閆江泓　呂新軍　陶曉燕　于鵬程　吳未辰　李淑英　朱武洋

063000 唐山, 華北理工大學基礎醫(yī)學院，河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室(閆江泓、李淑英)；100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(呂新軍、陶曉燕、于鵬程、吳未辰、朱武洋)

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·技術方法·

EV71檢測細胞系的構建與鑒定

閆江泓呂新軍陶曉燕于鵬程吳未辰李淑英朱武洋

063000 唐山, 華北理工大學基礎醫(yī)學院，河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室(閆江泓、李淑英)；100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(呂新軍、陶曉燕、于鵬程、吳未辰、朱武洋)

目的構建71型腸道病毒 (enterovirus 71, EV71)檢測細胞系。方法以含有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的EV71感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP為分子基礎，構建GFP基因嵌入病毒基因組兩端非編碼區(qū)的表達盒UGFP，并將其克隆入質粒pLV-Puro獲得慢病毒表達載體pLV-UGFP。將質粒pLV-UGFP和包裝質粒Helper用脂質體轉染法共轉染入HEK293T細胞中，轉染48 h后，用收集到的慢病毒顆粒感染BHK-21細胞，經嘌呤霉素壓力篩選和系列稀釋法獲得用于外源EV71檢測的工程細胞系BHK/UGFP。結果BHK/UGFP細胞感染EV71 48 h后，可檢測到GFP的表達，作為對照組細胞感染甲病毒屬的辛德畢斯病毒(XJ-160)和黃病毒屬的乙腦病毒(P3)等單股正鏈RNA病毒，則檢測不到綠色熒光。該檢測細胞系用不同滴度的EV71感染，至少可以檢測到10 PFU/ml的EV71。結論構建的BHK/UGFP檢測細胞系可用于外源EV71的檢測，且該檢測方法特異性和靈敏性均良好。

【主題詞】腸道病毒屬； 工程細胞系

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China for“Control and Prevention of Major Infectious Diseases of China”(2014ZX10004-002)；National Science and Technology Infrustructure Program(2014BAI13B04)；National Natural Science Foundartion of China(31500152)

腸道病毒71型((enterovirus 71, EV71))是小 RNA 病毒科(picornaviridae)腸道病毒屬(entero-virus)的重要成員。EV71基因組全長約7500 bp，基因組兩端為非編碼區(qū)(Untranslated region, UTR)，編碼的前體蛋白被2A和3C蛋白酶切割為四個結構蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4)和七個非結構蛋白(2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)[1]基因。EV71是手足口病(Hand-Foot-Mouse Disease)的主要病原體，可導致嚴重的中樞神經系統(tǒng)疾患，個別危重者甚至死亡。由于EV71的致病機制尚不清晰，目前尚無有效的抗病毒藥物，EV71 4C基因亞型疫苗已完成前期臨床試驗，免疫應答作用較好。因而，建立早期快速的EV71診斷方法具有重要意義。

近年來，科研人員將報告基因序列引入到病毒基因組，通過缺失病毒某部分的特定元件成功構建病毒缺陷型復制子，由于缺失病毒正常復制和翻譯的基因，將這種缺陷型復制子導入細胞后，缺陷型復制子只有通過某些特定病原體進入細胞通過反式作用引發(fā)一些列的病毒特異反應，進一步啟動報告基因的表達。通過觀察報告基因的表達情況，實現(xiàn)對某種病毒的檢出，該方法從缺陷型復制子這一角度為病毒檢測提供了一種簡單、直觀的新方法。Tzeng等構建了用于檢測麻疹病毒的攜帶綠色熒光蛋白報告基因的缺陷型RNA復制子，檢測結果顯示特異性良好[2]。Hossain等構建并篩選了用于檢測甲型流感病毒的含有熒光素酶報告基因的MDCK檢測細胞系[3]。鑒于此，本研究以含有綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因的EV71病毒感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP為分子基礎，構建了可用于腸道病毒71型檢測的、具有較好特異性和敏感性的工程細胞系。

