王新軍　楊卓　楊如意　袁小威孫利坤牛曉陽

腦膠質瘤組織SNAT1蛋白表達及其意義☆

王新軍*楊卓*楊如意*袁小威*孫利坤**牛曉陽**

目的探討人鈉耦合中性氨基酸轉運蛋白1（human sodium coupled neutral amino acid transporter 1，SNAT1）在膠質瘤組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)，預后的關系。方法 用免疫組織化學法，蛋白質印跡法觀察89例膠質瘤患者的膠質瘤組織和瘤周組織中的SNAT1的表達與分布，其中低級別膠質瘤55例（WHO Ⅰ-Ⅱ），高級別膠質瘤（WHOⅢ-Ⅳ）34例，采用兩獨立樣本t檢驗分析蛋白質印跡中SNAT1的表達，采用單因素χ2檢驗分析SNAT1的表達與臨床病理參數(shù)間的關系，采用Kaplan-Meier法觀察SNAT1的不同表達對患者預后的影響，并建立Cox回歸模型。結果 膠質瘤組織中SNAT1的表達明顯高于瘤周組織（t=-9.803，P=0.001），高病理級別組織中SNAT1的表達明顯高于低病理級別膠質瘤組織（t=-6.682，P=0.003）；SNAT1的表達與膠質瘤直徑，病理級別有關（χ2=4.963，8.527，P＜0.05）；Cox回歸模型顯示腫瘤病理級別，SNAT1蛋白不同表達為影響膠質瘤患者預后的獨立危險因素。結論 SNAT1蛋白的表達與膠質瘤病理級別及患者預后密切相關，有望成為判斷膠質瘤生物學特征及評價患者預后的分子新靶點。

SNAT1膠質瘤 病理參數(shù) 預后

【Abstract】Objective To explore the expression of human sodium coupled neutral amino acid transporter 1 （SNAT1）in human glioma tissues and its relationship with clinical pathological parameters and prognosis.Methods Immu?nohistochemical and western blotting were used to detect SNAT1 expression in glioma tissue and tumor peripheral tissue from 89 cases of glioma patients including 55 cases of low grade gliomas（WHO I-II），and 34 cases of high grade gliomas （WHO grade III-IV）.χ2test and was used to analyze the relationship between expression and clinical pathological param?eters of SNAT1.Kaplan-Meier method was used to analyze the effect of different expression of SNAT1 on the prognosis of patients and to establish the Cox regression model.Results The expression of SNAT1 was significantly higher in gliomas than in tumor peripheral tissue（t=-9.803，P=0.001）.The expression of SNAT1 was significantly higher in high pathologi?cal grade tissues than in low grade of glioma tissues（t=-6.682，P=0.003）.SNAT1 expression was associated with tumor di?ameter and pathological grade（χ2=4.963，8.527，P＜0.05）；Cox regression model showed that the tumor pathological grade and different SNAT1 protein expression were independent risk factors for the prognosis of patients with glioma.Conclu?sions The expression of SNAT1 protein is closely associated with the pathological grade of gliomas and the prognosis of the patients，which may be a new target to judge the biological characteristics and to evaluate the prognosis of gliomas.

