米建萍， 龐 倩， 徐遠金*（1.北海市疾病預(yù)防控制中心，廣西北海536000；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004；3.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004）

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［質(zhì) 量］

UHPLC-MS/MS法同時測定蒲地藍消炎片中10種成分

米建萍1，2， 龐 倩2，3， 徐遠金2，3*
（1.北海市疾病預(yù)防控制中心，廣西北海536000；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004；3.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004）

目的 建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （UHPLC-MS/MS）法同時測定蒲地藍消炎片 （蒲公英、黃芩、苦地丁和板藍根）中腺苷、表告依春、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、紫堇靈、乙酰紫堇靈、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素的含有量。方法 分析采用Ec1ipse P1us C18RRHD色譜柱（1.8μm，2.1mm×50mm）；流動相為乙腈-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脫；體積流量為0.3 mL/min。結(jié)果 10種成分分別在0.000 050 0～1.00、0.010 0～5.00、0.015 0～10.0、0.030 0～20.0、0.100～100、0.000 300～10.0、0.003 00～10.0、0.000 600～20.0、0.200～20.0、0.000 500～5.00mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率在91.4%～105.0%之間，RSD均小于2.0%。結(jié)論 該方法快速、簡便、靈敏，適用于蒲地藍消炎片的質(zhì)量控制。

蒲地藍消炎片；化學(xué)成分；UHPLC-MS/MS

蒲地藍消炎片由蒲公英、黃芩、苦地丁和板藍根4種中藥組成，主要功效為清熱解毒，抗炎消腫，用于治療癤腫、咽炎、扁桃腺炎，腮腺炎等。方中蒲公英性寒，味苦、甘，有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋等功效；黃芩有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，用于治療濕溫、暑濕、胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動不安；板藍根具有清熱解毒、涼血消腫、利咽之功效，用于治療溫疫時毒、發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑、痄腮、丹毒、臃腫瘡毒等；苦地丁清熱解毒、消癰腫，主治流行性感冒、上呼吸道感染、扁桃體炎、傳染性肝炎、腸炎、腎炎、瘰疬、腮腺炎、結(jié)膜炎、急性闌尾炎及疔瘡癰腫等［1］。

已有文獻報道，黃芩中的黃酮［2-3］、蒲公英中的酚酸和黃酮［4-5］、苦地丁中的生物堿［6］、板藍根中的腺苷和表告依春［7-8］等為主要活性物質(zhì)。現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)常用HPLC法進行中藥質(zhì)量控制指標(biāo)的單一含有量分析，沒有多種有效成分同時測定的方法。蒲地藍制劑相關(guān)文獻大多集中在臨床使用及療效觀察方面，鮮有成分測定的報道，胡冰［9］采用測定了腺苷的含有量，邵禮梅等［10］對黃芩苷和黃芩素進行了測定，湯道權(quán)等［11］測定了黃芩苷的含有量，劉德勝等［12］對不同制劑中咖啡酸和綠原酸的含有量進行了測定，覃華亮［13］建立了測定紫堇靈含有量的方法，但同時測定多種成分的文獻［14-15］較少，也尚無液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法的報道。本實驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）法同時測定蒲地藍消炎片中腺苷、表告依春、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、紫堇靈、乙酰紫堇靈、芹菜素、黃芩素和漢黃岑素，其簡便快速，已用于實際樣品的分析。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑 Agi1ent 1290 Infinity LC System、

Agi1ent6460 Trip1e Quad LC/MS儀（美國Agi1ent公司）；Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)（美國Mi11ipore公司）；ME2355、CPA2245電子天平（德國Sartorius公司）；KQ2200DV數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司，100W，40 kHz）。

腺苷 （批號110879-200202）、咖啡酸 （批號110885-200102）、阿魏酸 （批號 110773-200611）對照品 （中國食品藥品檢定研究院，含有量≥98%）；芹菜素對照品 （批號101207，四川省維克奇生物科技有限公司，含有量≥98%）；表告依春（批號130816）、綠原酸 （批號121125）、紫堇靈（批號130604）、乙酰紫堇靈 （批號130604）、黃芩素 （批號130119）、漢黃芩素 （批號131121）對照品 （成都菲普德生物科技有限公司，含有量≥98%）。甲醇、乙腈為色譜純 （美國Fisher公司）；甲酸為分析純 （廣東光華科技股份有限公司）；乙酸為分析純 （上海申博化工有限公司）；實驗用水為超純水。

