胡 攀， 夏厚林， 文冰杰， 李瑞煜， 楊孟妮， 張 慧（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137）

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HPLC-DAD法和一測多評(píng)法同時(shí)測定安息香中4種成分

胡 攀， 夏厚林*， 文冰杰， 李瑞煜， 楊孟妮， 張 慧
（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137）

目的 建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法和一測多評(píng)（QAMS）法同時(shí)測定安息香Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯以及苯甲酸芐酯的含有量。方法 HPLC-DAD法同時(shí)測定4種成分含有量，計(jì)算苯甲酸松柏酯與其他3種成分的相對(duì)校正因子，考察相對(duì)保留時(shí)間法和線性回歸法對(duì)色譜峰定位的影響，并比較這兩種方法的重復(fù)性。結(jié)果 15批樣品中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸芐酯的含有量分別為0.692%～2.621%、2.944%～15.628%、12.649%～62.589%、0.514%～2.034%，線性回歸法較相對(duì)保留時(shí)間法更準(zhǔn)確，3個(gè)相對(duì)校正因子重復(fù)性良好，兩種方法無顯著差異。結(jié)論 一測多評(píng)法可用于測定安息香中的總香脂酸類成分。

安息香；香草醛；苯甲酸；苯甲酸松柏酯；苯甲酸芐酯；HPLC-DAD；一測多評(píng)

安息香Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.為芳香開竅藥，具有開竅醒神、行氣活血、止痛之功效，用于治療中風(fēng)痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、心腹疼痛、產(chǎn)后血暈、小兒驚風(fēng)等癥狀［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，其有抗炎解熱［2］、腦缺血缺氧保護(hù)、促進(jìn)血腦屏障通透性［3-5］、抗腫瘤［6］等作用。

安息香為樹脂類藥材，其主要成分為總香脂酸，如香草醛、苯甲酸、苯甲酸芐酯、苯甲酸松柏酯等［7-8］。目前，各國藥典對(duì)該藥材的質(zhì)量控制均以總香脂酸為主要指標(biāo)，如 《歐洲藥典》（第7版）、《印度藥典》（2010版）均采用滴定法測定其含有量；《中國藥典》2005版采用重量法測定其含有量，而2010版和2015版均測定水解后苯甲酸含有量。

香草醛又名香蘭素，為安息香中主要的香味成分，亦為傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別的重要?dú)馕侗鎰e物；苯甲酸又名安息香酸，多國藥典均以其為定性鑒別或含有量測定指標(biāo)；苯甲酸松柏酯及苯甲酸芐酯均為安息香中重要的總香脂酸酯類成分，水解后均能產(chǎn)生苯甲酸及其他物質(zhì)，而且含有量相對(duì)較高［9］。以上成分除苯甲酸外［10］，目前均未見測定的報(bào)道，而且苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯暫無法定對(duì)照品，而采用一測多評(píng)法可以減少對(duì)照品的使用量，節(jié)約成本。因此，本實(shí)驗(yàn)先以高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法開展以上4種成分含有量測定方法的研究，再以主要活性成分苯甲酸松柏酯［11］為內(nèi)參物，采用一測多評(píng)法來同步測定安息香中多個(gè)總香脂酸成分含有量，并將兩種方法進(jìn)行比較。

1　材料與儀器

1.1藥材 安息香由荷花池專業(yè)市場、四川科倫藥業(yè) （批號(hào)141201）以及成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為安息香科植物白花樹Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.的干燥樹脂。

1.2對(duì)照藥材及對(duì)照品 安息香對(duì)照藥材、苯甲酸、香草醛對(duì)照品 （中國食品藥品檢定研究院，批 號(hào) 分 別 為121186-201302、100419-201302、110501-201102）；苯甲酸芐酯對(duì)照品 （德國 Dr. Ehrenstorfer公司，批號(hào)20102）；苯甲酸松柏酯（自制，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR譜鑒定，含有量大于99%）。

