曹冉冉　劉李　朱昱錕　王順東　何吉蘭

610041 成都，四川省疾病預(yù)防控制中心(曹冉冉、劉李、何吉蘭)；637000 南充市疾病預(yù)防控制中心(朱昱錕)；635000 達(dá)州市疾病預(yù)防控制中心(王順東)

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·論著·

2015年四川省麻疹病毒分子流行病學(xué)特征分析

曹冉冉劉李朱昱錕王順東何吉蘭

610041 成都，四川省疾病預(yù)防控制中心(曹冉冉、劉李、何吉蘭)；637000 南充市疾病預(yù)防控制中心(朱昱錕)；635000 達(dá)州市疾病預(yù)防控制中心(王順東)

目的 分析四川省2015年流行的麻疹病毒的基因型別和核蛋白基因特征,了解不同基因型別麻疹病毒在省內(nèi)流行情況。方法采集疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本，用Vero/SLAM細(xì)胞分離病毒。對分離培養(yǎng)陽性毒株，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增核蛋白N基因片段并進(jìn)行序列測定和分析。結(jié)果從971份疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本中分離得到398株麻疹病毒。397株分離株為H1基因型，與H1基因型參考株核苷酸同源性為96.2%-98.0%；在進(jìn)化樹上呈現(xiàn)為2個分支，分支間平均核苷酸差異率為2.0%。1株分離株為A基因型，與A基因型參考株核苷酸同源性為98.0%。結(jié)論H1基因型為2015年四川省本土流行麻疹病毒的優(yōu)勢基因型；近年來四川省內(nèi)流行的毒株未發(fā)生較大變化，但存在一定核苷酸差異，呈現(xiàn)2個傳播鏈，需進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)測。

【主題詞】麻疹病毒；核蛋白類；基因型

麻疹是常見的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，傳染性極強(qiáng)，易引起暴發(fā)流行。隨著天花的消滅以及無脊灰狀態(tài)在多數(shù)地區(qū)的實現(xiàn)，麻疹被WHO列為下一個擬被消除的傳染病。但2005年我國大部分地區(qū)麻疹疫情有所回升[1-3]。四川省從2009年以來麻疹疫情也有所上升，局部地區(qū)發(fā)生麻疹暴發(fā)流行[4]。特別是2015以來，僅上半年疑似麻疹病例數(shù)達(dá)971例，遠(yuǎn)超2010-2014年同期平均水平74例。為從分子水平分析四川省麻疹流行的原因，探討消除麻疹策略，對四川省2015年上半年分離到的398株麻疹病毒核蛋白N基因進(jìn)行序列測定，并進(jìn)行基因型別鑒定和特征分析。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本采集采集疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本，保存在病毒標(biāo)本運(yùn)輸液中，-20 ℃或以下溫度保存，冷凍運(yùn)輸。標(biāo)本用終濃度為1 000 U /ml的青霉素和1 000 g /ml的鏈霉素處理，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2病毒分離將處理后的標(biāo)本接種于生長良好的 Vero /SLAM 單層細(xì)胞，置5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)7 d，每日觀察細(xì)胞病變。當(dāng)75% 以上的細(xì)胞呈現(xiàn)特異性巨細(xì)胞融合病變時收獲。若無病變需連續(xù)盲傳 3代，仍無細(xì)胞病變則為陰性。

1.3病毒RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)用Promega公司Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit按試劑盒說明書提取病毒 RNA。用Invitrogen公司的Super Script III One-step RT-PCR System with platinumTaqDNA Polymersase試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增編碼N蛋白羧基末端的核苷酸序列。引物MV216：5′- TGGAGCTATGCCATGGGAGT-3′(1 104-1 123 bp),引物MV214：5′-TAACAATGATGGAGGGTAGG-3′(1 737-1 718 bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為634 bp。PCR擴(kuò)增條件：50 ℃ 25 min，94 ℃2 min; 94 ℃15 s、55 ℃ 30 s、68 ℃75 s，40個循環(huán); 68 ℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4序列測定擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物有限技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。

1.5序列分析核苷酸序列經(jīng)Sequencher 5.0校對后，與各基因型參考株核苷酸序列進(jìn)行比對(編碼N蛋白羧基末端的456個核苷酸序列)，用MEGA 4.1軟件作進(jìn)化樹分析(Kimura 2參數(shù)模型，鄰位-連接法，1 000次bootstrap檢驗)，根據(jù)分支聚集確定基因型別[5]。

