劉超　何小周　劉雪　徐柯　曾毅　馮霞

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院病毒與藥理室 (劉超、劉雪、曾毅)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (何小周、徐柯、馮霞)

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·論著·

負(fù)載Ad5-HIVgag/env的DC疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究

劉超何小周劉雪徐柯曾毅馮霞

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院病毒與藥理室 (劉超、劉雪、曾毅)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (何小周、徐柯、馮霞)

目的用Ad5-HIV gag/env負(fù)載小鼠樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)，探索其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的HIV Gag/Env特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。方法貼壁法分離純化BALB/c小鼠DCs，并用細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度。利用重組腺病毒Ad5-HIV gag/env感染DC細(xì)胞,制備DC疫苗。用所制備DC疫苗免疫小鼠，在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)，用ELISPOT方法檢測小鼠體內(nèi)HIV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果成功培養(yǎng)出Ad5-HIVgag/env負(fù)載的DC疫苗；免疫熒光以及流式細(xì)胞術(shù)檢測到Gag/Env抗原可在DC內(nèi)有效表達(dá)；上述DC疫苗免疫小鼠后能誘導(dǎo)高水平HIV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)論Ad5-HIV gag/env負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)較強(qiáng)的HIV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。

【主題詞】樹突狀細(xì)胞疫苗；細(xì)胞治療；腺病毒；HIV-1

Fund programs: National Scinence and Technology Major Project of China((2012ZX10001-005)

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)在人體內(nèi)分布廣泛，是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(Antigen presen-ting cells, APC)，其對抗原的提呈能力遠(yuǎn)高于巨噬細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞，同時(shí)，DC也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC，在特異性免疫應(yīng)答過程中起到重要作用。離體的DCs經(jīng)抗原刺激后回輸?shù)襟w內(nèi),能夠遷移到淋巴結(jié)并釋放出多種細(xì)胞因子,同時(shí)激活T淋巴細(xì)胞的分化和增殖[1],誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，進(jìn)而對特異性靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷，這是將DC疫苗用于細(xì)胞治療的理論基礎(chǔ)[2]。使用表達(dá)HIV-1抗原的DC疫苗對HIV-1感染者進(jìn)行免疫治療的研究已取得了初步進(jìn)展[3]。本研究中，我們使用表達(dá)HIVgag/env基因的腺病毒載體疫苗(Ad5-HIVgag、Ad5-HIVenv)感染小鼠骨髓DCs，獲得負(fù)載HIV Gag/Env的DCs疫苗(DC-Ad5-HIV gag、DC-Ad5-HIV env),單獨(dú)或聯(lián)合免疫小鼠，觀察其誘導(dǎo)產(chǎn)生的HIV抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。

1　材料與方法

1.1材料腺病毒載體疫苗rAd5-HIVgag和rAd5-HIVenv均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，委托深圳源興生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)； P24抗體(由美國NIH AIDS Research and Reference Reagent program惠贈(zèng))；2G12抗體(購于蘇州杰恩公司)；生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG、生物素標(biāo)記的抗人IgG、FITC標(biāo)記的鏈酶卵白素IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PE標(biāo)記的小鼠CD80、CD11c、CD86抗體購自美國Biolegend公司；重組鼠細(xì)胞因子rmGM-CSF、rmIL-4、rmTNF-α購自美國Peprotech公司；ELISPOT試劑盒購自瑞典MabTech公司。

1.2小鼠骨髓細(xì)胞采集和分離頸椎脫臼法處死小鼠，無菌操作下取股骨和脛骨，用1 ml注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液，從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到無菌培養(yǎng)皿中。用小鼠淋巴細(xì)胞分離液重懸細(xì)胞，按說明書離心后吸取中間部分的淋巴細(xì)胞層細(xì)胞(呈白色薄膜狀)，計(jì)數(shù)獲得單核細(xì)胞的數(shù)量，調(diào)整細(xì)胞濃度接種在培養(yǎng)瓶中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)2 h。

1.3DC的培養(yǎng)與鑒定去除非貼壁細(xì)胞，加入細(xì)胞因子rmGM-CSF(40 ng/ml)、rmIL-4(20 ng/ml)、rmTNF-α(10 ng/ml)，37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收集懸浮細(xì)胞團(tuán)，即為小鼠的DC。收集貼壁法分離的DCs，按照說明書分別加入PE標(biāo)記的抗小鼠CD86、CD80和CD11c抗體，利用流式細(xì)胞儀檢測DC純度。