【Key Words】SNAT1 Gliomas Pathological parameters Prognosis

膠質瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，其呈浸潤性生長，患者的生存期短，死亡率高，預后差［1］。人鈉耦合中性氨基酸轉運蛋白1（human sodium cou?pled neutral amino acid transporter 1，SNAT1），又稱SLC38A1，ATA1等，是一種Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉運蛋白，介導小分子物質如谷氨酸，丙氨酸等［2］，主要在胎盤，大腦和脊髓中表達［3］。近些年研究證明SNAT1在神經(jīng)膠質瘤［4］，肝癌［5］，乳腺癌［6］中均異常高表達，本研究中我們通過免疫組織化學法，蛋白質印記法檢測膠質瘤組織中SNAT1的表達與分布，并探討SNAT1的表達與臨床參數(shù)及患者預后的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2008年1月至2011年12月于鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科治療的89例膠質瘤患者的膠質瘤組織及瘤周組織的石蠟標本。納入標準為初發(fā)病例，鏡下手術全切除，術前未接受放療，化療及其他治療，術后均接受化療。病理學分級中WHOⅠ級16例，其中毛細胞型星形細胞瘤13例，室管膜下巨細胞型星形細胞瘤3例；Ⅱ級39例，其中少突膠質細胞瘤14例；Ⅲ級20例，其中少突膠質細胞瘤10例；Ⅳ級14例，其中膠質母細胞瘤11例，髓母細胞瘤3例。對所有納入研究的患者進行為期40個月的隨訪，均未有失訪，以患者死亡作為終點事件，其中低病理級別（WHO Ⅰ-Ⅱ）35例，高病理級別（WHOⅢ-Ⅳ）32例發(fā)生終點事件。所有事項已獲患者及其家屬同意。兔抗人SNAT1單克隆抗體購于美國Sigma公司，鼠/兔通用型S-P超敏試劑盒購于福州邁新公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液購于上海拜沃生物科技有限公司，PVDF膜購于美國Milipore公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2SNAT1分布檢測 89例標本在離體后經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。標本做連續(xù)切片，置于防脫劑預處理后的載玻片上，滴加SNAT1抗體4℃過夜，磷酸緩沖液（PBS）清洗后滴加生物素標記二抗，室溫孵育20min，PBS清洗加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，DAB顯色液顯色，沖洗，蘇木精復染等后于顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗染色做陰性對照。選擇每張切片免疫反應較強的區(qū)域，高倍鏡視野（×400）觀察5個不重復視野，計數(shù)SNAT1陽性細胞。其中：陽性細胞百分比≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色程度評分：無染色者為0分，淡黃色者為1分，黃色或棕黃色者為2分，褐色者為3分。最后以兩者評分的總和為最終評分，0分為陰性，1～7分為陽性，其中1～3分為低表達，4～7分為高表達。

1.3SNAT1蛋白印跡檢測 取冰凍組織300mg，剪碎放于勻漿器中，加入預放置的蛋白裂解酶，在冰上進行勻漿，使SNAT1蛋白充分裂解，嚴格按照蛋白印跡法操作進行，實驗進行3次，檢測出SNAT1蛋白的表達。

1.4統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)分析由SPSS 21.0軟件完成。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，腫瘤組織與瘤周組織，低病理級別與高病理級別組織中SNAT1的表達采用兩獨立樣本t檢驗；SNAT1的表達與臨床病理參數(shù)的關系采用單因素χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法并建立Cox回歸模型分析SNAT1的不同表達對患者預后的影響，檢驗水準均為α=0.05。

2　結果

2.1SNAT1在腦組織中的表達分布SNAT1在腫瘤組織中的表達主要在胞漿中，可見黃色或棕黃色的顆粒物質，如圖1。得出標本中SNAT1光密度條帶值與對照GAPDH條帶比值，作為SNAT1蛋白表達水平，如圖2，在瘤周組織中為0.11±0.02，低病理級別中為0.32±0.13，高病理級別中為0.52± 0.09，瘤周組織與膠質瘤組織（t=-9.803，P= 0.001），低病理級別與高病理級別（t=-6.682，P= 0.003），差異有統(tǒng)計學意義，其表達情況如表1。

2.2SNAT1的表達與臨床病理因素的關系

SNAT1的表達與病理級別，腫瘤直徑有關（P＜0.05），與患者年齡，性別，膠質瘤細胞成分，部位無關（P＞0.05），如表2。

2.3SNAT1的表達與預后的的關系 通過Ka?plan-Meier法制作生存曲線，如圖3，可知SNAT1的不同表達對患者的預后有不同影響（Log-Rank= 19.953，P＜0.05），低表達組（陰性和低表達合并）1年生存率為86.7%（39/45），3年生存率為31.1% （14/45），高表達組1年生存率為61.4%（27/44），3年生存率為6.8%（3/44）。將可能影響膠質瘤患者預后的因素納入單因素Cox回歸模型中顯示，膠質瘤患者的預后與腫瘤直經(jīng)、病理級別、SNAT1蛋白有關系（P＜0.05）；將以上相關因素納入多因素Cox回歸模型中顯示：SNAT1蛋白不同表達和腫瘤病理級別是影響膠質瘤患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表3。