1　材料與方法

1.1實驗材料E.coliStbl 3感受態(tài)細胞購自索萊寶；大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)DH5α感受態(tài)細胞購于TaKaRa公司；含有EGFP基因的EV71病毒感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP為中國科學院生物物理研究所張立國研究員惠贈；BHK-21細胞、HEK293T細胞均為本室保存。

1.2試劑及工具酶T4DNA連接酶購自Promega公司；XhoI、BamHI等限制性內切酶購自Fermentas公司；pMD18-T克隆載體、DNA Marker、PCR相關試劑均為TaKaRa公司產品；凝膠回收試劑盒/PCR產物純化試劑盒(QIAquick? Gel Extraction Kit/PCR Purification Kit)，小量質粒提取試劑盒(Qiagen Plasmid Mini prep Kit)和大量質粒提取試劑盒(Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit)購自Qiagen公司； X-tremeGENE HD Transfection Reagent轉染試劑購于Roche公司；慢病毒載體pLV-Puro及其輔助質粒Helper為本科室保存；DAPI、G418、嘌呤霉素(Puromycin)、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清購于Gibco公司。

1.3構建UGFP基因過表達慢病毒載體以EV71病毒感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFPEGFP為分子基礎，人工合成EGFP基因嵌入病毒基因組兩端非編碼區(qū)的表達盒UGFP，并在表達盒的兩端加入XhoI、BamHI單一內切酶位點。將經XhoI /BamHI雙酶切后的表達盒與慢病毒載體pLV-puro骨架用T4 DNA Ligase連接，連接產物轉化到感受態(tài)細胞E.coliStbl3后經PCR鑒定和測序驗證獲得慢病毒表達載體pLV-UGFP(圖1)。

1.4慢病毒顆粒包裝和制備取2 μg成功構建的缺陷型慢病毒表達載體pLV-UGFP、3 μg包裝質粒Helper，加入無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基至終體積300 μl，再添加 6 μl PlusTMReagent，混勻后室溫孵育15 min后加入X-tremeGENE HD Transfection Reagent轉染試劑9 μl，置于室溫孵育15 min，輕柔混合后，吸取液體均勻點滴至HEK293T細胞培養(yǎng)瓶中。轉染48 h后，用移液管小心地吸取細胞瓶內的上清液，收集并分裝至1.5 ml的EP管內，置于-80°C冰箱內備用。

1.5EV71檢測細胞的篩選將收集好的慢病毒懸液感染BHK-21細胞，感染48 h后加入嘌呤霉素使培養(yǎng)液的終濃度為3 μg/ml壓力篩選10 d，至無新的死亡細胞出現(xiàn)，將嘌呤霉素濃度降至1 μg/ml，繼續(xù)擴大培養(yǎng)獲得用于EV71檢測的多克隆細胞株。用96孔板稀釋法繼續(xù)擴大培養(yǎng)，獲得生長狀態(tài)良好的單克隆細胞株，即為用于EV71檢測的工程細胞系BHK/UGFP。

1.6EV71檢測細胞系的特異性將BHK/UGFP細胞、正常的BHK-21細胞分別培養(yǎng)至24孔板內，分別感染200 μl感染復數(shù)為MOI=0.05的EV71和甲病毒屬的辛德畢斯病毒(XJ-160)、黃病毒屬的乙腦病毒(P3)等單股正鏈RNA病毒，病毒吸附1 h后，加入300 μl含2% 胎牛血清的DMEM維持液，在含5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用DAPI侵染細胞核后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白報告基因的表達情況。

1.7EV71檢測細胞的靈敏性將處于對數(shù)生長期的BHK/UGFP細胞培養(yǎng)至24孔板內，分別感染病毒滴度分別為1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101和1PFU/ml的EV71。細胞被病毒感染48 h后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。