1.4DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv制備及鑒定采用100 MOI的Ad5-HIVgag/env分別感染DCs，吸附2 h后，然后在含成熟因子的DC培養(yǎng)基中，其中含rmGM-CSF(40 ng/ml)、rmIL-4(20 ng/ml)、rmTNF-α(20 ng/ml),繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)細(xì)胞，即為DC-Ad5-HIVgag、DC-Ad5-HIVenv。利用間接免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測DC細(xì)胞中Gag/Env蛋白的表達(dá)情況。

1.5DC疫苗免疫BALB/C小鼠雌性BALB/C小鼠、4-6周齡，隨機(jī)分為7組，每組20只。將收獲的DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv 疫苗單獨(dú)或聯(lián)合經(jīng)肌肉注射免疫,免疫劑量為2×105細(xì)胞/只。另外分別設(shè)置Ad5-HIVgag組、Ad5-HIVenv組作為陽性對照組，以及DC-Ad5-LMP2組作為表達(dá)無關(guān)抗原的腺病毒負(fù)載的DC對照組，單純DC作為陰性對照組。分別在免疫后1周、2周、3周、4周檢測各組小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

1.6酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)實(shí)驗(yàn)在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，分別用HIV Gag和Env特異性多肽刺激脾細(xì)胞，按照MabTech試劑盒說明書操作檢測小鼠的HIV Gag和Env特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度用每百萬個(gè)淋巴細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(Spots Forming Cells/million splencytes)計(jì)量；利用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析結(jié)果并繪制圖表。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察貼壁培養(yǎng)法分離、純化、誘導(dǎo)得到的原代DCs具有典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面具有樹枝狀突起。

2.2成熟DC表面標(biāo)志的表達(dá)利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測通過貼壁法純化DCs的細(xì)胞純度，結(jié)果顯示，帶有CD86、CD80及CD11c表面標(biāo)記的陽性細(xì)胞占總細(xì)胞比率的百分?jǐn)?shù)分別為92.1%，94.7%和82.3%，見圖1。

2.3目的抗原在樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)我們分別采用了間接免疫熒光方法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測目的基因在DC細(xì)胞中的表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示，目的抗原均在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。見圖2。利用流式細(xì)胞技術(shù)對其進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Ad5- HIVgag負(fù)載的DCs中表達(dá)Gag蛋白的細(xì)胞占總細(xì)胞比率為88%、Ad5- HIVenv負(fù)載的DCs中表達(dá)Env蛋白細(xì)胞比為85.3%。

圖1　DCs 流式細(xì)胞術(shù)純度檢測Fig.1　The purity result of DCs by flow cytometry

圖2　間接免疫熒光檢測樹突狀細(xì)胞疫苗中Gag和Env抗原表達(dá)(200×)Fig.2　Expression of Gag and Env in DC vaccines detected by indirect immunofluorescencec assay(200×)

圖3　ELISPOT方法檢測免疫后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體內(nèi)HIV Gag或Env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果Fig.3　HIV Gag or Env specific cellular immune responses in mice at various time points post immunization by ELISPOT assay

2.4ELISPOT方法檢測細(xì)胞免疫水平DC疫苗以肌肉注射的方式免疫BALB/C小鼠，在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)，分別用Gag和Env特異性多肽刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞，檢測小鼠體內(nèi)Gag和Env特異性細(xì)胞免疫水平，見圖3。結(jié)果顯示，DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv單獨(dú)免疫或聯(lián)合免疫均能誘導(dǎo)相應(yīng)的HIV Gag和Env特異性CTL應(yīng)答。其中DC-Ad5-HIVgag單獨(dú)免疫組誘導(dǎo)的HIV Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)高峰在免疫后3 W，顯著高于免疫后2 W 及1 W(P<0.05)，之后逐漸下降。DC-Ad5-HIVenv疫苗單獨(dú)免疫組誘導(dǎo)的Env 特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)隨著時(shí)間的推移逐漸增加至免疫后4 W達(dá)高峰，各時(shí)間點(diǎn)的免疫反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)的HIV Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平與DC-Ad5-HIVgag疫苗單獨(dú)免疫組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)的HIV Env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平與DC-Ad5-HIVenv疫苗單獨(dú)免疫組相比，在免疫后第1、2周兩者水平相當(dāng)，免疫后3周開始單獨(dú)免疫組水平超過聯(lián)合免疫組，至免疫后4周兩者差距最大,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

