董照光　傅衛(wèi)輝　劉璐　徐建青　張曉燕

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院[董照光(碩士研究生)、張曉燕]； 201508 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心(董照光、傅衛(wèi)輝、劉璐、徐建青)

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·論著·

不同致病力禽流感病毒比較研究的適宜小鼠模型篩選

董照光傅衛(wèi)輝劉璐徐建青張曉燕

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院[董照光(碩士研究生)、張曉燕]； 201508 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心(董照光、傅衛(wèi)輝、劉璐、徐建青)

目的篩選用于不同致病力禽流感病毒比較研究的適宜小鼠模型。方法采用禽流感病毒高致病力毒株H7N9和低致病力毒株H9N2分別以滴鼻方式感染C57BL/6和BALB/c小鼠，觀察小鼠臨床癥狀、病理變化并檢測(cè)體內(nèi)病毒載量。結(jié)果小鼠感染兩類禽流感病毒1 d后均出現(xiàn)豎毛、聚集成堆、反應(yīng)遲鈍、四肢無(wú)力等癥狀。H7N9與H9N2感染BALB/c小鼠導(dǎo)致的體重丟失最低點(diǎn)分別為63.80%與66.35%，均低于C57BL/6小鼠(分別為68.96%與87.57%)。感染小鼠的肺組織都存在間質(zhì)肺炎、水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理癥狀，H7N9感染C57BL/6小鼠后肺組織病毒載量峰值(1.02×105拷貝/ml)約為BALB/c組(8.72×103拷貝/ml)12倍；而H9N2感染后C57BL/6小鼠肺組織病毒載量(5.94×103拷貝/ml)僅為BALB/c小鼠(2.86×104拷貝/ml)的20%。結(jié)論C57BL/6小鼠感染禽流感病毒更能表現(xiàn)出強(qiáng)弱毒株的致病特點(diǎn)，更適用于不同致病力禽流感病毒比較研究。小鼠的病理變化與臨床特征與接種禽流感病毒株的生物學(xué)特征及小鼠品系均密切相關(guān)。

【主題詞】禽流感病毒；小鼠模型；致病力；炎癥反應(yīng)；病毒載量

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81430030)

高致病性流感疫情的暴發(fā)來(lái)源除了季節(jié)性人流感病毒如H1N1、H3N2，還有禽來(lái)源的流感病毒如H5N1以及H7N9[1-2]。血凝素HA與神經(jīng)氨酸酶NA組合形成復(fù)雜多樣的基因型，其在病毒跨物種傳播中致病力與對(duì)宿主的敏感性等方面發(fā)揮重要作用。新型H7N9禽流感病毒的內(nèi)部基因片段與H9N2病毒(A/brambling/Beijing/16/2012)相似[3]，但是根據(jù)世界動(dòng)物健康組織規(guī)定的禽類靜脈接種死亡指數(shù)檢測(cè)，新型的H7N9病毒被認(rèn)定為高致病性禽流感病毒，而H9N2是低致病性禽流感病毒[4]。

本研究主要使用高致病性的禽流感H7N9病毒和低致病性禽流感H9N2病毒分別感染C57BL/6和BALB/c小鼠，觀察比較不同致病力病毒在不同品系小鼠中致病力差異，以期為今后流感病毒的不同研究目的選擇適宜模型提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6-8周雌性C57BL/6和BALB/c小鼠，購(gòu)買自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，并飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)飼養(yǎng)室。病毒接種前將小鼠轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行H9N2和H7N9禽流感病毒攻毒試驗(yàn)。所有和小鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)都遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則并給與人道主義關(guān)懷。

1.1.2毒株:病毒株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)禽流感病毒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)禽流感由上海市公共衛(wèi)生臨床中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組:兩個(gè)品系的小鼠(C57BL/6和BALB/c)按照體重各自隨機(jī)分二個(gè)實(shí)驗(yàn)組包括H7N9攻毒組(n=30)和H9N2攻毒組(n=30)，分別接種H7N9和H9N2禽流感病毒。

1.2.2攻毒：采用鹽酸氯胺酮溶液 (50 μg/μl) 腹腔注射麻醉小鼠(40 μl/小鼠)。H7N9禽流感病毒的攻毒劑量為7×106TCID50；H9N2禽流感病毒的攻毒劑量為2×107EID50；對(duì)照組滴鼻PBS緩沖液40 μl。攻毒后小鼠分籠正常飼養(yǎng)。

1.2.3觀察指標(biāo):攻毒前定義為0 d，分別在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d觀察小鼠，包括小鼠的活動(dòng)、反應(yīng)性、飲食、呼吸及有無(wú)弓背、豎毛、蜷縮、顫抖和死亡等每天用電子秤測(cè)量體重。