1.3儀器與試劑 Agi1ent 1200高效液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Agi1ent Chem Station色譜數(shù)據(jù)工作站 （美國安捷倫公司）；SSI Series 1500高效液相色譜儀 （美國SSI公司）；SK-5200H超聲波清洗器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；XP205電子分析天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純 （美國Fisher公司）；磷酸為優(yōu)級(jí)純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Waters XBridgeTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）；體積流量1.0 mL/min，梯度洗脫 （程序見表1）；柱溫30℃；檢測波長230 nm。結(jié)果見圖1。

表1　梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program s

圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.2對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸芐酯對(duì)照品適量，加甲醇制成含香草醛0.928 mg/mL、苯甲酸0.969 5 mg/mL、苯甲酸松柏酯3.277 mg/mL、苯甲酸芐酯0.415 5 mg/m L的對(duì)照品貯備液，置于冰箱中冷藏保存。再分別吸取適量，乙腈∶水 （50∶50）稀釋，制成含香草醛46.40μg/mL、苯甲酸96.95μg/mL、苯甲酸松柏酯327.70μg/mL、苯甲酸芐酯41.55μg/m L的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取安息香粉末（過3號(hào)篩）0.1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20mL，超聲提取30min，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，少量甲醇多次洗滌，洗液合并，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍考察 精密量取混合對(duì)照品溶液20、15、10、8、5、2、1μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，每個(gè)進(jìn)樣量進(jìn)樣3次，記錄峰面積，并取平均值。以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），樣品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2，表明在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2　4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.2 Standardcurvesoffourconstituents

2.4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μL，進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯RSD分別為0.94%、1.11%、1.06%、0.96%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、6、12、24、48h進(jìn)樣分析。結(jié)果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯RSD分別為1.81%、2.04%、1.91%、2.79%，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取安息香0.1g，共6份，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯含有量 RSD分別為1.56%、2.64%、1.75%、2.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率 精密稱取藥材0.05g，共6份，分別精密加入香草醛1.5mL、苯甲酸芐酯1mL。再精密稱取同一批安息香0.01g，共6份，分別精密加入苯甲酸1.5mL、苯甲酸松柏酯0.5mL，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 （溶劑加入量為原加入量的1/5）進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

2.5 “一測多評(píng)”耐用性和專屬性考察

2.5.1相對(duì)校正因子計(jì)算 參照文獻(xiàn) ［12］的方法，以公式fk/s=（Ws×Ak）/（Wk×As）計(jì)算相對(duì)校正因子，待測成分的量以公式W′k=（Ws× A′k）/（fk/s×As）計(jì)算。其中，fk/s為相對(duì)校正因子，Ws為內(nèi)標(biāo)物含有量，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為其他對(duì)照組分含有量，Ak為對(duì)照組分的峰面積，W′k為待測組分含有量，A′k為待測組分的峰面積。以苯甲酸松柏酯為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算對(duì)香草醛、苯甲酸、苯甲酸芐酯的校正因子，結(jié)果見表4。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Resultsofrecoverytests

表4　相對(duì)校正因子Tab.4 Relativecorrectionfactors

2.5.2待測色譜峰的定位 以苯甲酸松柏酯為內(nèi)參峰，分別測得香草醛、苯甲酸、苯甲酸芐酯的平均相對(duì)保留時(shí)間為0.269、0.369、1.202。

線性回歸色譜峰定位法［13-14］以Agi1ent1200儀器使用的Waters柱為標(biāo)準(zhǔn)柱，選擇苯甲酸和苯甲酸松柏酯的保留時(shí)間作為橫坐標(biāo) （A），對(duì)應(yīng)其他儀器及色譜柱苯甲酸和苯甲酸松柏酯的保留時(shí)間為縱坐標(biāo) （B）繪制回歸方程，進(jìn)行相應(yīng)色譜峰定位。結(jié)果見表5。