2　結果

2.1慢病毒表達質粒的制備以EV71感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP為分子基礎，將人工合成的表達盒UGFP克隆入質粒pLV-puro構建慢病毒表達載體，經酶切、菌落PCR鑒定陽性的重組質粒測序鑒定，測序正確的重組質粒即為用于EV71檢測細胞系篩選的缺陷型慢病毒表達質粒，命名為pLV-UGFP。

2.2EV71檢測細胞系BHK/UGFP的特異性分析為鑒定所制備細胞系的功能特征及其特異性，將經嘌呤霉素和96孔板系列稀釋法篩選到的BHK/UGFP細胞和正常的BHK-21細胞，分別感染EV71和辛德畢斯(XJ-160)、乙腦(P3)等單股正鏈RNA病毒。檢測結果顯示，BHK/UGFP細胞感染EV71 48 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到特異的綠色熒光，而正常的BHK-21組和辛德畢斯、乙腦病毒組則不出現(xiàn)綠色熒光(圖2)。結果表明，篩選到的用于EV71檢測的細胞系細胞BHK/UGFP能夠檢測到EV71病毒，且具有良好的特異性。

圖2　BHK/UGFP的功能特性和檢測特異性分析Fig.2　Function and specificity analysis of BHK/UGFP cells

圖3　細胞系BHK/UGFP基礎上EV71病毒檢測方法的靈敏性分析Fig.3　Sensitivity of EV71 detection on the basis of BHK/UGFP cells

2.3EV71檢測細胞系BHK/UGFP的靈敏性分析為對細胞系BHK/UGFP基礎上EV71檢測方法的靈敏性加以分析，用BHK/UGFP細胞感染不同滴度的EV71，細胞感染病毒48 h后，檢測結果表明，當細胞感染的病毒滴度下降為1 PFU/ml時就不能觀察到GFP的表達，而當細胞感染EV71的滴度為10 PFU/ml及以上時則可以在熒光顯微鏡下觀察到特異的綠色熒光。本研究結果表明，用于EV71檢測的工程細胞系BHK/UGFP至少可以檢測出滴度為10 PFU/ml以上的EV71，其靈敏度介于1-10PFU/ml之間(圖3)。

3　討論

隨著對病毒基因結構及功能的深入研究，工作人員發(fā)現(xiàn)可以將報告基因插入到病毒基因組中，利用病毒獨特的復制、翻譯機制，開發(fā)了多種病毒復制子載體用以表達報告基因和目的蛋白[4,5]。在這種策略的基礎上，缺失病毒基因組的某些必須基因，使其缺失病毒正常復制和翻譯的功能，進而構建攜帶報告基因的重組缺陷型復制子載體，將其導入細胞后無法正常表達，當相應的外源病毒感染細胞時才能啟動報告基因的表達，從而根據(jù)熒光蛋白信號的有無，來判斷樣本中是否有相應病毒的感染[6,7]。

EV71感染在嬰幼兒中引發(fā)的手足口病已經成為一種嚴重的傳染病，并呈逐年升高的趨勢。近年來對于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過程還不清楚，且有效的治療方法匱乏，常導致嚴重的臨床后果，因此明確HFMD病原，建立針對EV71的早期快速檢測方法非常重要。據(jù)此，本研究以含有綠色熒光蛋白基因的EV71感染性克隆pWSK-T7-EV71-GFP為分子基礎，構建了含有GFP和EV71啟動序列修飾的工程細胞系BHK/UGFP，用于腸道病毒71型的檢測，以該缺陷型細胞系為基礎的檢測方法具有較好的特異性和敏感性。這種新的檢測策略避免了標本核酸提取等繁瑣的操作，可在48 h左右得出結果。另一方面，本檢測方法只需將樣本加入到細胞，而無需滅活，這樣更有力于相關病原體的后續(xù)研究。

[1]Lin JY, Chen TC, Weng KF, et al. Viral and host proteins involved in picornavirus life cycle[J]. J Biomed Sci, 2009, 16(1): 103. doi: 10.1186/1423-0127-16-103.

