余慧燕　鄧斐　王慎驕　霍翔　戴啟剛　祁賢

210009 南京，江蘇省疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防治所

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·論著·

1株H5N6亞型禽流感病毒分子特征分析

余慧燕鄧斐王慎驕霍翔戴啟剛祁賢

210009 南京，江蘇省疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防治所

目的對(duì)從某活禽市場(chǎng)環(huán)境中分離出的1株H5N6亞型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/C13/2013，en/c13)進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，以揭示其基因起源和分子遺傳特征。 方法 采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)該分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。 結(jié)果 分離株NA基因與近年來(lái)中國(guó)禽類中流行的H6N6亞型禽流感的NA基因處于同一進(jìn)化分支，其他7個(gè)基因(PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)都與近年來(lái)東亞地區(qū)流行的H5N1亞型禽流感的相應(yīng)基因處于同一進(jìn)化分支，分離株en/c13的HA蛋白裂解位點(diǎn)為PLREKRRKR↓GLF，是高致病性禽流感病毒的典型分子特征序列。HA蛋白上關(guān)鍵受體結(jié)合位點(diǎn)226和228位(按照H3亞型的HA蛋白序列排序)氨基酸分別是Gln和Gly，是典型的禽流感病毒受體結(jié)合特征。 結(jié)論 本研究從環(huán)境中分離到一株新的基因重配禽流感病毒，其中NA基因來(lái)源于H6N6禽流感病毒，而其他7個(gè)基因則來(lái)源于H5N1禽流感病毒。結(jié)果提示我國(guó)禽流感病毒基因重配頻繁，進(jìn)化活躍，需要加強(qiáng)對(duì)禽流感病毒的持續(xù)監(jiān)測(cè)。

【主題詞】禽流感病毒；H5N6亞型；基因重配

Fund programs: Key Provincial Talents Program of Jiangsu Province, China(RC2011084); Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China(BK20131450)

甲型(A)流感病毒屬于正黏病毒科，根據(jù)其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨基酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性差異，可將甲型流感病毒可劃分為不同的血清亞型，目前已鑒定出18種HA亞型(H1-H18)和11種NA亞型(N1-N11)[1-3]。甲型流感病毒宿主較為廣泛，可以感染人和多種動(dòng)物。目前有文獻(xiàn)記載的可以感染人的禽流感病毒主要有H5、H9、H7和H10等亞型[4]。

自2014年以來(lái)，中國(guó)、老撾、越南等東南亞國(guó)家相繼報(bào)道在禽類中出現(xiàn)H5N6亞型高致病性禽流感病毒，更為嚴(yán)峻的是在中國(guó)四川、廣東及云南已發(fā)生3例人感染H5N6高致病性禽流感病毒危重病例[5]。H5N6禽流感病毒已給民眾生計(jì)和動(dòng)物安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，對(duì)H5N6禽流感病毒進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)具有非常現(xiàn)實(shí)的公共衛(wèi)生意義。2013年，本研究從鎮(zhèn)江市某活禽市場(chǎng)的環(huán)境樣本中分離到一株H5N6亞型禽流感病毒，在全基因組序列基礎(chǔ)上對(duì)病毒的基因起源和遺傳特征進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑: 病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；ExTaq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、RNA酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor, RANsin)和隨機(jī)引物購(gòu)自大連寶生物日本TaKaRa公司； Nextera XT DNA Sample Preparation Kit及Illumina MiSeq測(cè)序系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Illumina公司；Qubit? dsDNA HS Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；High Sensitivity DNA assay kit購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.1.2引物: 依據(jù)A型流感病毒基因片段的核苷酸保守序列設(shè)計(jì)病毒通用引物：UFLUA-IF、UFLUA-IR用于擴(kuò)增全基因組；逆轉(zhuǎn)錄引物：Uni12(M)[6]，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2方法1.2.1病毒分離: 標(biāo)本由鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心提供，接種9-11日齡SPF雞胚，37培養(yǎng)72 h，每天觀察雞胚生長(zhǎng)情況。所有操作都在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。1.2.2測(cè)序: 提取病毒基因組RNA，以U12反轉(zhuǎn)錄引物生成單鏈cDNA，通過(guò)A型流感病毒通用引物一步法擴(kuò)增流感病毒基因組8個(gè)節(jié)段。將純化的PCR產(chǎn)物定量后，稀釋成0.2 ng/μl，按照Nextera XT DNA Sample Preparation Kit說(shuō)明構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。步驟包括DNA的Tagmentation、PCR擴(kuò)增、純化、文庫(kù)標(biāo)化及混合。取800 μl混合樣加入MiSeq測(cè)序試劑樣品孔進(jìn)行全基因序列測(cè)定。

1.2.3進(jìn)化樹構(gòu)建: 采用CLC Genomics workbench(CLC Bio)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接整理，將序列用Blast進(jìn)行同源性檢索。MEGA6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰近歸并法(Neighbor-Joining)法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，用Bootstrap重復(fù)抽樣1000次對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。