1.2.4病理檢查：在0 h、1 d、3 d、7 d隨機(jī)挑選3只小鼠處死，取肺組織用于組織病理學(xué)檢查。

1.2.5肺組織病毒載量測(cè)定：在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d隨機(jī)挑選3只小鼠處死，取肺組織液氮研磨后抽提RNA，利用real-time PCR測(cè)定病毒載量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用 GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0. 05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1癥狀與體征H7N9和H9N2禽流感病毒都是通過(guò)滴鼻方式對(duì)C57BL/6和BALB/c小鼠進(jìn)行攻毒。觀察7 d。兩種病毒都引起小鼠體重丟失，且BALB/c小鼠體重丟失比C57BL/6嚴(yán)重，H7N9病毒感染后第3天出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，H9N2病毒感染后第1天出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1)。感染H7N9病毒感染導(dǎo)致的體重丟失最低點(diǎn)(Weight loss nadir)在BALB/c小鼠為63.80 %，C57BL/6小鼠為68.96 %，均低于H9N2病毒感染導(dǎo)致的體重丟失最低點(diǎn)(BALB/c小鼠：66.35 %；C57BL/6小鼠：87.57 %)。

*，**，***和****分別代表P<0.05，0.01，0.001和0.0001圖1　H7N9和H9N2禽流感病毒感染C57BL/6和BALB/c小鼠的體重變化*, **, ***and**** indicating P<0.05, 0.01, 0.001 and 0.0001, respectivelyFig.1　Weight changes in C57BL/6 and BALB/c mice after challenge with H7N9 and H9N2 avian influenza viruses

A和E分別為空白組C57BL/6 和BALB/c小鼠；B-D分別為感染H7N9病毒的1 d，3 d，7 d的C57BL/6小鼠，F(xiàn)-H分別為感染H7N9病毒的1 d，3 d，7 d的BALB/c小鼠；I-K分別為感染H9N2病毒的1 d，3 d，7 d的C57BL/6小鼠,L-N分別為感染H9N2病毒的1 d，3 d，7 d的BALB/c小鼠圖2　小鼠肺組織HE染色結(jié)果(400×) A and E indicate C57BL/6 and BALB/c mice in control group, respectively. B-D indicate C57BL/6 mice infected by H7N9 viruses at the 1 st day, 3 rd day and 7th day, respectively F-H indicate BALB/c mice infected by H7N9 viruses at the 1 st day, 3 rd day and 7th day, respectively. I-K indicate C57BL/6 mice infected by H9N2 viruses at the 1 st day, 3 rd day and 7th day, respectively. L-N indicate BALB/c mice infected by H9N2 viruses at the 1 st day, 3 rd day and 7th day, respectivelyFig.2　Lung pathological features in BALB/c and C57BL/6 mice (400×)

2.2病理學(xué)檢查H7N9禽流感病毒感染后小鼠肺組織都存在間質(zhì)肺炎、水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理癥狀，但病變程度卻不相同(圖2)。H9N2感染小鼠后亦出現(xiàn)類似的病理改變(圖2)：第1天出現(xiàn)紅細(xì)胞嚴(yán)重滲出，第3天紅細(xì)胞滲出減輕、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)肺間質(zhì)肺炎，第7天紅細(xì)胞滲出基本消失且肺泡壁結(jié)構(gòu)逐步恢復(fù)。值得注意的是，H9N2感染導(dǎo)致的上述病理改變?cè)贐ALB/c小鼠重于C57BL/6小鼠。

2.3肺組織病毒載量通過(guò)RT-PCR對(duì)感染小鼠的肺組織進(jìn)行病毒載量的測(cè)定。如圖3所示H7N9病毒感染C57BL/6后第1天病毒載量即達(dá)峰值(1.02×105拷貝/ml)，之后雖然逐漸降低，第7天依然保持在較高水平(3.41×104拷貝/ml)；而H7N9感染BALB/c小鼠肺組織的病毒載量則持續(xù)在較低水平，第1天為5.68×103拷貝/ml，第2天升至峰值(8.72×103拷貝/ml)，但不足前者的十分之一。

H9N2病毒感染C57BL/6和BALB/c小鼠后，肺組織病毒載量則顯示了截然相反的趨勢(shì)。H9N2感染C57BL/6小鼠后病毒載量則保持較低水平，小鼠第1天肺組織病毒載量為5.94×103拷貝/ml，第2天為2.86×103拷貝/ml，第3天即基本清除(89 拷貝/ml)；而H9N2病毒感染BALB/c小鼠后第1天肺組織病毒載量為2.66×104拷貝/ml，第2天為2.86×104拷貝/ml，其后逐漸降低至第7天(469 拷貝/ml)。

圖3　C57BL/6和BALB/c小鼠的病毒載量.*，**和****分別表示P<0.05，0.01和0.0001Fig.3　Viral loads in C57BL/6 and BALB/c mice. *, **and**** indicating P<0.05, 0.01 and 0.0001, respectively