[2]Tzeng WP, Zhou Y, Icenogle J, et al. Novel replicon-based reporter gene assay for detection of rubella virus in clinical specimens[J]. J Clin Microbiol,2005,43(2):879-885. doi:10.1128/JCM.43.2.879-885.2005.

[3]Hossain M J, Perez S, Guo Z, et al. Establishment and characterization of a Madin-Darby canine kidney reporter cell line for influenza A virus assays [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(7): 2515-2523. doi:10.1128/JCM.02286-09.

[4]Quetglas J I, Ruiz-Guillen M, Aranda A, et al. Alphavirus vectors for cancer therapy[J]. Virus Res,2010, 153(2): 179-196. doi:10.1016/j.virusres.2010.07.027.

[5]Alcaraz-Estrada SL, Reichert ED, Padmanabhan R. Construction of self-replicating subgenomic West Nile virus replicons for screening antiviral compounds[J]. Methods, 2013,1030: 283-299.doi:10.1007/978-1-62703-484-5_22.

[6]Kung SH, Wang YC, Lin CH, et al. Rapid diagnosis and quantification of herpes simplex virus with a green fluorescent protein reporter system[J].J Virol Methods, 2000,90(2): 205-212.doi:10.1016/S0166-0934(00)00234-2.

[7]Li J, Zhu W, Wang H, et al. Rapid, specific detection of alphaviruses from tissue cultures using a replicon-defective reporter gene assay[J].PloS One,2012,7(3):e33007. doi.org/10.1371/journal.pone.0033007.

Construction and identification of the cell line for detecting Enterovirus 71

YanJianghong,LyuXinjun,TaoXiaoyan,YuPengcheng,WuWeichen,LiShuying,ZhuWuyang

HebeiKeyLaboratoryforChronicDiseases,TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases,SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China(YanJH，LiSY);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(LyuXJ,TaoXY,YuPC,WuWC,ZhuWY)

LiShuying,lsy5001@sina.com；ZhuWuyang,Email:zhuwuyang1971@sina.com

ObjectiveTo select and identify the cell line for detecting Enterovirus 71 (EV71). MethodspWSK-T7-EV71-GFP containing green fluorescent protein (GFP) gene is an infectious clone for EV71, based on which the UGFP cassette was constructed by inserting GFP gene into 5′ and 3′ untranslated region (UTR) of the genome of EV71. The lentiviral expression plasmid pLV-UGFP containing UGFP was constructed on the basis of pLV-Puro, a lentiviral vector. To obtain lentivirus, pLV-UGFP plasmids were transfected together with the packaging plasmids into HEK293T cells by liposomes. Then, the target cells BHK-21 were infected with the lentivirus particles. Puromycin-resistant cell colonies were detached from the 6 well-plate and sub-cloned by use of 96 well-plate. Finally, we selected the packaging cell lines that could express the defective replicons stably, named BHK/UGFP cells. ResultsGFP expression assays indicated that BHK/UGFP cells infected with EV71 could express GFP at 48 hours post-infection, while no green fluorescence was observed after BHK/UGFP cells were infection with Sindbis virus (SINV, XJ-160) or Japanese encephalitis virus (JEV, P3), demonstrating that the selected cells could specifically detect EV71 infection. The sensitive assay results indicated that this method on the basis of BHK/UGFP cells could at least detect 10 PFU/ml of EV71 in tissue culture. ConclusionThis result indicated that the BHK/UGFP cells selected in this study were specific and effective to detect EV71 from tissue culture.

Enterovirus； Cell lines

李淑英，Email：lsy5001@sina.com；朱武洋，Email:zhuwuyang1971@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.016

艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(2014ZX10004-002)；國家科技支撐計劃(2014BAI13B04)；國家自然科學基金(31500152)

2016-03-08)