1.2溶液配制

1.2.1對照品貯備液 精密稱取腺苷、表告依春、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、紫堇靈、乙酰紫堇靈、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素對照品各10.0 mg，甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，配成1.00 mg/mL貯備液，4℃下保存。使用前，50%甲醇溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2.2樣品溶液 取蒲地藍消炎片適量，除去糖衣，取內(nèi)容物研磨粉碎，混勻。精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶液搖勻，超聲60 min，靜置，冷卻后取適量上清液，12 000 r/min離心10 min，稀釋10倍，0.22μm微孔濾膜過濾，進樣測定。

1.3色譜條件 Ec1ipse P1us C18RRHD色譜柱（1.8μm，2.1 mm×50 mm）；流動相乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～1 min，95%B；1～5 min，95%～80%B；5～9 min，80% B；9～10 min，80% ～75%B；10～15 min，75%～60%B；15～17 min，60%～0%B）；體積流量0.3 mL/min；進樣量1μL。

1.4質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源 （ESI），正、負離子快速切換多重反應(yīng)監(jiān)測模式 （MRM）監(jiān)測；干燥氣體 N2，溫度300℃，體積流量10 L/min；霧化氣體N2，霧化器壓力2.8×105Pa；鞘氣氣體N2，溫度360℃，體積流量12 L/min；毛細管電壓4 000 V。

2　結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜行為 在選定的條件下，根據(jù)峰保留時間及質(zhì)譜信息進行定性與定量分析。結(jié)果見圖1。

2.2線性關(guān)系及檢出限 取各對照品貯備液，精密配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于優(yōu)化條件下進樣測定，重復(fù)3次，以峰面積 （Y）對質(zhì)量濃度 （X）進行回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，信噪比 （S/N）等于3時對應(yīng)成分的質(zhì)量濃度作為其檢出限，具體見表1，表明各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3精密度試驗 取同一批次樣品6份，制備樣品提取液，在優(yōu)化條件下測得各成分的平均含有量分別為 0.560 6、0.031 7、0.677 7、0.601 2、0.148 0、0.239 4、0.031 8、0.008 2、9.844 8、1.591 2 mg/g，RSD為0.33%～2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗 取同一批次樣品，制備樣品提取液，在0、2、4、6、8、10 h于優(yōu)化條件下測得RSD為0.7%～2.3%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1　回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and detection lim its

圖1　MRM色譜圖Fig.1 M ultip le reaction monitoring（M RM）chrom atogram s

2.5回收率試驗 精密稱取各成分含有量已知的的同批次樣品0.5 g，共9份，每組3份，按高、中、低3個梯度分別加入不同量的對照品，按“1.2.2”項下方法制備樣品溶液并進行測定，結(jié)果見表2。

表2　加樣回收率試驗結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of recovery tests（n=3）

2.6含有量測定 精密稱取4批樣品，每批3份，按照優(yōu)化的提取方法和條件計算各成分的含有量，結(jié)果見表3。

表3　含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.3 Results of content determ ination（mg/g）

3　討論

3.1色譜條件的優(yōu)化 實驗發(fā)現(xiàn)，在流動相中添加低質(zhì)量濃度的有機酸有利于各成分的分離，并且峰形對稱；在流動相中添加甲酸時，能大幅度提高咖啡酸和綠原酸的檢測靈敏度，但降低了其他成分的靈敏度；添加乙酸時，兩者靈敏度隨乙酸用量增加而提高。

另外，還對常用流動相甲醇-0.2%乙酸水溶液和乙腈-0.2%乙酸水溶液體系進行了考察，發(fā)現(xiàn)使用甲醇體系時，綠原酸、咖啡酸的靈敏度明顯提高，但其他成分的靈敏度有所降低。綜合考慮各成分的分離效果、檢測靈敏度、色譜峰峰形等因素，選擇乙腈-0.2%乙酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫。

