呂　磊，張　潔，殷宇剛，徐　軍

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·論著·

川芎嗪減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

呂磊，張潔，殷宇剛，徐軍

目的觀察川芎嗪預(yù)處理對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能機(jī)制。方法40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、川芎嗪組、川芎嗪+渥曼青霉素組和渥曼青霉素組。結(jié)扎左前降支35 min，再灌120 min建立缺血再灌注模型。假手術(shù)組前降支近端穿線但不結(jié)扎。用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定缺血心肌組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)活性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定缺血心肌Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)心肌磷酸化Akt的表達(dá)。結(jié)果缺血再灌注增加心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及caspase 3活性，川芎嗪預(yù)處理明顯降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及caspase 3活性，降低Bax mRNA的表達(dá)水平，增加Bcl-2 mRNA和磷酸化Akt的表達(dá)水平，渥曼青霉素顯著抑制上述指標(biāo)的變化并取消了川芎嗪所致的磷酸化Akt表達(dá)水平的增加。結(jié)論川芎嗪能減輕在體大鼠心肌缺血再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡，PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與這一保護(hù)作用。

缺血再灌注；凋亡；川芎嗪；Akt信號(hào)通路；心肌保護(hù)

快速完全恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血供是治療急性心肌梗死最有效的方法，但再灌注同時(shí)也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)損傷，降低患者再灌注的獲益[1]。心肌細(xì)胞凋亡是心肌IR損傷的重要病理機(jī)制，近年研究報(bào)道川芎嗪能減少心力衰竭大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能[2]。川芎嗪是中藥川芎的有效單體成分，化學(xué)名為四甲基吡嗪 (tetramethylpyrazine，TMP)，具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集以及活血化淤等作用，在心、腦、腎的IR損傷模型中表現(xiàn)出有效的抗炎和抗氧化作用[3]，可減少活性氧簇，減輕輻射所致的細(xì)胞凋亡[4]。然而川芎嗪對(duì)在體大鼠IR后心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)建立在體大鼠心肌IR模型，探討川芎嗪對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g，由江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，術(shù)前在標(biāo)準(zhǔn)檢疫房間中適應(yīng)飼養(yǎng)1周，心電圖檢查陰性。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.2藥物和主要試劑川芎嗪購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，渥曼青霉素(wortmanin)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司，caspase 3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。Trizol裂解液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，抗Akt和抗磷酸化Akt(serine 473)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組大鼠隨機(jī)分為5組。①假手術(shù)組(sham組，n=8)：開(kāi)胸前降支近端穿線但不結(jié)扎。②IR組(n=8)：開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支35 min，再灌注120 min。③川芎嗪組(n=8)：結(jié)扎前降支前5 min靜脈給予川芎嗪10 mg/kg，余同IR組。④川芎嗪+渥曼青霉素組(n=8)：再灌前15 min靜脈給予PI3K抑制劑渥曼青霉素15 μg/kg，余同川芎嗪組。⑤渥曼青霉素組(n=8)：再灌前15 min靜脈給予渥曼青霉素15 μg/kg，余同IR組。

1.4在體大鼠IR模型的建立大鼠氯胺酮(150 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定，同時(shí)給予肝素(500 IU/kg)，記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管切開(kāi)接小動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣(潮氣量8 mL/kg，頻率60次/min)。自胸骨左緣3～4肋間開(kāi)胸，暴露心臟，打開(kāi)心包，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間找出前降支，左心耳下方3 mm處前降支貫穿6-0無(wú)損傷縫線，結(jié)扎前降支，結(jié)扎后心電圖提示ST段明顯抬高，QRS波增寬以及結(jié)扎線以下左室前壁出現(xiàn)紫紺為結(jié)扎成功。持續(xù)缺血35 min后剪斷結(jié)扎線使血流再通，復(fù)灌時(shí)左室前壁紫紺消失，抬高的ST段下降1/2以上、增高的R波振幅降低，伴有心律失常出現(xiàn)或者Q波出現(xiàn)，術(shù)中全程監(jiān)測(cè)心電圖。再灌注120 min后心臟快速放血處死動(dòng)物，取出心臟，切取左室缺血區(qū)心肌快速液氮冷凍，隨后移入-80 ℃冰箱凍存待用。