2　結(jié)果

2.1病毒分離四川省下設(shè)21個市州，2015年上半年共采集971份疑似麻疹病例咽拭子標(biāo)本，來源于省內(nèi)17個市州。綿陽市、遂寧市、自貢市和內(nèi)江市無報告病例，因此未采集標(biāo)本。標(biāo)本接種Vero /SLAM細(xì)胞后，分離得到398株麻疹病毒。

2.2RT-PCR398株麻疹病毒分離物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，均出現(xiàn)大小為634 bp的特異性條帶。

圖1　2015年四川省398株麻疹病毒與各基因型代表株進(jìn)化關(guān)系樹Fig.1　Phylogenetic tree of 398 measles virus isolates in Sichuan province in 2015 compared with Reference Strains for each genotype

2.3序列測定和分析2015年四川省398株麻疹病毒與各基因型代表株共同建立進(jìn)化關(guān)系樹(圖1)。397株分離株與H1基因型參考株(AF045212)聚集在同一分支上，核苷酸同源性為96.2%-98.0%，屬于H1基因型；與H1a基因亞型參考株(Chin9322)核苷酸同源性為97.3%-99.1%，屬于H1a基因亞型；397株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上呈現(xiàn)2個分支，命名為Cluster Ⅰ和Cluster Ⅱ，分支間平均核苷酸差異率為2.0%。1株分離株與A基因型參考株(U01987)聚集在同一分支上,核苷酸同源為98.0%，與疫苗株Changchun47、Shanghai191同源性分別為97.8%、98.0%。

2.4麻疹病毒ClusterⅠ和Cluster Ⅱ在四川省內(nèi)分布情況各市州采集標(biāo)本數(shù)、麻疹病毒Cluster I和Cluster II毒株數(shù)及構(gòu)成比見表1，Cluster I和Cluster II在四川地理分布見圖2。

圖2　麻疹病毒Cluster I和Cluster II在四川地理分布Fig.2　Geographic distribution of measles virus Cluster I and II in Sichuan Province

2.5四川省內(nèi)毒株變異情況將2011年、2014、2015年分別分離到的10株、86株、398株麻疹病毒序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，492株為H1a基因亞型，毒株間核苷酸同源性為96.2%-100.0%，在進(jìn)化樹上仍呈現(xiàn)兩個分支；2株為A基因型，毒株間核苷酸同源性為99.7%。

3　討論

麻疹病毒是副粘病毒科麻疹病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，有6個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和依賴于RNA的RNA聚合酶(L)。H基因和N基因是結(jié)構(gòu)基因中易變異的兩個基因，世界衛(wèi)生組織規(guī)定編碼N蛋白羧基末端450 bp核苷酸序列或H基因全長編碼序列作為麻疹病毒基因定型依據(jù)。研究參考中國CDC提供引物序列，對四川省2015年上半年分離到的398株麻疹病毒編碼N蛋白羧基末端的456 bp核苷酸片段進(jìn)行擴(kuò)增、測序和分析。結(jié)果顯示，397株分離株與H1a基因亞型代表株核苷酸同源性為97.3%-99.1%，為H1a基因亞型，與全國優(yōu)勢流行株的基因型別一致[6-11]。397株分離株之間核苷酸同源性為96.2%-100.0%，雖變異程度小，但在系統(tǒng)進(jìn)化樹上呈現(xiàn)2個分支(命名為Cluster I和Cluster II),分支間平均核苷酸差異率為2.0%，提示在四川省內(nèi)麻疹病毒的流行和傳播存在兩個傳播鏈。

表1　各市州采集標(biāo)本數(shù)和麻疹病毒Cluster I

四川省下設(shè)21個市州，397株分離株來源于17個市州(4個市州無報告病例，未采集標(biāo)本)，Cluster I、II所占比例分別為81.4%(323/397)、18.6%(74/397)。從覆蓋區(qū)域來看，6個市州僅有Cluster I流行，主要分布在四川省西北部；3個市州僅有Cluster II流行，8個市州Cluster I、II同時流行，主要分布在四川省東南部。因此，從毒株數(shù)量和覆蓋范圍來看，Cluster I都是2015年四川省麻疹流行的主要傳播鏈。

