李園園　馮云　范建華　李鴻斌　朱進(jìn)　潘虹　李衛(wèi)平　高陽　張海林

666100 景洪，西雙版納州疾病預(yù)防控制中心(李園園、范建華、李鴻斌、朱進(jìn)、李衛(wèi)平、高陽)；671000 大理，云南省地方病防治所云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(馮云、潘虹、張海林)

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·論著·

2015年云南省西雙版納州登革2型病毒暴發(fā)疫情的調(diào)查研究

李園園馮云范建華李鴻斌朱進(jìn)潘虹李衛(wèi)平高陽張海林

666100 景洪，西雙版納州疾病預(yù)防控制中心(李園園、范建華、李鴻斌、朱進(jìn)、李衛(wèi)平、高陽)；671000 大理，云南省地方病防治所云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(馮云、潘虹、張海林)

李園園、馮云為共同第一作者

目的闡明2015年云南省西雙版納州登革熱流行病學(xué)特征和登革病毒血清型及其傳播來源。方法收集登革熱病例資料，采集患者急性期血清標(biāo)本，用RT-PCR法檢測(cè)登革病毒核酸，并進(jìn)行登革病毒C/PrM區(qū)核苷酸序列測(cè)定和分析。 結(jié)果2015年西雙版納州共報(bào)告登革熱病例1 132例，其中本地感染病例1 089例(96.20%)、輸入性病例43例(3.80%，來自緬甸38例、老撾3例和泰國(guó)2例)。本地流行地區(qū)主要為景洪市城區(qū)和嘎灑鎮(zhèn)，該流行區(qū)中埃及伊蚊為優(yōu)勢(shì)蚊種，流行月份為7-12月。病例年齡分布以20-49歲組為主，最小2歲，最大93歲；男女性別比為1∶1.05。經(jīng)登革病毒核酸檢測(cè)和序列測(cè)定，從患者血清中獲得33株病毒的C/PrM區(qū)基因核苷酸序列。進(jìn)化分析表明，這33株病毒均為登革2型病毒，其中的泰國(guó)輸入性病例分離株與本地流行株高度同源，同為一個(gè)進(jìn)化群，并與東南亞和我國(guó)福建和廣東流行株親緣關(guān)系較近，但與云南省瑞麗市2014年登革2型病毒流行株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 結(jié)論2015年西雙版納州發(fā)生了由登革2型病毒引起的本地登革熱流行，來自泰國(guó)的登革熱輸入性病例是引起本地登革熱流行的主要原因，埃及伊蚊是主要傳播媒介。加強(qiáng)輸入性病例和本地病例的監(jiān)測(cè)和管理以及蚊蟲控制是防止本病蔓延擴(kuò)散的關(guān)鍵措施。

【主題詞】登革熱；登革熱病毒；進(jìn)化分析；流行病學(xué)

登革熱(denguefever,DF)是由登革病毒(denguevirus,DENV)引起的急性傳染病，DENV分為4個(gè)血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，以東南亞地區(qū)流行較為嚴(yán)重[1-3]，埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白紋伊蚊(Aedes albopictus)是主要傳播媒介。我國(guó)DF主要分布在東南部地區(qū)[4-7]。2000-2012年云南省報(bào)告的DF主要是輸入性病例[8-10]，2013年云南省西雙版納州景洪市和德宏州瑞麗市首次暴發(fā)本地DF疫情[11, 12]，2014年瑞麗市再次發(fā)生本地DF流行[13]。2015年西雙版納州再次暴發(fā)DF，為闡明本次疫情的流行特征和DENV血清型，我們進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查以及DENV序列測(cè)定和分析。

1　材料與方法

1.1病例登革熱病例資料來源于2015年西雙版納州傳染病報(bào)告信息管理系統(tǒng)以及登革熱病例個(gè)案調(diào)查表和流行病學(xué)調(diào)查資料。根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS216—2008)和中華人民共和國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)印發(fā)的《登革熱診療指南》(2014年第2版)對(duì)病例進(jìn)行診斷并確定病例性質(zhì)(輸入性病例和本地病例)。所有DF病例均為實(shí)驗(yàn)室診斷病例。用Excel2007版軟件對(duì)病例數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用描述流行病學(xué)方法進(jìn)行流行特征分析。

1.2實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)患者急性期血清標(biāo)本進(jìn)行DENV-NS1抗原檢測(cè)，試劑為登革熱NS1快速測(cè)試卡(免疫層析法)(美國(guó)Cortez診斷股份有限公司，批號(hào)：TK1112)。根據(jù)《登革熱診療指南》，如在急性期血清中檢測(cè)到DENV-NS1抗原，表明該患者感染了DENV，可確定為登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷病例。