表5　色譜峰定位結(jié)果Tab.5 Results of chromatographic peak positioning

2.6HPLC-DAD法與一測多評(píng)法比較 吸取對(duì)照品及供試品溶液各10μL（個(gè)別批次稀釋后測定），注入HPLC色譜儀測定。HPLC-DAD法和一測多評(píng)法計(jì)算藥材中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯及苯甲酸芐酯含有量，結(jié)果見表6。

表6　測定結(jié)果比較 （%）Tab.6 Com parison of determ ination results（%）

測定結(jié)果用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行比較，測得香草醛的相對(duì)誤差為-0.98%～0%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為0.999 982；苯甲酸相對(duì)誤差為0.90%～3.49%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為0.999 920；苯甲酸芐酯相對(duì)誤差為-0.70%～0%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為 0.999 946；總量相對(duì)誤差為 0.15% ～1.00%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為0.999 982，表明兩種方法無顯著差異。

3　討論

苯甲酸松柏酯為安息香中重要的活性成分［9］，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其含有量可達(dá)15%以上，經(jīng)初步試驗(yàn)表明，其顏色在一定條件下由白色逐漸變深，與《中國藥典》2015版記載安息香藥材斷面為白色，放置后逐漸變?yōu)榈S色至紅棕色［1］基本一致，因此，以苯甲酸松柏酯為指標(biāo)來控制安息香藥材質(zhì)量具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC-DAD法同時(shí)測定了安息香中4個(gè)總香脂酸類成分的含有量，發(fā)現(xiàn)香草醛在0.714%～2.62%之間，苯甲酸在2.94%～15.63%之間，苯甲酸松柏酯在12.65%～62.59%之間，苯甲酸芐酯在0.474%～2.03%之間。隨著存放年限的增加，15批樣品中苯甲酸含有量逐漸升高，而苯甲酸松柏酯降低。因此，控制安息香質(zhì)量采用多指標(biāo)時(shí)更能反應(yīng)該藥材的真實(shí)情況。

在一測多評(píng)法研究中，本實(shí)驗(yàn)考察了相對(duì)校正因子法和斜率校正法［10-11］，發(fā)現(xiàn)前者計(jì)算結(jié)果與HPLC-DAD法基本一致，而后者誤差較大，故采用相對(duì)校正因子法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

另外，還考察了Agi1ent1200和SSISeries1500兩種HPLC系統(tǒng)，以及4根色譜柱，同時(shí)在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了復(fù)核實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，苯甲酸松柏酯對(duì)香草醛、苯甲酸和苯甲酸芐酯的平均相對(duì)校正因子分別為1.09、1.10和1.05，RSD分別為3.41%、3.63%和2.32%，表明以苯甲酸松柏酯為內(nèi)參物所測定的相對(duì)校正因子較為穩(wěn)定，一測多評(píng)法具有可行性。

經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，一測多評(píng)法與HPLC-DAD法測定結(jié)果無顯著差異，表明一測多評(píng)法可用于安息香中總香脂酸的質(zhì)量控制。另外，該方法可降低檢測成本和時(shí)間，而且苯甲酸松柏酯作為內(nèi)參物具有專屬性，能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)對(duì)照品在同一波長下對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行同時(shí)測定，能夠滿足基層藥檢的需求。在實(shí)際應(yīng)用中，可視具體情況選擇HPLC-DAD法或一測多評(píng)法。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究了保留時(shí)間差法、相對(duì)保留時(shí)間法以及線性回歸色譜峰定位法來對(duì)待測色譜峰進(jìn)行定位。結(jié)果表明，保留時(shí)間差法在不同色譜柱重復(fù)性較差；相對(duì)保留時(shí)間法能夠進(jìn)行色譜峰定位；線性回歸色譜峰定位法最為準(zhǔn)確，但需使用2種對(duì)照品，與一測多評(píng)的初衷不符，而且相對(duì)保留時(shí)間法結(jié)合色譜圖及紫外吸收特征，也能準(zhǔn)確進(jìn)行色譜峰定位。因此，可優(yōu)先采用相對(duì)保留時(shí)間法，若該方法不能準(zhǔn)確定位色譜峰，則可進(jìn)一步考慮線性回歸色譜峰定位法。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出社，2010：138

［2］雷 玲，王 強(qiáng)，白筱璐，等.安息香的抗炎解熱作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（2）：109-110.

