魏玉梅，李奇兵，劉 華（.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730030；.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；3.西北民族大學(xué)數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)學(xué)院，甘肅蘭州730030）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶解馬鈴薯淀粉工藝

魏玉梅1，李奇兵2，劉 華3，*
（1.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730030；
2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；
3.西北民族大學(xué)數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)學(xué)院，甘肅蘭州730030）

采用中溫型α-淀粉酶對(duì)馬鈴薯淀粉進(jìn)行水解，以馬鈴薯淀粉水解液的DE值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在pH、酶解溫度、酶解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了馬鈴薯淀粉酶解工藝條件。結(jié)果表明：pH7.90，酶解溫度62℃，酶解時(shí)間60 min，在此最優(yōu)條件下酶解馬鈴薯淀粉的DE值達(dá)57.93%。

響應(yīng)面法，馬鈴薯淀粉，酶解

馬鈴薯又名洋芋、土豆，為一年生草本植物，含豐富而齊全的營(yíng)養(yǎng)素，是世界上僅次于小麥、水稻和玉米的第四種主要農(nóng)作物。目前我國(guó)的馬鈴薯常年種植面積467萬公頃左右，是世界上馬鈴薯生產(chǎn)的第一大國(guó)［1］。馬鈴薯是生產(chǎn)馬鈴薯淀粉的重要工業(yè)原料，但加工利用至今仍處于初級(jí)階段［2］。我國(guó)馬鈴薯約30%用于鮮食，30%用于制淀粉，15%直接用作飼料，10%用作種薯，而用于深加工卻不到5%。在美國(guó)，馬鈴薯用于鮮食占30%，飼料僅占2%，而用于深加工則高達(dá)50%［3］。而加工后馬鈴薯渣中的淀粉含量占干基含量的37%，纖維素類占干基總量的31%，果膠占干基含量的17%，蛋白質(zhì)或氨基酸僅占干基含量的4%［4-5］。本文以實(shí)驗(yàn)室提取的馬鈴薯淀粉為原料，采用中溫型α-淀粉酶，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，建立酶解模型，對(duì)淀粉酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為馬鈴薯及馬鈴薯渣的加工再利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯淀粉 市售馬鈴薯實(shí)驗(yàn)室提取；中溫型a-淀粉酶 天津市大茂化學(xué)試劑廠，活力為3000～5000 U/g；檸檬酸、磷酸二氫鈉、碘、碘化鉀、硫代硫酸鈉、重鉻酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、高氯酸鉀、氯化鈣 均為分析純；可溶性淀粉。

玻璃儀器氣流烘干器 長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；BCD-212KA冰箱 Haier公司；DHG-9240型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海-恒科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常用國(guó)華電器有限公司；DELTA-320實(shí)驗(yàn)室PH計(jì) METTLER TOLEDO公司；PL-203型電子分析天平 瑞士梅特勒-托力多公司；SK-1快速混勻器 金壇市恒豐儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DE值的測(cè)定 按照郝曉敏等［6］研究方法測(cè)定還原糖含量。稱取淀粉酶解液約10 mL移入250 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻。用移液管吸取10 mL，置于碘量瓶中，加入15 mL 0.1 mol/L碘液，再用滴定管慢慢加入15 mL 0.15 mol/L氫氧化鈉，邊加邊搖勻。在暗室放置20 min，溫度在20℃為宜，加入2 mol/L硫酸2 mL酸化，用0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定過量的碘，記錄消耗的硫代硫酸鈉體積V1，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，用10 mL水代替10 mL液化液，并記錄消耗的硫代硫酸鈉的體積V0。

還原糖含量（g/100mL）=｛［（V0-V1）×N×90.05］/ （V×1000）｝×H×100

式中：V0—空白滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)；V1—樣品滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)；V—反應(yīng)試樣的吸取量毫升數(shù)；N—標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉的溶液當(dāng)量濃度；90.05—1 mL硫代硫酸鈉所相當(dāng)?shù)钠咸烟呛量藬?shù)；H—被測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)。

DE值（%）=水解液中還原糖的含量/干物質(zhì)含量×100

1.2.2 α-淀粉酶活力測(cè)定 按照郝曉敏等［6］的研究方法測(cè)定α-淀粉酶活力。在150 mL錐形瓶中加入2%可溶性淀粉溶液20 mL，加入緩沖液5 mL，在60℃水浴中平衡4～5 min，加入0.5 mL稀釋酶液，立即計(jì)時(shí)，充分混勻，定時(shí)取出1 mL反應(yīng)液于預(yù)先盛有3 mL比色碘液的試管內(nèi)，當(dāng)顏色由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，與標(biāo)準(zhǔn)比色試管顏色相同時(shí)，即達(dá)到終點(diǎn)，記錄時(shí)間為液化時(shí)間。