1.3DENVRT-PCR試驗(yàn)用QIAampViralRNAMiniKit(德國(guó)Qiagen公司)提取患者血清中的病毒RNA，用AmershamBioscienceReady-To-GoTMYouPrimeFirst-StrandBeads(美國(guó)AmershamPharmaciaBiotech公司)制備cDNA。取2μlcDNA做反應(yīng)模板，以D1和D2為引物[3]，PCR擴(kuò)增C/PreM區(qū)段基因(511bp)。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2min；94 ℃ 30s、55 ℃ 30s、68 ℃ 30s，擴(kuò)增9個(gè)循環(huán)后；94 ℃ 30s、55 ℃ 30s、68 ℃ 30s(每個(gè)循環(huán)增加10s)，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μl產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.4序列測(cè)定和分析所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。采用ClastalX1.83進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，采用MEGA5軟件鄰接法(Neighbor-joining)進(jìn)行DENV基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹分析。引用GenBank中來自不同國(guó)家和地區(qū)、不同年代的36株DENVC/PreM區(qū)段核苷酸序列，其中1型6株、2型21株、3型5株、4型4株，外群為流行性乙型腦炎病毒(JEV-P3/JEU47032)。

1.5媒介伊蚊調(diào)查2015年5-9月在西雙版納州設(shè)15個(gè)伊蚊幼蟲固定監(jiān)測(cè)點(diǎn)，其中景洪、勐臘和勐?？h各5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，按照云南省登革熱媒介監(jiān)測(cè)方案開展布雷圖指數(shù)(BI)監(jiān)測(cè)，并對(duì)陽性點(diǎn)捕獲的伊蚊幼蟲，經(jīng)羽化為成蚊后進(jìn)行種類鑒定，確定埃及伊蚊和白紋伊蚊。

2　結(jié)果

2.1流行概況西雙版納州于2015年7月13日?qǐng)?bào)告當(dāng)年首例DF輸入性病例，12月5日?qǐng)?bào)告末例DF輸入性病例；8月20日?qǐng)?bào)告當(dāng)年首例DF本地感染病例，12月1日?qǐng)?bào)告末例DF本地感染病例，本地流行持續(xù)114d。共報(bào)告DF1 132例，無死亡病例；其中，本地感染1 089例(96.20%)(景洪市1 046例、勐?？h23例、勐臘縣20例)，他們的感染地幾乎均為景洪市城區(qū)和嘎灑鎮(zhèn)；輸入性病例43例(3.80%，來自緬甸38例、老撾3例、泰國(guó)2例)，景洪市8例、勐海縣33例、勐臘縣2例。

2.2流行特征

2.2.1地區(qū)分布：西雙版納州所轄3縣、市均有DF病例報(bào)告，其中，病例數(shù)最多的是景洪市，共1 054例(93.11%)；其次為勐海縣56例(4.95%)和勐臘縣22例(1.94%);上述3縣發(fā)病率依次為200.31/10萬、16.37/10萬和7.66/10萬。景洪市疫情波及13個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)、農(nóng)場(chǎng)，其中以景洪城區(qū)(允景洪街道辦事處)報(bào)告的病例最多(979例，92.88%)，疫點(diǎn)遍及主城區(qū)；其次為與允景洪鎮(zhèn)相鄰的嘎灑鎮(zhèn)(44例，4.17%)，其余鄉(xiāng)鎮(zhèn)、農(nóng)場(chǎng)發(fā)病數(shù)較少。勐?？h有8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)有病例報(bào)告，勐臘縣5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)有病例報(bào)告，均以縣城城區(qū)為主。

2.2.2時(shí)間分布：流行期為7-12月，其中9月(173例)、10月(658例)和11月(285例)發(fā)病數(shù)較多，共1 116例，占總病例數(shù)的98.59%；7月(2例輸入)、8月(8例，其中本地7例和輸入1例)和12月(6例，本地和輸入各3例)病例較少，1-6月無病例。7月僅有輸入性病例，8-12月輸入性病例和本地病例均有報(bào)告。景洪、勐海和勐臘縣流行期依次為7-12月、9-12月和10-12月。

2.2.3性別與年齡分布：在1 132例病例中，男性551例(48.67%)、女性581例(51.33%)，男女之比為1:1.05，女性稍多于男性；各年齡組均有發(fā)病，最小為2歲、最大93歲，主要集中在20-49歲，共827例，占73.06%，以青壯年發(fā)病為主。

