZHANG Qi-1i， WANG Jie， XIA Qi， XIA Peng-fei， ZHANG Yan-ying*
（Gansu University ofChineseMedicine，Gansu Provincial Key College Laboratory for Chemistry and Quality of TraditionalChineseMedicines，Gansu Province Engineering Laboratory for TCM Standardization Technology and Popularization，Lanzhou 730000，China）

modified Dahuang Mudan Decoction；extraction；centra1composite design-response surfacemethod

R284.2

A

1001-1528（2016）06-1265-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.013

2015-09-01

甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項 （1305TCYA043）；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項目 （GZK-2014-77）；蘭州市科技局科研項目（2013-3-45）

趙 磊 （1967—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Te1：（0931）8762539，E-mai1：zzyhx@gszy.edu.cn

張延英 （1964—），男，碩士，副教授，研究方向為實驗動物學(xué)。E-mai1：zq17751990@126.com