1.5測(cè)定指標(biāo)

1.5.1TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡嚴(yán)格按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。4%多聚甲醛固定大鼠新鮮左室心肌組織，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟水化，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)。光學(xué)顯微鏡下正常心肌細(xì)胞呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞細(xì)胞核呈棕褐色(TUNEL陽(yáng)性)。每張切片分別隨機(jī)選取10個(gè)非重疊200高倍鏡視野，分別計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.2ELISA法檢測(cè)心肌組織caspase3嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)定心肌組織的蛋白含量，計(jì)算每mg蛋白中的caspase3含量。

1.5.3實(shí)時(shí)PCR測(cè)定心肌組織中Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)Trizol提取左室缺血心肌細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及260 nm和280 nm的吸光度值。所有樣本波長(zhǎng)260/280比值均在1.8～2.0。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR反應(yīng)。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)選取大鼠心肌Bcl-2、Bax和GAPDH引物序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞科技有限公司合成。GAPDH為內(nèi)參。Bcl-2上游引物5-ACTTCTCTCGTCGCTACCGT-3，下游引物5-TCCCTGAAGAGTTCCTCCAC-3，產(chǎn)物大小為112 bp。Bax上游引物5-TAGCAAACTGGTGCTCAAG G-3，下游引物5- TCTTGGATCCAGACAAGCAG-3，產(chǎn)物大小為111bp。內(nèi)參GAPDH上游引物5-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3，下游引物5- AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3，產(chǎn)物大小為133 bp。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃15 s，退火及延伸60 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct公式[5]計(jì)算Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)水平。將目的基因與內(nèi)參基因進(jìn)行比較，得到相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4心肌組織中磷酸化Akt和Akt含量測(cè)定用Western blot法檢測(cè)各組心肌組織中磷酸化Akt和Akt含量。用含蛋白酶抑制劑的裂解液提取心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，加樣總蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定樣品，轉(zhuǎn)膜后用一抗(磷酸化Akt和Akt抗體，1∶1000稀釋)封閉，4 ℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)封閉液中，室溫孵育2 h。采用Bio-Rad公司的Gel Doc2000凝膠圖像專用軟件分析目標(biāo)條帶的積分吸光度值，以磷酸化Akt/Akt值反映Akt的相對(duì)活化水平。

2　結(jié)　果

2.1心肌細(xì)胞TUNEL染色TUNEL染色后凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。凋亡細(xì)胞主要位于心肌梗死邊緣區(qū)。除假手術(shù)組外，各組均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞。IR組凋亡指數(shù)為(24.7±3.6)%，川芎嗪組凋亡指數(shù)最低，為(15.8±3.0)%。川芎嗪+渥曼青霉素組和渥曼青霉素組分別為(21.3±3.9)%和(25.0±4.2)%，與IR組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

2.2各組大鼠心肌組織caspase3含量IR組大鼠心肌caspase3含量較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)。川芎嗪預(yù)處理后，caspase3含量為(13.930±4.672)pg/mg，與IR組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。川芎嗪+渥曼青霉素組caspase3為(24.770±7.767)pg/mg，與IR組相比，無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1，提示渥曼青霉素減弱了川芎嗪降低caspase3的作用。

2.3大鼠心肌組織中Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)IR組Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯下降，而B(niǎo)ax mRNA的表達(dá)水平上升。川芎嗪組的Bcl-2 mRNA為(0.657±0.075)，Bax mRNA為(4.053±0.791)，與IR組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示川芎嗪上調(diào)了大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA的表達(dá)，抑制了Bax mRNA的表達(dá)。合用渥曼青霉素后，Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯下降，Bax mRNA表達(dá)水平顯著上升(與川芎嗪組比，P均<0.05)，提示渥曼青霉素能部分阻斷川芎嗪升高Bcl-2 mRNA、降低Bax mRNA的作用。與IR組相比，單用渥曼青霉素對(duì)Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