DC是已知唯一能夠激活初始T 淋巴細(xì)胞，也是已知最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞。特異性抗原負(fù)載的DC回輸?shù)襟w內(nèi)后，能夠激活T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生HIV-1 抗原特異性CTL，并促進(jìn)其殺傷作用[3]。DC已經(jīng)在多種病毒性傳染病的免疫治療中進(jìn)行應(yīng)用研究并取得一定效果[4]。研究表明，不同的抗原負(fù)載方式,對DC 的活化效率不同,產(chǎn)生CLT 的活性不相同。目前抗原負(fù)載存在多種手段,常用的策略有抗原肽導(dǎo)入DC[5]及病毒載體攜帶抗原基因感染DC[6]兩種方式。有研究表明，采用抗原肽導(dǎo)入DC存在的問題主要是半衰期較短,而且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低；病毒載體攜帶抗原基因感染DC,可使基因在DC內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),從而使DC獲得持續(xù)而大量的抗原刺激。而腺病毒具有安全性好、無遺傳毒性、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、可以高水平的表達(dá)外源基因，并且還具備載體包裝容量大、病毒制備工藝成熟等特點(diǎn)。使用腺病毒為載體,感染DC細(xì)胞制備樹突狀細(xì)胞疫苗將是一個(gè)很好的策略。

本研究采用貼壁培養(yǎng)法分離、純化DCs，7 d后獲得純度較高的DCs。腺感染病毒后，通過間接免疫熒光及流式細(xì)胞技術(shù)可檢測到目的抗原Gag和Env在細(xì)胞中有較高水平表達(dá)。將獲得的DC疫苗免疫BALB/c小鼠可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性CTL應(yīng)答。DC-Ad5-HIVgag疫苗單獨(dú)或與DC-Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的HIVGag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平相當(dāng)，但都明顯低于直接用Ad5-HIVgag疫苗免疫的效果。DC-Ad5-HIVenv疫苗單獨(dú)或與DC-Ad5-HIVgag疫苗聯(lián)合免疫及直接用Ad5- HIVenv疫苗免疫誘導(dǎo)的HIV Env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平在免疫后前3周內(nèi)差異不大(P> 0.05)，但免疫后4周差異顯著(P<0.05)，以DC-Ad5-HIVenv單獨(dú)免疫組最高，DC-Ad5-HIVenv與DC-Ad5-HIVgag疫苗聯(lián)合免疫組最低。以Ad5-HIVgag和Ad5-HIVenv分別負(fù)載DC獲得的DC疫苗免疫小鼠后跟單獨(dú)用相應(yīng)的腺病毒載體疫苗免疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相比相分別出現(xiàn)降低和升高的趨勢，產(chǎn)生這種差異的原因還不清楚，有必要進(jìn)一步在小鼠或恒河猴體內(nèi)進(jìn)行深入研究，為更合理的應(yīng)用艾滋病疫苗提供依據(jù)。

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Immunogenicity of dendritic cells pulsed with Ad5-HIVgag/env in mice

LiuChao,HeXiaozhou，LiuXue,XuKe,ZengYi,FengXia

LaboratoryofVirologyandPharmocology,CollegeofLifeScienceandBioengineering,BeijingUniversityoftechnology,Beijing100022,China(LiuC,LiuX,ZengY)；StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandContral,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(HeXZ,XuK,FengX)

FengXia,Email:fengxia621@126.com;ZengYi,Email:zengy@public.bta.net.cn

Objective To evaluate HIV Gag/Env specific cellular immune responses induced in mice immunized with mouse dendritic cells pulsed with Ad5-HIVgag/env. MethodsBALB/c mouse DCs were generated by culture of adherent bone marrow cells in the presence of several cytokines. The purity of matured DCs was determined by flow cytometry.DCvaccineswere prepared by loading them with replication-deficient recombinant adenovirus Ad5-HIVgag or Ad5-HIVenv. BALB/c mice were immunized by intramuscular injection of above DC vaccines alone or in combination, at different time points post immunization HIV specific cellular immune responses detected by ELISPOT assay.ResultsMouse DC vaccines loaded with Ad5-HIVgag/env were generated successfully. Expression of HIV Gag or Env antigens in DC vaccines could be detected by immunofluorescence assay and flow cytometry; and high levels of HIV-specific cellular immune responses were induced in mice immunized with above DC vaccines ConclusionsDendritic cells loaded with Ad5-HIVgag/env could elicit potent HIV specific cellular immune responses in mice.

Dendritic cell vaccine；Cell therapy；Adenovirus；HIV-1

馮霞，Email: fengxia621@126.com；曾毅，Email: zengyi@public.bta.net.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.008

國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10001-005)

2016-03-17)