2015年分離到1株A基因型麻疹毒株(2015-727)。病例與麻風(fēng)腮疫苗接種時間、出疹時間都非常接近，高度懷疑為疫苗相關(guān)株。通過比對，2015-727與疫苗株Changchun47、Shanghai191同源性非常高，表明四川省分離到疫苗相關(guān)株保持高度穩(wěn)定。

病毒學(xué)監(jiān)測是消除麻疹的重要手段之一。通過對麻疹病毒核酸序列的分析，可及時了解和掌握麻疹流行株的基因型別和特征，追蹤傳染源和傳播途徑，為科學(xué)防麻疹提供參考。

[1]耿倩,陳蓉,張濤,等. 2006-2011年上海市麻疹流行病學(xué)特征分析[J]. 中華疾病控制雜志,2013,17(11): 955-958.

[2]張大勇,戴麗芳,徐飛,等. 貴州2003-2010年麻疹流行病學(xué)特征及消除麻疹策略分析[J]. 中華疾病控制雜志,2013,17(2):163-166.

[3]方巧云,曾健君,劉燕,等. 惠州市2004-2010年麻疹流行病學(xué)特征分析[J]. 中華疾病控制雜志,2012,16(3):241-243.

[4]劉李, 孫莉, 何吉蘭,等. 2011年上半年四川省麻疹病毒分離株N基因序列分析[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志, 2012, 28(6)：426-429.

[5]童文彬, 何吉蘭, 孫莉,等. 四川省1株輸入性麻疹病毒基因特征分析[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志, 2009, 25(11):927-930.

[6]Zhang Y, Deng ZR, Wang HL, et al. New measles virus genotype associated with outbreak, China.[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(6):943-947. doi: 10.3201/eid1606.100089

[7]陳超, 周劍惠, 張帆,等. 吉林省2009-2010年麻疹病毒流行株核蛋白基因親緣關(guān)系及氨基酸變異分析[J]. 中國疫苗和免疫, 2012,18(1):43-47.

[8]許青, 李波, 房學(xué)強(qiáng),等. 山東省首起境外輸入性D9基因型麻疹病毒引發(fā)的暴發(fā)疫情調(diào)查[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 48(7):638-639. doi:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.07.021

[9]雷亞克, 戴瑩, 李靜,等. 2008-2012年湖北省麻疹野病毒分子流行病學(xué)研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2015, 29(4):303-305. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.04.005

[10]王常銀, 許松濤, 熊萍,等. 山東省2005-2008年麻疹病毒流行特征分析[J]. 中國疫苗和免疫, 2011,17(1):22-25.

[11]Zhang Y, Xu ST, Wang HL, et al. Single Endemic Genotype of Measles Virus Continuously Circulating in China for at Least 16 Years[J]. PloS One, 2012, 7(4): e34401. doi:10.1371/journal.pone.0034401

Molecular epidemiological characteristics of measles virus in Sichuan province in 2015

CaoRanran，LiuLi,ZhuYukun,WangShundong,HeJilan

SichuanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Chengdu610041,China(CaoRR，LiuL,HeJL);NanchongCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchong63700,China(ZhuYK);DazhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Dazhou63500,China(WangSD)Correspondingauthor:HeJilan，Email：275880976@qq.com

ObjectiveTo analyze the genetic characteristics of measles virus in Sichuan province in 2015. MethodsMeasles virus was isolated from throat swab specimens collected from suspected measles cases. Nucleotide sequences coding for C terminus of nucleoprotein were amplified by RT-PCR and sequenced for phylogenetic analysis. Results398 measles virus isolates were obtained from 971 throat swab specimens. Phylogenetic analysis showed that 397 belonged to H1 genotype, the sequences homologies were 96.2%-98.0% compared with H1 genotype reference strain; and all those isolates separated into 2 clusters in phylogenetic tree with the average nucleotide divergence of 2.0%.1 isolate belonged to A genotype, and shared 98.0% nucleotide homology compared with A genotype reference strain. ConclusionsH1 genotype virus remained predominant circulating in Sichuan Province. There was no much genetic variation in N gene. But a minor nucleotide divergence existed between different clusters, leading to 2 transmission chains.

Measles virus; Nucleoproteins; Genotype

何吉蘭，Email: 275880976@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.010

2016-01-15)