谷雪峰，何松貴，劉幼強(qiáng)，吳振強(qiáng)*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510062；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東佛山528203）

大青葉對(duì)酒曲發(fā)酵影響的研究

谷雪峰1，何松貴2，劉幼強(qiáng)2，吳振強(qiáng)1*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510062；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東佛山528203）

該研究以大青葉作為輔料，探討添加大青葉對(duì)酒曲發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，添加大青葉使培養(yǎng)基質(zhì)密度降低、基質(zhì)疏松，有利于發(fā)酵過程的通氣和傳熱，發(fā)酵后酸度下降。添加大青葉促進(jìn)酒曲中霉菌的生長(zhǎng)，但抑制細(xì)菌和酵母生長(zhǎng)，并導(dǎo)致生物活性發(fā)生變化，影響效果與大青葉的添加量成正比，當(dāng)添加量為9%時(shí)，糖化酶酶活提高4.24倍，液化酶活、發(fā)酵力、酯化力等分別下降30%、90%和80%。同時(shí)，添加大青葉使酒曲成品的揮發(fā)性成分明顯增多，酯類物質(zhì)從4種增加至8種，還增加了苯甲醇和多種高級(jí)脂肪酸、烷烴、烯烴、酰胺、醇等物質(zhì)，這些新增物質(zhì)將會(huì)對(duì)酒曲風(fēng)味產(chǎn)生較大影響。

酒曲發(fā)酵；大青葉；微生物；發(fā)酵力；酯化力

酒曲作為酒釀造過程中的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，其質(zhì)量的好壞對(duì)酒的風(fēng)味、產(chǎn)率和品質(zhì)具有極大的影響。傳統(tǒng)酒曲制作多添加中草藥作為輔料（如桑葉、野蓼等［1］），少的添加1種，多的甚至上百種［2-3］。添加方法有破碎后直接添加或熱水浸煮后取浸提液添加。添加的中草藥為酒曲提供植物中的微生物、蛋白質(zhì)、芳香成分及有毒（抑菌）成分，但對(duì)于添加中草藥在酒曲制作過程中的作用機(jī)理少見報(bào)道。

大青葉是我國(guó)是傳統(tǒng)的清熱解毒中草藥，具有抗病毒、抗內(nèi)毒素和抑菌活性［4］，臨床主要用于流行性感冒、急性傳染性肝炎、痢疾、急性腸胃炎、發(fā)斑發(fā)疹等疾?。?］。以往對(duì)大青葉的研究主要在醫(yī)藥和化學(xué)成分上，還沒有應(yīng)用于酒曲的研究發(fā)表。大青葉主要含有生物堿、有機(jī)酸、苷類、甾醇等幾大類化合物［6-7］，其揮發(fā)油成分主要有棕櫚酸、植酮、苯甲醇以及正二十九烷等烷烴類物質(zhì)［8-9］。

本研究以某酒廠酒曲中的一種添加植物——大青葉作為研究對(duì)象，探討添加中草藥對(duì)酒曲發(fā)酵過程酒曲理化參數(shù)及微生物活性的影響，為酒曲添加中草藥輔料的生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大青葉、餅丸（含釀酒酵母、產(chǎn)酯酵母、米根霉、毛霉、華根霉、乳酸菌、醋酸菌等微生物，常溫保藏）：廣東省九江酒廠有限公司；大米、黃豆等：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、可溶性淀粉、葡萄糖、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸鎂等（化學(xué)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚（色譜純）、乙醇（分析純）、己酸乙酯（分析純）、乙酸正戊酯（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用分析儀：美國(guó)安捷倫公司；GC-2014C氣相色譜分析儀：日本島津公司ZDJ-4A自動(dòng)電位滴定儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-150B生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司；UV-2802SH紫外分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1酒曲培養(yǎng)基制備

參考酒廠酒曲制作工藝，以大米和黃豆為主料，兩者質(zhì)量比為8∶2，分別按照1∶1加水、蒸煮30 m in、冷卻至35℃左右后混合，同時(shí)加入大青葉（粉碎度為1 cm左右）0、4.5%、9%和餅丸（1.5%），于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（35℃、相對(duì)濕度85%）培養(yǎng)6 d。發(fā)酵過程中需定時(shí)噴灑霧狀水以保持酒曲含水量。每隔2 d取樣分析。