2　結(jié)果

2.1病毒分離處理好的標(biāo)本接種雞胚，24-72 h接種的雞胚全部死亡，收獲尿囊液，貯存于-70℃?zhèn)溆?。尿囊液血凝效價(jià)為29；熒光RT-PCR檢測(cè)，尿囊液甲型流感病毒M基因核酸陽(yáng)性。分離株命名為A/ environment/ Zhenjiang/ C13/ 2013(en/c13)。

2.2基因來(lái)源分析通過(guò)2代測(cè)序平臺(tái)，在標(biāo)本SPF雞胚接種物中，獲得分離株en/c13的全基因組序列(8基因GenBank序列號(hào)分別為KJ938655-KJ938662)。通過(guò)BLASTn軟件在線分析，初步確定分離株en/c13為H5N6亞型。為了探究病毒的基因來(lái)源，對(duì)分離株en/c13的8基因片段序列與參考株的核苷酸同源性進(jìn)行比較分析，確認(rèn)8個(gè)片段核苷酸最大相似性的參考株(表1)。分離株en/c13 NA基因核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列與近年來(lái)中國(guó)流行的H6N6禽流感病毒(如 A/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)等)的同源性高達(dá)98%；而其他7個(gè)片段(包括PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列與近年來(lái)東亞地區(qū)流行的H5N1流感病毒[如A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1), A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)等]的同源性都高達(dá)95%至99%。

NA基因進(jìn)化樹上，分離株en/c13與中國(guó)流行的H6N6毒株處于一個(gè)分支(圖1)；其他7個(gè)片段(包括PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)則與近年來(lái)流行的H5N1流感病毒處于一個(gè)進(jìn)化分支上(圖2)。對(duì)于HA基因片段進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)分離株en/c13與其核苷酸相似性最高的毒株均屬于進(jìn)化分支clade 2.3.4.4。自2010年以來(lái)，clade 2.3.4.4在我國(guó)的禽類中已頗為流行，成為H5亞型禽流感病毒的一個(gè)新的優(yōu)勢(shì)進(jìn)化分支。

2.3基因分子特征分析在全基因組序列分析的基礎(chǔ)上，對(duì)分離株en/c13編碼蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了分析。分離株en/c13 HA蛋白的裂解位點(diǎn)氨基酸序列為PLREKRRKR↓GLF，含有多個(gè)堿性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒的分子特性。HA蛋白的受體結(jié)合區(qū)226位和228位氨基酸沒有發(fā)生突變(分別為Gln和Gly)，理論上對(duì)禽消化道上皮細(xì)胞α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)受體有親嗜性。NA蛋白276(H→Y)和R294K(R→K)位點(diǎn)沒有發(fā)生突變，保留了病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑的敏感。PB2蛋白的591位、627位和701位氨基酸分別為Gln、Glu和Asp，是典型的禽流感病毒分子特征。此外，NS-1蛋白的C末端具有ESEV基序，是禽流感病毒一個(gè)典型毒力分子標(biāo)記。

圖1　HA 基因進(jìn)化樹分析Fig.1　Phylogenetic tree for the HA gene

圖2　NA基因進(jìn)化樹分析Fig.2　Phylogenetic tree for the NA gene

基因節(jié)段Genesegment親緣關(guān)系最近的毒株Closestinfluenzavirusrelative核苷酸一致性(%)Nucleotideidentity(%)PB2A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)94.7PB1A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)96.7PAA/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)A/chicken/Vietnam/NCVD-KA423/2013(H5N1)A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)98.898.898.8HAA/wildduck/Shandong/628/2011(H5N1)96.9NPA/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)97.997.9NAA/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)97.7MA/wildduck/Fujian/1/2011(H5N1)A/wildduck/Fujian/2/2011(H5N1)99.099.0NSA/Muscovyduck/Vietnam/LBM634/2014(H5N1)A/muscovyduck/Vietnam/LBM636/2014(H5N1)98.598.5

3　討論

基因重配是甲型流感病毒進(jìn)化的分子機(jī)制之一。不同亞型或者不同宿主來(lái)源的流感病毒通過(guò)基因重配而產(chǎn)生的子代病毒，具有明顯的選擇優(yōu)勢(shì)，也是產(chǎn)生人類流感大流行病毒的一種主要方式[7]。自1996年在我國(guó)廣東分離到高致病性H5N1禽流感病毒以來(lái)，該病毒對(duì)人類和動(dòng)物健康造成持續(xù)的危害，其遺傳進(jìn)化也異?；钴S[8]。本研究在禽流感環(huán)境監(jiān)測(cè)中分離到一株H5N6病毒，基因分析表明該病毒是一株由H5N1和H6N6病毒重配的新病毒。研究結(jié)果證實(shí)H5N6病毒在我國(guó)華東地區(qū)也有流行，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)該地區(qū)的禽流感監(jiān)測(cè)。