1.2.3 酶解馬鈴薯淀粉的制備 以新鮮馬鈴薯為原料，洗凈、切塊，將其放入打漿機(jī)打漿，然后用100目的濾布過濾，靜置1～2 h后除去上清液，室溫干燥得實(shí)驗(yàn)淀粉備用。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 酶解時(shí)間對(duì)馬鈴薯淀粉DE值的影響 取2.0 g干馬鈴薯淀粉于25 mL錐形瓶中，加入10 mL（硫酸-氫氧化鈉）pH7.5溶液混勻，加入2 mol/L CaCl2溶液50 μL保持溶液中Ca2+離子濃度為0.01 mol/L［7］，加入60℃水浴溫酶液800 μL（0.8%），充分混勻，在60℃下分別水解40、50、60、70、80 min后，滅酶冷卻定容測(cè)定液化液DE值及還原糖含量。

1.3.2 pH對(duì)馬鈴薯淀粉DE值的影響 基本操作同

1.3.1 ，硫酸-氫氧化鈉pH分別設(shè)為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在60℃下水解70 min后，滅酶冷卻定容測(cè)定液化液DE值及還原糖含量。

1.3.3 酶解溫度對(duì)馬鈴薯淀粉DE值的影響 基本操作同1.3.1，加入保溫酶液溫度分別設(shè)為40、50、60、70、80℃，并在以上溫度下水解70 min后，滅酶冷卻定容測(cè)定液化液DE值及還原糖含量。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

使用Design-Expert 8.0軟件，采用Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［8］，以酶解時(shí)間、pH、酶解溫度為自變量，分別以A、B、C表示，并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，以馬鈴薯淀粉水解液的DE值為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Independent variables and levels used in response surface analysis

1.5 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，建立回歸方程并作等高線和三維曲面圖，對(duì)任意兩種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)［9］，得到最優(yōu)加工工藝組合。其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用Excel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響

酶解時(shí)間對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響如圖1所示。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響Fig.1 Effect of liquid solution enzymolysis time on DE value of potato starch

圖1 表明，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯淀粉酶解液的DE值先增大后減小。當(dāng)酶解時(shí)間為60 min時(shí)，所得的水解液的DE值最高，達(dá)到57.94%；當(dāng)酶解時(shí)間大于60 min時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯淀粉酶解液的DE值逐漸降低。其原因可能是：水解時(shí)間太短時(shí)，水解反應(yīng)不徹底，水解液的DE值較低；水解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，水解產(chǎn)生的葡萄糖復(fù)合分解反應(yīng)增加，導(dǎo)致水解液的DE值降低。因此，適宜的酶解時(shí)間為60 min。

2.1.2 酶解pH對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響 酶解pH對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響如圖2所示。

圖2表明，隨著pH的升高，馬鈴薯淀粉水解液的DE值先增大后減小。當(dāng)水解pH為8.0，水解液的DE值最高，達(dá)到58.49%?？赡苁且?yàn)樗鈖H較低時(shí)，α-淀粉酶的水解活性失活，水解液的DE值較低。當(dāng)pH過高時(shí)，同樣使α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，水解速率下降。因此，適宜的酶解pH為8.0。

圖2 酶解pH對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響Fig.2 The effect of pH on the enzymatic hydrolysis of potato starch solution DE value

2.1.3 酶解溫度對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響 酶解溫度對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響如圖3所示。

圖3 酶解溫度對(duì)馬鈴薯淀粉酶解液DE值的影響Fig.3 Effect of liquid solution enzymolysis temperature on DE value of potato starch

圖3表明，隨著酶解溫度的升高，馬鈴薯淀粉水解液的DE值先增大后減小。當(dāng)水解時(shí)間為60℃時(shí)，所得的水解液的DE值最高，達(dá)到54.14%。可能是因?yàn)槊附鉁囟容^低時(shí)，α-淀粉酶的水解活性較低，同時(shí)溫度較低時(shí)化學(xué)反應(yīng)速率較低；當(dāng)溫度過高時(shí)，酶活性降低甚至失活，使水解液的DE值降低。因此，適宜酶解溫度為60℃左右。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型建立與分析 影響馬鈴薯淀粉酶解的因素有三個(gè)：酶解時(shí)間、pH、酶解溫度，實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化水解工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Scheme and experimental results for response surface design

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table3 ANVONA results for the fitted regression model

按照Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各組酶解液的DE值進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：Y=57.93-0.65A+2.47B-2.177C+2.89AB+0.79AC-2.98BC-9.24A2-7.48B2-6.93C2

式中，Y為水解液的DE值；A、B、C分別為上述3個(gè)自變量的編碼值。回歸方程的R2為0.9137，模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如表3所示：