1.3.2酒曲揮發(fā)性成分提取

將酒曲置于索氏提取管中。量取150 m L石油醚溶劑于250 m L圓底燒瓶?jī)?nèi)，置于85℃的恒溫水浴鍋中6 h，取樣，20 000 r/min離心15s，上清液（揮發(fā)油）置于樣瓶中，待測(cè)。

1.3.3測(cè)定方法

酒曲發(fā)酵樣品的糖化酶酶活、液化酶酶活、酯化力、含水量、酸度、密度的測(cè)定依照參考文獻(xiàn)［10］。

發(fā)酵力測(cè)定采用排飽和碳酸鈉溶液收集CO2的方法。酒曲微生物測(cè)定：采用稀釋平板計(jì)數(shù)法［11］。

揮發(fā)性成分（揮發(fā)油）分析方法：揮發(fā)油溶解于適量的石油醚，采用GC-MS進(jìn)行分析。色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)柱管（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50℃保留3 m in，4℃/m in升溫至230℃后，保持30 m in；進(jìn)樣量為1 μL；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為氦氣，流速2 m L/min。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；電子倍增器電壓1 858.8 V；掃描質(zhì)量范圍35～350 m/z。在HP-5MS柱上使用一系列同源性C8-C25正烷烴對(duì)所有揮發(fā)成分進(jìn)行標(biāo)定分析，并通過美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步確認(rèn)。各組分相關(guān)濃度通過峰面積歸一化法計(jì)算求出各化合物的峰面積相對(duì)含量。

2　結(jié)果與分析

2.1添加大青葉對(duì)酒曲發(fā)酵過程理化指標(biāo)的影響

不同添加量的大青葉對(duì)酒曲理化指標(biāo)的影響如圖1所示。

圖1　大青葉添加量對(duì)發(fā)酵過程中密度（a）、含水量（b）、酸度（c）變化的影響Fig．1 Effect of Folium isatidis addition on density（a），moisture content（b）and total titratable acidity（c）change during ferm entation

由圖1a可以看出，酒曲密度隨著大青葉添加量提高而下降，原因可能是添加大青葉使酒曲基質(zhì)疏松，添加量越大越疏松，導(dǎo)致密度越小，并隨著發(fā)酵推進(jìn)不斷下降，密度下降速率也隨添加量增加而增大，發(fā)酵6 d后添加9%大青葉的樣品密度從1.0 g/cm3降至0.63 g/cm3，降幅為37%；而不添加大青葉的樣品密度從1.18 g/cm3降至1.10 g/cm3，降幅為10%。這主要是與水分蒸發(fā)速率相關(guān)。由圖1b可以看出，開始時(shí)3個(gè)樣品含水量均＞55%，但添加大青葉的樣品略低于沒有添加的樣品，是因?yàn)闇缇^程前者水分損失大于后者所致；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，3個(gè)樣品的含水量均有所下降，下降速率隨大青葉添加量增加而增大，添加9%大青葉的樣品含水量降低了25%（4 d），而不加大青葉的樣品含水量下降了14%，說(shuō)明大青葉添加量越大，酒曲基質(zhì)越疏松，越容易造成水分的損失。含水量和密度的差異將對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)環(huán)境造成影響，一般含水量低、密度小的基質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，有利于酒曲氣流擴(kuò)散，提高傳質(zhì)傳熱效率［12］，對(duì)不同微生物種類的生長(zhǎng)和代謝造成不同的影響。由圖1c可以看出，酸度隨大青葉添加量增加而降低，發(fā)酵第2天時(shí)3個(gè)樣品酸度達(dá)到最大值，分別為1.38 mmol/10 g（9%大青葉），2.13 mmol/10 g（4.5%大青葉）和2.95 mm ol/10 g（不加大青葉），添加9%大青葉樣品的酸度只有不加大青葉樣品的47%，因?yàn)樗岫戎饕僧a(chǎn)酸細(xì)菌主導(dǎo)，含水量越高（大青葉添加量越?。?，細(xì)菌生長(zhǎng)越好，產(chǎn)酸量越大，酸度就越高，反之大青葉添加量越大，含水量越低，產(chǎn)酸量就越小，酸度就越低。同時(shí)，酸度的變化對(duì)酒曲微生物生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生反饋影響，并在酯化反應(yīng)生成風(fēng)味物質(zhì)過程中產(chǎn)生一定的作用［13］。由此可知，添加大青葉培養(yǎng)后酒曲密度、含水量和酸度均有所下降。