圖1　膠質瘤組織和瘤周組織中SNAT1的表達（SP，×400） A：瘤周組織中SNAT1的少量染色；B：膠質瘤組織中SNAT1的陽性染色；C：低病理級別膠質瘤組織中SNAT1的低表達；D：高病理級別膠質瘤組織SNAT1的高表達

圖2　蛋白印跡法檢測腦組織中SNAT1蛋白的表達水平。1：瘤周組織；2：膠質瘤組織；3：低病理級別膠質瘤組織；4：高病理級別膠質瘤組織；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，作為對照

表1　SNAT1在腫瘤組織和瘤周組織中的表達

表2　SNAT1蛋白的表達與臨床病理因素的關系

3　討論

腦膠質瘤的發(fā)生是一個多因素多環(huán)節(jié)的病理改變過程，由于其分子特征異常復雜，導致其在臨床上的治療效果和預后不容樂觀［7］，在腫瘤細胞中，蛋白質主要參與增殖，遷移等重要活動，并為其提供充足的營養(yǎng)，腫瘤細胞中氨基酸的活動需要通道載體蛋白即氨基酸轉運蛋白的參與，而SNAT1蛋白作為氨基酸轉運蛋白載體A家族中的成員，不僅為細胞活動提供營養(yǎng)，也參與細胞內外物質的運輸。本研究表明，SNAT1在腫瘤組織中的陽性表達為79.78%（71/89），明顯高于瘤周組織中的表達37.08%（33/89），SNAT1在高病理級別中的陽性表達為97.06%（33/34），明顯高于低病理級別中的表達69.09%（38/55），為進一步驗證，我們通過檢測不同級別中蛋白水平，更加明確了SNAT1蛋白在膠質瘤組織中表達上調，且隨著腫瘤病理級別的升高而升高。因此，能否利用SNAT1蛋白衡量膠質瘤的惡性程度及生物學特性，我們還繼續(xù)做深入探索。通過Kaplan—Meier法制作的生存曲線可以看出，SNAT1高表達患者預后明顯差于低表達患者，本組SNAT1低表達患者術后1年，3年生存率明顯高于高表達患者（P＜0.05）。有文獻報道［8］，膠質瘤患者中位生存期低于15個月，本組SNAT1低表達患者中位期為20個月，高表達者中位期為17個月，較高于文獻報告值，可能獲益于腫瘤全切除以及術后規(guī)范的化學治療，這也是我們醫(yī)院治療膠質瘤患者遵循的原則，尤其是對中晚期患者，盡管沒有提高總體生存期，但對于延長患者無進展生存期具有較為重要的意義［9］。由于術中很難在肉眼下辨別膠質瘤邊界，不保證做到全切［10］，從而成為膠質瘤日后侵襲進展的根源，因此，在術中能否根據(jù)SNAT1蛋白的不同表達作為快速判斷膠質瘤邊界的定量指標，將給我們全切膠質瘤組織提供新突破口。Cox模型提示膠質瘤病理級別，SNAT1蛋白作為影響患者預后的重要獨立危險因素，這與文獻報告一致［11，12］。根據(jù)以往研究［13］，腫瘤的復發(fā)與細胞有絲分裂增加促使細胞膜代謝異常活躍，SNAT1作為轉運蛋白，可能增加了細胞膜的活動，從而增加了腫瘤惡性進展的風險。SNAT1有望成為臨床上對膠質瘤患者預后判斷的分子新靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，膠質瘤組織中SNAT1的表達與病理級別，腫瘤直徑有關（P＜0.05），而與年齡，性別，膠質瘤細胞成分，腫瘤部位無相關性（P＞0.05）。SNAT1的表達隨著腫瘤直徑的增大而增加，根據(jù)SIDORYK等［14］的觀點，膠質瘤細胞的生長，轉移需要轉運蛋白給其提供谷氨酸等營養(yǎng)物質，可能是SNAT1滿足了腫瘤生長需要的營養(yǎng)物質，與腫瘤同向變化。據(jù)此我們猜測SNAT1蛋白表達水平增高促進了膠質瘤病理級別以及體積的改變。因此，SNAT1蛋白有望作為判斷膠質瘤生物學特征的分子靶點。