基因點(diǎn)突變是流感病毒進(jìn)化的另一種重要機(jī)制[3]。禽流感病毒若要突破種屬障礙成功跨種感染人，一些重要蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)要發(fā)生相應(yīng)的突變。分離株en/c13的HA蛋白的裂解位點(diǎn)含有多個(gè)堿性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒的分子特征，表明該病毒對(duì)家禽具有較大的危害。HA蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合是感染發(fā)生的關(guān)鍵一步[9]。與HA蛋白結(jié)合的細(xì)胞受體有兩類：α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)和α2-6半乳糖苷唾液酸(SAα2-6Gal)。禽類消化道主要表達(dá)SAα2-3Gal受體，而人呼吸道上皮細(xì)胞主要表達(dá)SAα2-6Gal受體，因此禽流感病毒跨物種感染人的首要前提是HA蛋白受體結(jié)合特性的轉(zhuǎn)變。HA蛋白受體結(jié)合區(qū)的一些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)在受體親嗜性轉(zhuǎn)變中起著關(guān)鍵作用，本研究中分離株en/c13的HA蛋白受體結(jié)合區(qū)的226和228位點(diǎn)沒有發(fā)生突變，理論上對(duì)SAα2-6Gal受體的結(jié)合能力較弱，是典型的禽受體特征。此外，分離株en/c13的PB2蛋白627位點(diǎn)沒有發(fā)生突變，表明該病毒在人體內(nèi)復(fù)制能力較差。雖然分離株en/c13不具備感染人的某些分子特征，但病毒未來(lái)進(jìn)化變異趨勢(shì)值得關(guān)注，除了基因重配，持續(xù)的點(diǎn)突變也可能增強(qiáng)H5N6病毒對(duì)人體的感染能力，從而可能產(chǎn)生引起人類新的流感大流行毒株。

[1]Tong S, Zhu X, Li Y, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(10): e1003657.dio:10.1371/journal.ppat.1003657.

[2]Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats[J]. Proc Natl Acad Sci Acad USA, 2012, 109:4269-4274. doi:10.1073/pnas.1116200109.

[3]祁賢, 湯奮揚(yáng). H7N9禽流感病毒的生物學(xué)特征及進(jìn)化趨勢(shì)[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2014, 25:47-50.doi:10.13668/j.issn.1006-9070.2014.02.017.

[4]De Vries E, Guo H, Dai M, et al. Rapid Emergence of Highly Pathogenic Avian Influenza Subtypes from a Subtype H5N1 Hemagglutinin Variant[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21:842-846.doi:10.3201/eid2015.141927.

[5]Pan M, Gao R, Lv Q,et al. Human infection with a novel highly pathogenic avian influenza A (H5N6) virus: Virological and clinical findings[J]. J Infect,2015,06.009.0163-4453.dio:10.1016/j.jinf.2015.06.009.

[6]Hoffmann E, Stech J, Guan Y, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A virus [J]. Arch Virol.2001,146:2275-2289.doi:10.1007/s007050170002.

[7]Kawaoka Y, Krauss S, Webster RG. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics[J]. J Virol.1989,63:4603-4608.

[8]Guan Y, Poon LL, Cheung CY,et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat[J]. Proc Natl Acad Sci Acad USA,2004,101:8156-8161.doi:10.1073/pnas.0402443101.

[9]Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368: 1888-1897.doi:10.1056/NEJMoa1304459.

Molecular characterization analysis of one H5N6 subtype influenza virus

YuHuiyan,DengFei,WangShenjiao,HuoXiang,DaiQigang,QiXian

DepartmentofAcuteInfectiousDiseaseControlandPrevention,JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China

QiXian,Email:qixiansyc@hotmail.com

ObjectiveOne H5N6 subtype avian influenza virus, A/environment/ Zhenjiang/C13/2013, was isolated from environment in Zhenjiang in 2013 during epidemiological surveillance and was identified by HA/HI test and specific RT-PCR test. H5N6 AIV was subjected to genome sequencing to investigate the genomic composition. MethodsThe next-generation sequencing (NGS) Illumina MiSeq Platform was used to obtain complete genome sequence information from influenza virus isolates. MEGA6.0 software was used to align the eight fragments of the virus. The phylogenetic and molecular characteristics of the isolate were analyzed by Neighbor-Joining method. ResultsBlast searches demonstrated that the NA gene belonged to the same clade with H6N6 viruses currently circulating in China, whereas the other seven genes were found to be more similar to those of eastern Asian H5N1 AIV strains gene. The amino acid motif of cleavage site between HA1 and HA2 was PLREKRRKR↓GLF, which was the typical characteristics of the HPAIVs. The receptor binding site in the viral HA gene possesses the residues Gln 226 and Gly 228 (H3 numbering), indicating an avian-like receptor binding specificity. ConclusionOne H5N6 subtype avian influenza virus was isolated from environment, phylogenetic analysis showed that the NA gene belonged to the same clade with H6N6 viruses. The other seven genes belonged to H5N1 subtype. It suggests that strengthen the continuous surveillance of avian influenza A viruses is necessary.

Avian influenza virus; H5N6 subtype; gene reassortment

祁賢，Email：qixiansyc@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.006

江蘇省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才基金(RC2011084)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131450)

2015-08-25)