2.2添加大青葉對(duì)酒曲微生物生長(zhǎng)的影響

酒曲發(fā)酵是混菌發(fā)酵，其微生物有霉菌、酵母和細(xì)菌等三大類［14-16］。三類微生物的比例及數(shù)量是酒曲質(zhì)量的重要參數(shù)。不同添加量的大青葉對(duì)酒曲微生物指標(biāo)的影響如圖2所示。

圖2　大青葉添加量對(duì)發(fā)酵過程中細(xì)菌（a）、酵母（b）、霉菌（c）數(shù)量變化的影響Fig．2 Effect of Folium isatidis addition on bacterium（a），yeast（b）and mold（c）count change during fermentation

由圖2可知，不加葉、添加4.5%和9%大青葉樣品的細(xì)菌總數(shù)最大值出現(xiàn)在第6天，分別為1.25×108CFU/g、0.79×108CFU/g和0.55×108CFU/g；酵母細(xì)胞數(shù)最大值出現(xiàn)在第4天，分別為4.95×107CFU/g、0.76×107CFU/g和0.67×107CFU/g，之后少有下降；霉菌細(xì)胞數(shù)最大值也出現(xiàn)在第6天，分別為0.13×106CFU/g、0.25×106CFU/g和3.54×106CFU/g，可見，添加大青葉對(duì)細(xì)菌、酵母、霉菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響，其中對(duì)細(xì)菌和酵母產(chǎn)生抑制（尤其是對(duì)酵母菌的抑制率較大），而對(duì)霉菌生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。添加9%大青葉條件下細(xì)菌抑制率分別達(dá)到56%，酵母抑制率達(dá)到86.5%，而霉菌生長(zhǎng)率達(dá)到對(duì)照組和3.62倍。原因之一可能是大青葉的消炎殺菌成分對(duì)細(xì)菌和酵母有較大作用，而對(duì)霉菌的作用不大；另一個(gè)原因則是細(xì)菌和酵母對(duì)水活度的要求較高，而霉菌對(duì)水活度的要求較低，當(dāng)添加大青葉后使發(fā)酵基質(zhì)水分下降，使細(xì)菌和酵母的生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)降低了霉菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，使霉菌的生長(zhǎng)率大幅增加。根據(jù)大青葉添加量不同對(duì)3種微生物的抑制或促進(jìn)影響程度存在較大差異的特點(diǎn)，可以通過改變大青葉添加量實(shí)現(xiàn)對(duì)霉菌、酵母及細(xì)菌比例的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)酒曲發(fā)酵特性的目的，以生產(chǎn)具有特定特性的酒曲。