凋亡細(xì)胞核光鏡下呈棕褐色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色(TUNEL染色 ×200)圖1　各組大鼠心肌組織TUNEL染色結(jié)果

組別caspase3(pg/mg)Bcl-2Bax假手術(shù)組3.916±1.922*△1.042±0.134*△1.038±0.219*△IR組26.550±5.733△0.304±0.056△8.465±1.514△川芎嗪組13.930±4.672*0.657±0.075*4.053±0.791*川芎嗪+渥曼青霉素組24.770±7.767*△0.382±0.073△7.255±1.235*△渥曼青霉素組25.846±6.981△0.401±0.093△8.198±1.492△注:與IR組比較,*P<0.05;與川芎嗪組比較,△P<0.05

1為假手術(shù)組，2為IR組，3為川芎嗪組，4為川芎嗪+渥曼青霉素組，5為渥曼青霉素組;與IR組相比，*P<0.05；與川芎嗪組相比，#P<0.05圖2　心肌組織中磷酸化Akt的蛋白表達(dá)

2.4大鼠心肌組織中磷酸化Akt蛋白的表達(dá)結(jié)果川芎嗪組磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平顯著高于IR組(2.14±0.32 vs 0.68±0.14，P<0.05)，川芎嗪+渥曼青霉素組磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平低于川芎嗪組(1.21±0.24 vs 2.14±0.32，P<0.05)，提示川芎嗪上調(diào)了大鼠心肌組織中磷酸化Akt 蛋白的表達(dá)，而渥曼青霉素能部分抑制川芎嗪導(dǎo)致的磷酸化Akt蛋白表達(dá)增加。單用渥曼青霉素對(duì)Akt的磷酸化表達(dá)(0.59±0.15)無(wú)明顯影響，與IR組相比，P>0.05，見(jiàn)圖2。

3　討　論

心肌細(xì)胞凋亡是IR后心肌細(xì)胞損失的重要方式，也是心肌IR后心肌梗死的促進(jìn)因素。再灌注能加速心肌細(xì)胞凋亡，抑制或減少凋亡是減輕IR損傷的關(guān)鍵措施之一[6]。現(xiàn)普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。caspase3處于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物使細(xì)胞死亡，是凋亡的啟動(dòng)蛋白和凋亡事件的執(zhí)行者。一旦caspase-3被激活，凋亡將不可避免，是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶[7]。用TUNEL法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確反映出細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)特征，靈敏度高，廣泛用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)[1]。本研究通過(guò)TUNEL染色來(lái)觀察川芎嗪對(duì)心肌IR后心肌細(xì)胞凋亡的影響并測(cè)定IR心肌組織中caspase-3含量，結(jié)果表明與IR組相比，川芎嗪組凋亡指數(shù)明顯降低，caspase-3活性降低，兩者一致，提示川芎嗪能減少IR后心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。這與Lin等[8]的報(bào)道一致。合用PI3K抑制劑渥曼青霉素后，凋亡指數(shù)和caspase3含量與IR組無(wú)顯著差異，提示渥曼青霉素減弱了川芎嗪抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bcl-2家族參與細(xì)胞凋亡的線粒體通路，是該通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。Bcl-2家族可以分為抑制凋亡的Bcl-2亞族(包括Bcl-2、Bcl-xL等)和促進(jìn)凋亡的Bax亞族(包括Bax、Bak等)。Bcl-2分布于線粒體外膜上，是第一個(gè)被確認(rèn)的抗凋亡基因，能抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔的開(kāi)放，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，降低鈣離子依賴性的核酸內(nèi)切酶活性，提高線粒體的鈣緩沖能力，減少細(xì)胞色素C等凋亡因子釋放，從而減少caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)所致細(xì)胞凋亡[9]，在調(diào)節(jié)病理和生理凋亡中起關(guān)鍵作用。Bax是Bcl-2的同源基因，可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開(kāi)放，增加細(xì)胞色素C及凋亡因子的釋放，拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡。Bax與Bcl-2的蛋白水平與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bax升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2升高則抑制細(xì)胞凋亡[10-11]。本研究結(jié)果表明，IR組大鼠心肌缺血組織的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯下降，而B(niǎo)ax mRNA水平上升。川芎嗪預(yù)處理后，Bcl-2 mRNA水平上升，Bax mRNA水平下降，提示IR促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡，而川芎嗪減少了細(xì)胞凋亡。合用渥曼青霉素后，Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯下降，Bax mRNA顯著上升，提示渥曼青霉素能部分阻斷川芎嗪升高Bcl-2 mRNA和降低Bax mRNA的作用。