［3］黃 萍，賈 芳，黃小燕，等.安息香配伍合成冰片對(duì)小鼠腦缺血缺氧及血腦屏障通透性的影響［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（5）：75-78.

［4］倪彩霞，曾 南，湯 奇，等.芳香開竅藥對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血腦屏障通透性的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2639-2640.

［5］楊 洋，王世祥，房敏峰，等.安息香醛、香草醛和β-細(xì)辛醚對(duì)P-糖蛋白功能的影響［J］.中成藥，2012，34（7）：1364-1366.

［6］王 峰.安息香和乳香化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究［D］.沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2007.

［7］婁方明，李群芳，邱維維.氣質(zhì)聯(lián)用分析安息香的揮發(fā)性成分［J］.中成藥，2010，32（10）：1829-1831.

［8］于黎明，薛恒躍，王玉蘭，等.HPLC法測定安息香總香脂酸中苯甲酸的含量［J］.中藥材，2002，25（11）：798-799.

［9］Leffemberg C，Gautier A，Oh1eyer E.Enzymatic preparation of conifera1dehyde from Coniferyl Benzoate ex.Siam Benzoin［J］. Appl Biochem Biotech，1992，37（1）：43-52.

［10］黃立華，夏厚林，程 軍，等.不同產(chǎn)地安息香苯甲酸含量比較［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35（4）：358-360.

［11］JakubasW J，Gu11ion GW.Conifery1benzoate in quaking aspen A ruffed grouse feeding deterrent［J］.JChem Ecol，1990，16（4）：1077-1087.

［12］王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評(píng)”法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928.

［13］許 佳，金紅宇，孫 磊.替代對(duì)照品法測定龍血竭原料中龍血素A和B的含量［J］.藥物分析雜志，2011，31（11）：2058-2062.

［14］何 兵，楊世艷，張 燕.一測多評(píng)中待測成分校正和定位的新方法研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（12）：1653-1659.

Simultaneous determ ination of four constituents in Styrax tonkinensis by HPLCDAD and QAMS

HU Pan， XIA Hou-1in*， WEN Bing-jie， LIRui-yu， YANGMeng-ni， ZHANG Hui
（Schoolof Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory for Standardization ofChineseMateria Medica，Ministry of Education，Chengdu 611137，China）

AIM To estab1ish high performance 1iquid chromatography with diode array detection（HPLCDAD）and quantitative ana1ysisofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）methods for the simu1taneous determination of contents of vani11in，benzoic acid，conifery1benzoate and benzy1benzoate in Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart..METHODS HPLC-DAD was app1ied to simu1taneous1y determining the contents of these four constituents.The re1ative correction factors of conifery1benzoate to another three constituentswere ca1cu1ated.The effects of re1ative retention time and 1inear regression methods on positioning chromatographic peakswere investigated.And the reproducibi1itieswere then compared.RESULTS In fifteen batches of samp1es，the contents of vani11in，benzoic acid，conifery1 benzoate and benzy1 benzoate were 0.692%-2.621%，2.944%-15.628%，12.649%-62.589%and 0.514%-2.034%，respective1y.Linear regression method showed its superioty in accuracy as compared with re1ative retention time method.The reproducibi1ities of three re1ative correction factors were good.And these twomethods demonstrated no significant difference.CONCLUSION QAMS can be used for determining tota1ba1samic acids in S.tonkinensis.

Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.；vani11in；benzoic acid；conifery1 benzoate；benzy1 benzoate；HPLC-DAD；QAMS

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1274-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.015

2015-10-28

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 （973計(jì)劃）項(xiàng)目 （2007CB512606）

胡 攀（1989—），男，碩士，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Te1：18224427340，E-mai1：hupanmai1@foxmai1.com

夏厚林 （1964—），男，教授，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Te1：13568899011，E-mai1：xh164@163.com