3.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化 根據(jù)不同物質(zhì)，先選擇正負離子反應(yīng)模式，得到二級質(zhì)譜特征離子圖，見圖2。再采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式 （MRM），分別對各對照品的母離子進行二次碎裂，對選定的子離子優(yōu)化源內(nèi)碎裂電壓、碰撞能量和加速電壓，優(yōu)化結(jié)果見表4。

圖2　二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectra

表4　質(zhì)譜參數(shù)Tab.4 M S parameters

3.3樣品提取方法 取蒲地藍消炎片適量，除去糖衣，研碎，混勻，稱取0.5 g，置于不同具塞錐形瓶中，分別加入50 mL乙醇、50%乙醇、乙腈、50%乙腈、甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水，密閉搖勻，超聲60 min。靜置，取上清液，12 000 r/min離心10 min，稀釋10倍，0.22μm微孔濾膜過濾，進樣測定。同時，還考察了15、30、45、60、90、120 min提取時間對提取效果的影響。最終，本實驗選擇50%甲醇，超聲60 min提取樣品。

4　結(jié)論

UHPLC-MS/MS結(jié)合了UHPLC分離度高、分析速度快，以及MS定性能力強、靈敏度高的優(yōu)點，對中藥及其制劑等復(fù)雜體系和樣品的分析具有明顯優(yōu)勢，為中藥成分分析、質(zhì)量控制及藥代動力學(xué)研究提供了高效可靠的方法，已得到廣泛應(yīng)用。

本實驗建立了UHPLC-MS/MS法同時測定蒲地藍消炎片中腺苷、表告依春、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、紫堇靈、乙酰紫堇靈、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素10種有效成分含有量的分析方法，其簡便、快速、靈敏度高，可用于該藥物的質(zhì)量控制。

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Simultaneous determ ination of ten constituents in Pudilan Xiaoyan Tablets by UHPLC-MS/MS

MIJian-ping1，2， PANG Qian2，3， XU Yuan-jin2，3*
（1.BeihaiMunicipal Center for DiseaseControland Prevention，Beihai536000，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530004，China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

AIM To estab1ish an u1tra performance 1iquid chromatography with tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）method for the simu1taneous determination of adenosine，epigoitrin，caffeic acid，ch1orogenic acid，feru1ic acid，coryno1ine，acety1coryno1ine，apiginin，baica1ein and wogonin in Pudi1an Xiaoyan Tab1ets（TaraxaciHerba，Scutellariae Radix，Corydalis Bungeanae Herba and IsatidisRadix）.METHODS The ana1ysiswas performed on an Ec1ipse P1us C18RRHD co1umn（1.8μm，2.1mm×50mm），with amobi1e phase comprising of acetonitri1e-0.2%acetic acid aqueous so1ution in a gradient e1ution manner，at a f1ow rate of 0.3 mL/min.RESULTS Ten constituents showed good 1inear re1ationships within the ranges of 0.000 050 0-1.00 mg/L，0.010 0-5.00 mg/L，0.015 0-10.0 mg/L，0.030 0-20.0 mg/L，0.100-100 mg/L，0.000 300-10.0 mg/L，0.003 00-10.0 mg/L，0.000 600-20.0 mg/L，0.200-20.0 mg/L and 0.000 500-5.00 mg/L，respective1y，whose average recoveries were 91.4%-105.0%with the RSDs of 1ess than 2.0%. CONCLUSION This rapid，simp1e and sensitivemethod suits the qua1ity contro1of Pudi1an Xiaoyan Tab1ets. KEYWORDS：Pudi1an Xiaoyan Tab1ets；chemica1constituents；UHPLC-MS/MS

R927.2

A

1001-1528（2016）06-1269-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.014

2015-08-07

國家自然科學(xué)基金項目 （21264003）

米建萍（1972—），女，碩士，副主任技師，從事理化檢驗工作。Te1：13507796184，E-mai1：mjp100@sina.com

徐遠金 （1964—），男，博士，教授，從事色譜分析方法研究。Te1：（0771）3237743，E-mai1：yjxu@gxu.edu.cn