PI3K/Akt信號(hào)通路是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶的一個(gè)保守家族。近年研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路可能是細(xì)胞在遭受有害刺激時(shí)，限制炎癥反應(yīng)和凋亡事件的內(nèi)源性負(fù)反饋調(diào)節(jié)子和代償機(jī)制，在細(xì)胞的凋亡、存活、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞增殖活動(dòng)中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。蛋白激酶B(又稱為Akt)處于PI3K信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)。Akt屬于Ser/Thr蛋白，是PI3K下游直接和最主要的靶酶，能調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，促進(jìn)細(xì)胞存活。Akt激活能抑制Bcl-2形成的線粒體跨膜通道，保證線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞色素C的釋放和caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制凋亡[12-13]。

本研究通過(guò)Western blot法測(cè)定心肌組織中磷酸化Akt的表達(dá)，結(jié)果表明川芎嗪組磷酸化Akt水平較IR組明顯增加，而川芎嗪與PI3K抑制劑渥曼青霉素合用時(shí)，Akt的磷酸化水平下降，說(shuō)明川芎嗪激活了Akt通路，而渥曼青霉素部分阻斷了川芎嗪減輕IR后心肌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，川芎嗪能減少在體大鼠心肌IR后心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。本研究初步探討了川芎嗪減輕心肌IR損傷所致心肌細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制，而川芎嗪與線粒體凋亡通路的關(guān)系如何，川芎嗪對(duì)凋亡的影響有無(wú)時(shí)間依賴性等具體機(jī)制及影響因素仍有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

An investigation on the effects of ligustrazine in attenuating apoptosis of myocardial ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism

LV Lei, ZHANG Jie, YIN Yu-gang, XU Jun.

DepartmentofGeriatricCardiology,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China

ObjectiveTo observe the effect of ligustrazine (tetramethylpyrazine, TMP) pretreatment on apoptosis caused by myocardial ischemia reperfusion (IR) in ratsinvivoand to investigate the possible mechanism. MethodsForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham, IR, TMP, TMP+wortmannin (TMP+wort) and wort group. All hearts except those in the sham group were subjected to 35 min ischemia followed by 120 min reperfusion. Apoptosis of myocardial cell was measured by TUNEL staining and caspase-3 activity. The expression of Bax and Bcl-2 mRNA was detected by real time PCR. The expression of phosphorylated Akt and total Akt were detected by Western blot. ResultsCompared to the IR group, the myocardial tissues of the TMP group showed a decrease in the apoptosis index, caspase 3 activity and the expression of Bax mRNA. The expression of Bcl-2 mRNA and phosphorylation Akt in the TMP group increased significantly compared to that in the IR group. However, these effects could be significantly reversed by wortmannin which abolished the decrease of caspase 3, apoptosis index and Bax mRNA and increase of Bcl-2 mRNA and phosphorylation Akt brought by TMP. ConclusionPretreatment of ligustrazine attenuated the apoptosis of myocardial IR in ratsinvivo. PI3K/Akt pathway may be involved in the protective mechanism of ligustrazine.

ischemia reperfusion; apoptosis; ligustrazine; Akt signaling pathway; myocardial protection

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金(2014061)

210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院心臟內(nèi)科干部病區(qū)

徐軍，E-mail: xxujun305@sina.com

R541.4

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.007

2016-04-12；

2016-04-29)

引用格式：呂磊，張潔，殷宇剛，等.川芎嗪減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016,18(4):361-364,367.