2.3添加大青葉對(duì)酒曲生物活性的影

添加大青葉對(duì)酒曲各種酶活力及發(fā)酵特性影響如圖3所示。

由圖3可知，酒曲糖化酶酶活隨著大青葉添加比例的增加而提高，添加9%大青葉時(shí)糖化酶最大值達(dá)到367 U/g，是不加葉樣品最大糖化酶酶活（70 U/g）的5.24倍。主要原因是大青葉促進(jìn)霉菌的生長(zhǎng)，而糖化酶活力與霉菌的生長(zhǎng)繁殖密切相關(guān)，因此糖化酶活力隨霉菌快速增長(zhǎng)而大幅提升。但液化酶則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，其酶活隨大青葉添加量的增加而降低，添加量為9%時(shí)降低30%，原因可能是由于基質(zhì)水含量過低降低霉菌代謝液化酶的能力，同時(shí)細(xì)菌、酵母生長(zhǎng)受到大青葉抑制也不利液化酶的代謝，具體確證數(shù)據(jù)還需要后續(xù)作深入研究。另一方面，發(fā)酵力隨大青葉添加量增加而降低，當(dāng)添加9%大青葉時(shí)發(fā)酵力為31.71 m L/（g·72 h），只達(dá)到不加葉樣品發(fā)酵力的10.3%，發(fā)酵力下降了接近90%。因?yàn)榘l(fā)酵力主要來(lái)源于活性酵母，添加大青葉抑制酵母的生長(zhǎng)，使酵母生長(zhǎng)量的降低，從而使發(fā)酵力隨之下降。添加大青葉后酯化力下降，從424 mg/（g·100 h）（不加葉）下降至85 mg/（g·100 h）（9%大青葉），下降達(dá)80%，原因主要是添加大青葉后導(dǎo)致酒曲水分下降，從而抑制酯化酶產(chǎn)率。可見，添加大青葉對(duì)酒曲發(fā)酵特性產(chǎn)生較大影響，體現(xiàn)為提升糖化酶活力，但降低發(fā)酵力、酯化力和液化酶活力，傳統(tǒng)酒曲生產(chǎn)中需要添加多種酒餅葉作為輔料，包括桂葉、大青葉、假鷹爪葉等，如果添加大青葉的比例過大將明顯降低酒曲發(fā)酵力、酯化力等指標(biāo)，因此適當(dāng)控制大青葉添加比例。

圖3　大青葉添加量對(duì)發(fā)酵過程中糖化酶活（a）、液化酶活（b）、發(fā)酵力（c）、酯化力（d）的影響Fig．3 Effect of Folium isatidis addition on saccharifying power（a），liquefying power（b），fermenting power（c）and esterifying powe r（d）during fermentation

2.4酒曲發(fā)酵過程中殘留揮發(fā)性成分分析

表2　添加不同比例大青葉的酒曲在發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分Table 2 Volatile com pounds of Jiuqu with different Folium isatidis addition during fermentation

由表2可知，添加大青葉使酒曲的揮發(fā)性成分明顯增多，由對(duì)照組的7種物質(zhì)增加到11～17種物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)從4種（1種甲酯和3種乙酯）增加至8種，新增的4種包括：辛酸-4-甲基苯酯、草酸-癸基苯基酯、9，12-十八碳二烯酸甲酯、棕櫚油酸甲酯等。這些酯并不是大青葉原有物質(zhì)，表示是生物合成或轉(zhuǎn)化的結(jié)果。有研究表明，酒曲發(fā)酵的通氣狀況及基質(zhì)成分會(huì)影響酯類物質(zhì)的生成［16-17］，本實(shí)驗(yàn)加入大青葉后對(duì)酒曲培養(yǎng)基的通氣條件及理化性質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，有利于促進(jìn)酒曲中酯類物質(zhì)的生成。

對(duì)照組測(cè)出的4種酯在發(fā)酵中期都存在，發(fā)酵后期消減或消失，到第6天發(fā)酵結(jié)束時(shí)只剩2種，包括棕櫚酸乙酯和油酸乙酯。添加大青葉對(duì)該4種酯類代謝或合成有促進(jìn)作用，第4天達(dá)到最大，這與酒曲的酯化力在第4天達(dá)到最大值（圖3）的結(jié)果吻合，可以解釋在第4天有大量酯類物質(zhì)生成的原因，但后期出現(xiàn)分解現(xiàn)象，只殘留1種，棕櫚酸乙酯或油酸乙酯。新增的四種酯類成分均在發(fā)酵至第4天檢測(cè)出來(lái)，且在第6天達(dá)到最大值，與對(duì)照組的4種酯后期被消減的合成機(jī)制不同，這有利于保障酒曲產(chǎn)品最終的酯類成分。