3　討論

甲型流感病毒為常見(jiàn)流感病毒，宿主范圍非常廣泛。根據(jù)血凝素蛋白HA和神經(jīng)氨酸酶蛋白NA可將流感病毒分為不同的亞型，目前HA具有18個(gè)亞型[5]，NA具有9個(gè)亞型。禽流感病毒為甲型流感病毒的亞型，能夠引起禽類的從呼吸系統(tǒng)到全身等多種癥狀的傳染病。新型H7N9禽流感病毒能夠感染人且具有高發(fā)病率和病死率的特點(diǎn)[6]，基因分析顯示其相比其他禽流感病毒更加容易感染哺乳動(dòng)物[7]。H7N9禽流感病毒感染豬和雪貂模型已經(jīng)建立[8]，但免疫學(xué)研究試劑和基因改造動(dòng)物資源稀缺，對(duì)H7N9禽流感病毒研究具有局限性，小鼠作為很好的哺乳動(dòng)物模型，廣泛用于禽流感病毒的發(fā)病機(jī)理、免疫學(xué)、藥物評(píng)估和疫苗研發(fā)。

前期不同研究團(tuán)隊(duì)的結(jié)果提示不同禽流感病毒對(duì)不同的小鼠品系具有不同的敏感性和致病力。例如2011年Otte研究表明C57BL/6小鼠比BALB/c小鼠更容易感染季節(jié)性H1N1流感病毒，然而H7N9與H5N1流感病毒感染BALB/c小鼠導(dǎo)致更加嚴(yán)重的病理?yè)p傷[9]。但是也有報(bào)道稱H7N9病毒感染C57BL/6小鼠病毒清除緩慢[10]。 此外，H9N2禽流感病毒感染小鼠模型研究中經(jīng)常使用BALB/c模型，但是有報(bào)道稱H9N2病毒可在C57BL/6小鼠引起嚴(yán)重肺損傷[11]。我們的數(shù)據(jù)顯示，與BALB/c小鼠相比，H7N9病毒感染C57BL/6小鼠可引起更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)與更高的病毒載量(12倍)；但是低致病性的H9N2感染BALB/c小鼠可導(dǎo)致更加嚴(yán)重的病理?yè)p傷，有報(bào)道稱這可能由于低致病性的H9N2病毒通過(guò)氨基酸的突變產(chǎn)生高致病性的小鼠適應(yīng)株[12]。

綜合本研究與其他研究報(bào)道的數(shù)據(jù)，如需平行對(duì)比強(qiáng)弱不同禽流感病毒的致病力、發(fā)病機(jī)制與臨床轉(zhuǎn)歸及其調(diào)控關(guān)鍵因素等相關(guān)研究，可考慮采用C57BL/6小鼠作為研究動(dòng)物模型。當(dāng)然，宿主對(duì)禽流感病毒感染不止體現(xiàn)在體重丟失、病毒載量、炎癥病理?yè)p傷等方面，還涉及宿主固有免疫與獲得性免疫應(yīng)答的諸多因素，應(yīng)持續(xù)深入研究。

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Mouse models choosing for the comparative study of different pathogenic avian influenza viruses

DongZhaoguang,FuWeihui,LiuLu,XuJianqingZhangXiaoyan

WenzhouMedicalUniversity,SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,Wenzhou325000,China[DongZG(Master),ZhangXY];ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,Shanghai201508,China(DongZG,FuWH,LiuL,XuJQ)

ZhangXiaoyan,Email:zhangxiaoyan@shaphc.org

ObjectiveTo filter appropriate mouse model for avian influenza viruses with different pathogenicity. MethodsTwo varieties mice (C57BL/6 and BALB/c) were anesthetized with ketamine and inoculated intranasal with highly pathogenic avian influenza virus H7N9 and low pathogenic avian influenza virus H9N2 in 50 μl PBS, or mock inoculated with PBS to serve as controls. The mice were observed daily including clinical symptoms body, weight and mortality. The pulmonary histopathological changes and viral load were also monitored. ResultsJust one day after the viral inoculation, H7N9 and H9N2 infected mice strains all showed reduced activity, ruffled fur and obvious body weight loss. The body weight loss nadir in BALB/c mice (63.80% for H7N9/BALB/c; 66.35% for H9N2/BALB/c ) were lower comparing to the corresponding viruses infected C57BL/6 mice (68.96% for H7N9/C57BL/6 and 87.57% for H9N2/C57BL/6 respectively). In addition, there were some obvious pulmonary oedema, haemorrhage and typical pulmonary interstitial inflammatory lesions in the lung tissues. The peak viral load in H7N9/C57BL/6 group (1.02×105copies/ml) was 12 folds higher than that in H7N9/BALB/c group (8.7×103copies/ml). But on the contrary, the peak viral load in H9N2/BALB/c group (2.86×104copies/ml) was 5 times of that in H9N2/C57BL/6 group (5.94×103copies/ml). ConclusionsPathogenic characteristics caused by different virulent avian influenza viral strains could be more clearly differential represented in C57BL/6 mice model, and thus it is more suitable for the comparative study between different pathogenic avian influenza viruses. It also reconfirmed that the different pathological changes and clinical outcomes of avian influenza viruses/mice infection models were associated not only to the different biological characteristics of inoculated virus strains, but also to hereditary characters of host mice strains.

Avian influenza virus; Mice model; Pathogenicity; Inflammatory response; Viral load

張曉燕，Email: zhangxiaoyan@shaphc.org

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.011

國(guó)家自然科學(xué)基金(81430030)

2016-02-19)