由表3可知，模型的p＜0.0001，表明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著。失擬項(xiàng)p=0.1351＞0.05，不顯著，說明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度較好，該方案可靠。另外，因素B和因素C對(duì)馬鈴薯淀粉酶解DE值影響極顯著（p＜0.01），因素A的影響不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)DE值的影響均極顯著（p＜0.01）；因素AB、BC交互作用對(duì)DE值影響極顯著（p＜0.01）。根據(jù)一次回歸系數(shù)絕對(duì)值大小可知，影響馬鈴薯淀粉酶解的主次因素為：pH＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過多元回歸方程分析可知3個(gè)因素交互作用對(duì)DE值的影響情況。用響應(yīng)面和等高線圖可以直觀的反映該影響。

圖4 酶解時(shí)間和pH的交互作用響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of interaction between time and pH value

從圖4可以看出，酶解時(shí)間和pH對(duì)淀粉酶解DE值的影響較大（p＜0.01），當(dāng)酶解時(shí)間和pH過高或過低的時(shí)候，DE值較低。適中的酶解時(shí)間和pH時(shí)，響應(yīng)面出現(xiàn)最高點(diǎn)，此時(shí)DE值最高。

圖5 酶解溫度和pH的交互作用響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of interaction between temperature and pH value

從圖5可以看出，酶解溫度和pH對(duì)淀粉酶解DE值的影響較大（p＜0.01），當(dāng)酶解溫度和pH過高或過低時(shí)，DE值較低。適中的酶解溫度和pH時(shí)，響應(yīng)面出現(xiàn)最高點(diǎn)，此時(shí)DE值最高。

根據(jù)回歸模型方程以及酶解時(shí)間、pH、酶解溫度對(duì)馬鈴薯淀粉DE值的影響的等高線、響應(yīng)面圖可知，pH、酶解溫度對(duì)DE值的影響最為顯著，表現(xiàn)的曲線最陡。

2.3 優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行優(yōu)化，得到馬鈴薯淀粉酶解的最佳工藝條件為：pH7.90、酶解溫度62.22℃、酶解時(shí)間59.21 min，在此條件下，馬鈴薯淀粉酶解液的預(yù)測(cè)DE值為58.46%?？紤]到實(shí)際應(yīng)用，馬鈴薯淀粉酶解的最佳工藝條件調(diào)整為：pH7.90、酶解溫度62℃、酶解時(shí)間60 min，在此條件下，馬鈴薯淀粉酶解液的DE值為57.93%，與預(yù)測(cè)值接近。由此表明該模型可靠。

3 結(jié)論

本研究以馬鈴薯淀粉為原料，采用中溫型α-淀粉酶對(duì)馬鈴薯淀粉進(jìn)行酶解，以淀粉酶解液DE值作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)水解度有顯著影響的3個(gè)因素：pH、酶解溫度、酶解時(shí)間，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，得到α-淀粉酶水解馬鈴薯淀粉的最佳工藝參數(shù)：pH7.90，酶解溫度62.22℃，酶解時(shí)間59.21 min，在此條件下，馬鈴薯淀粉酶解液的DE值為58.46%?？紤]到實(shí)際操作需要，將酶解溫度調(diào)整為62℃，酶解時(shí)間調(diào)整60 min，在此條件下，馬鈴薯淀粉酶解液的DE值為57.93%，與預(yù)測(cè)值接近。

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Optimizing process parameters for enzymolysis of potato starch by response surface methodology

WEI Yu-mei1，LI Qi-bing2，LIU Hua3，*
（1.Center of Experiment，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China；2.College of Science and Engineering，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China；3.School of Mathematics and Computer Science，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China）

Using medium temperature type-amylase on potato starch hydrolysis，the DE value of potato starch hydrolysate was the evaluation index.Based on single-factor experiments of the effect of the pH，enzymolysis temperature and enzymolysis time，the optimum condition of potato starch enzymolysis was determined by response surface methodology.The results showed that the optimum conditions were as follows:pH7.90，enzymolysis temperature 62℃，enzymolysis time 60 min，under the optimum conditions，the enzymolysis of potato starch DE value was 57.93%.

response surface method；potato starch；enzymolysis

TS234+2

A

1002-0306（2016）02-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.027

2015－05－06

魏玉梅（1980-），女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品開發(fā)與安全檢測(cè)，E-mail：weijy1980@126.com。

*通訊作者：劉華（1977-），男，博士，教授，研究方向：數(shù)值計(jì)算，E-mail：649118046@qq.com。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（31920140095）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31260098）；西北民族大學(xué)2014年開放項(xiàng)目；國(guó)家民委中青年英才計(jì)劃（〔2014〕121號(hào)）；2013年西北民族大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。