綜上所述，該研究揭示了SNAT1蛋白在膠質瘤中的表達及其對預后的影響，對研究膠質瘤的生長機制，侵襲進展提供了理論依據(jù)和參考，然而SNAT1蛋白通過何種途徑增強膠質瘤的生物活性，能否通過下調SNAT1蛋白活性來促進膠質瘤細胞的凋亡，尚需要我們進一步的探索。

表3　影響膠質瘤患者預后因素的Cox模型分析

圖3　SNAT1蛋白不同的表達對膠質瘤預后的影響

［1］SATHORNSUMETEE S，RICH JN，REARDON DA.Diagnosis and treatment of high-grade astrocytoma［J］.Neurol Clin，2007，25 （4）：1111-1139.

［2］ERNST C，DURNOULIN P，CABOT S，et al.SNAT1 and family with high rates of suicidal behavior［J］.Neuroscience，2009，162（2）：415-422.

［3］SUGAWARA M，NAKANISHI T，F(xiàn)EI YJ，et al.Cloning of an amino acid transporter with functional characteristics and tissue expression pattern identical to that of system A［J］.J Biol Chem，2000，275（22）：16473-16477.

［4］SIDORYK M，MATYJA E，DYBEL A，et al.Increased expres?sion of a glutamine transporter SNAT3 is a marker of malignant gliomas［J］.Neuroreport，2004，15（4）：575-578.

［5］KONDOH N，IMAZEKI N，ARAI M，et al.Activation of a sys?tem A amino acid transporter，ATA1/SLC38A1 in human hepa?tocellular carcinoma and preneoplastic liver tissues［J］.Int J On?col，2007，31（1）：81-87.

［6］WANG K，CAO F，F(xiàn)ANG W，et al.Activation of SNAT1/ SLC38A1 in human breast cancer：correlation with p-AKT over?expression［J］.BMC Cancer，2013，13：343-351.

［7］BROWN PD，BALLMAN KV，RUMMANS TA，et al.Prospec?tive study of quality of life in adults with newly diagnosed high-grade gliomas［J］.J Neurooncol，2006，76（3）：283-291.

［8］石爽，鐘東，王兵，等.Syndecan-1基因沉默抑制膠質瘤A172細胞增殖和侵襲［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2016，42 （2）：74-79.

［9］MANNASJP，LIGHTNERDD，DEFRATESSR，etal. Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma［J］. J clin Neurosc，2014，21（1）：121-123.

［10］白少聰，陳曉雷，狄杰峰，等.高場強術中磁共振成像及神經(jīng)導航在累及視放射的顳葉膠質瘤手術中的應用［J］.中華外科雜志，2015，53（5）：340-344.

［11］謝欣，易韋，于燕妮，等.IMP3、IGF2在人腦膠質瘤中的表達及與預后的關系［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2015，41（12）：710-714.

［12］王新軍，楊如意，單嶠，等.膠質瘤相關性癲癇瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達與癇性發(fā)作［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2015，41（3）：155-159.

［13］吳靜超，馮學泉，王金環(huán)，等.靶向堿性成纖維生長因子的小分子干擾RNA誘導膠質瘤U251細胞凋亡機制的初步探討［J］.中華外科雜志，2012，50（10）：928-932.

［14］SIDORYK M，OBARA M，ALBRECHT J.Selective decrease of SN1（SNAT3）mRNA expression in human and rat glioma cells adapted to grow in acidic medium［J］.Neurochem Int，2006，48 （6-7）：547-552.

（責任編輯：甘章平）

Expression and significance of SNAT1 protein in brain glioma tissue.

WANG Xinjun，YANG Zhuo，YANG Ruyi，YUAN Xiaowei，SUN Likun，NIU Xiaoyang.
Department of Neurosurgery，The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou Uni?versity，No.3 Kang-fu qian street，Er qi Distract，Zhengzhou 450052，China.Tel：0371-66916449.

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.07.009

☆河南省教育廳科學技術研究重點項目（編號：14A320078）；鄭州市科技發(fā)展計劃項目（編號：20150390）資助

*鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（鄭州450052）

**鄭州大學第五附屬醫(yī)院血管外科

（E-mail：wangxj@zzu.edu.cn）

2016-04-01）