在檢出的2種醇類物質(zhì)中，新增了具有防腐功能的苯甲醇物質(zhì)，其含量隨大青葉添加量增加而增加，當(dāng)大青葉從4.5%增加至9%，苯甲醇值增加達(dá)3.76倍；相反，苯基乙醇（芳香類物質(zhì)）含量則隨大青葉的添加量增大有較大幅度的降低，與不添加大青葉酒曲比較，添加9%大青葉時(shí)苯基乙醇下降幅度達(dá)到81.6%。在整個(gè)發(fā)酵過程中，兩種醇類物質(zhì)均在第2～4天達(dá)到最大值，發(fā)酵后期有所減少，可推測(cè)這與物質(zhì)揮發(fā)以及成分轉(zhuǎn)化反應(yīng)有關(guān)。

另外，添加大青葉后還新增了其他幾種物質(zhì)，包括n-十六酸、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸、9，10-二氫化異長(zhǎng)葉烯、2，2，4，4，6-五甲基庚烷、9-十八烯酰胺，其中9-十八烯酰胺的含量最大，這些成分將對(duì)形成酒曲特有風(fēng)味起到重要作用。

3　結(jié)論

添加大青葉可調(diào)節(jié)酒曲基質(zhì)結(jié)構(gòu)較疏松、氣流擴(kuò)散和水分揮發(fā)，對(duì)培養(yǎng)過程酒曲密度、含水量和酸度產(chǎn)生影響。隨著大青葉添加比例的增加，發(fā)酵過程酒曲密度、含水量和酸度下降趨勢(shì)加劇，影響酵母、細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)與代謝，表現(xiàn)為促進(jìn)霉菌的生長(zhǎng)，但抑制酵母和細(xì)菌的生長(zhǎng)，提高糖化酶酶活，降低液化酶酶活、發(fā)酵力和酯化力等。傳統(tǒng)酒曲生產(chǎn)中需要添加多種酒餅葉作為輔料，包括桂葉、大青葉、假鷹爪葉等，如果添加大青葉的比例過大將明顯降低酒曲發(fā)酵力、酯化力等指標(biāo)，建議酒廠在酒曲實(shí)際生產(chǎn)過程中適當(dāng)控制大青葉添加比例。

添加大青葉后酒曲檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)比不添加的對(duì)照組明顯增多，包括新增4種酯類物質(zhì)，還有苯甲醇和多種高級(jí)脂肪酸、烷、烯、酰胺等物質(zhì)，但在新增的揮發(fā)性成分中沒有發(fā)現(xiàn)大青葉的原始成分，表明大青葉的揮發(fā)性成分不是直接殘留，而是在酒曲發(fā)酵中通過微生物代謝或轉(zhuǎn)化形成新的風(fēng)味物質(zhì)或功能成分，對(duì)酒曲的性能產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果將為酒曲中添加大青葉輔料工藝提供科學(xué)依據(jù)，并為添加其他中草藥輔料工藝提供借鑒。

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Effect of Folium isatidis on Jiuqu fermentation

GU Xuefeng1，HE Songgui2，LIU Youqiang2，WU Zhenqiang1*
（1.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.Guangdong Jiujiang Distillery Co.，Ltd.，F(xiàn)oshan 528203，China）

The effect of Folium Isatidis（FI）addition on Jiuqu fermentation was discussed.The results showed that FI addition was beneficial for aeration and heat-transfer in the fermentation as well as regulating the high acidity through reducing the substrate density and loosening the substrate structure.As a result，F(xiàn)I addition can promote mold grow th in Jiuqu，whereas inhibit yeasts and bacteria growth at the mean time，which resulted in biological activity change.The impact effect was promotional to the FI addition.When FI addition was 9%，the saccharifying enzymes activity im proved 4.24 times，the liquefying power，fermenting power and esterifying power decreased 30%，90%and 80%，respectively.Accordingly，F(xiàn)I addition significantly increased volatile compounds in Jiuqu，esters compounds species increased from 4 to 8，besides，benzyl alcohols，higher aliphatic acids，alkanes，alkenes，am ides and some other alcohols were increased，which could contribute significant influence on Jiuqu flavor.

Jiuqu fermentation；Folium isatidis；microorganism；fermenting power；esterifying power

TS261．4

0254-5071（2016）05-0065-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．014

2016-03-10

廣東省江門市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（20150160008347）

谷雪峰（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、酒類發(fā)酵。

吳振強(qiáng)（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、天然產(chǎn)物發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化。