2.2.4職業(yè)分布：各職業(yè)人群均有發(fā)病，發(fā)病數(shù)居前五位的職業(yè)為商業(yè)服務(wù)人員(194例，17.14%)、個(gè)體戶(183例，16.17%)、家務(wù)待業(yè)(165例，14.58%)、農(nóng)民(136例，12.01%)和離退休人員(119例，10.51%)，共占發(fā)病總數(shù)的70.41%(797/1 132)。

2.3時(shí)效性分析1 132例DF病例中，本地感染和輸入性病例從發(fā)病到診斷的時(shí)間間隔中位數(shù)分別為4.46d和4.38d，本地病例的間隔中位數(shù)略高于輸入性病例。

2.4媒介伊蚊分布共開展57輪285個(gè)點(diǎn)次的BI監(jiān)測(cè)，5-6月BI指數(shù)均較低，7-9月普遍升高，其中景洪城區(qū)和嘎灑鎮(zhèn)最高，大多在20-80之間，部份監(jiān)測(cè)點(diǎn)有時(shí)高達(dá)100-110；勐臘縣城區(qū)BI多在10-35之間；勐?？h城區(qū)BI均保持在較低水平(≤5)，但該縣打洛鎮(zhèn)BI可達(dá)20-45。在本地登革熱流行區(qū)的景洪城區(qū)及嘎灑鎮(zhèn)對(duì)28個(gè)陽性點(diǎn)的伊蚊幼蟲進(jìn)行羽化，共獲得埃及伊蚊成蚊2 213只，占73.72%；白紋伊蚊成蚊789只，占26.28%，前者構(gòu)成比明顯高于后者。

2.5DENV核酸檢測(cè)和序列測(cè)定采用RT-PCR試驗(yàn)，對(duì)2015年7-11月采自西雙版納州的64份患者血清標(biāo)本進(jìn)行DENV核酸檢測(cè)，結(jié)果陽性33份并獲得它們的DENV-C/PrM區(qū)基因核苷酸序列。這33例患者中，7月1例(輸入首例)、8月3例(本地首例及早期本地病例)、9月21例、10月6例、11月2例。其他31份標(biāo)本檢測(cè)陰性可能與標(biāo)本經(jīng)多次運(yùn)輸及凍融以至RNA濃度低有關(guān)。

2.6進(jìn)化分析用上述33株DENV-C/PrM區(qū)基因片段核苷酸序列與來自GenBank中不同國(guó)家和地區(qū)的26株不同血清型DENV代表株相應(yīng)區(qū)段核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，西雙版納33株DENV聚集在相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)小分支，并與國(guó)內(nèi)外DENV-2同在一個(gè)分支，親緣關(guān)系較為接近，而與1、3和4型DENV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)，結(jié)果證實(shí)西雙版納33株DENV均為DENV-2。

BNDENV2015,代表2015年西雙版納州的33株登革病毒圖1　西雙版納2015年33株登革病毒C/PrM區(qū)基因片段系統(tǒng)進(jìn)化分析BNDENV2015 representing the 33 strains of DENV-2 isolated from Xishuangbanna in 2015Fig.1　Phylogenetic tree based on the C/PrM gene of 33 DENV strains isolated from Xishuangbanna in Yunnan province in 2015

為進(jìn)一步掌握西雙版納DENV-2之間及其與國(guó)內(nèi)外同型流行株間的進(jìn)化關(guān)系，使用本次獲得的33株DENV-2與2014年云南省瑞麗市5株DENV-2和來自GenBank的21株DENV-2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖2顯示，所有2015年西雙版納流行株同處一個(gè)次級(jí)進(jìn)化支，還發(fā)現(xiàn)它們與東南亞和我國(guó)福建和廣東流行株親緣關(guān)系較近，但與瑞麗市2014年流行株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明本次西雙版納流行的DENV-2與2014年瑞麗市流行的DENV-2不屬于同一個(gè)病毒株系。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，西雙版納本地病例的DENV-2與來自泰國(guó)的輸入性病例的DENV-2(BND1529，該患者7月15日發(fā)病)高度同源(圖2)，提示2015年西雙版納本地DF流行與來自相鄰泰國(guó)的DF輸入性病例密切相關(guān)。

黑色三角形代表本研究分離的33株DENV-2；黑色圓形代表2014年瑞麗市5株DENV-2圖2　西雙版納2015年33株DENV-2與2014年云南省德宏州瑞麗市5株DENV-2的C/PrM區(qū)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 Black triangles representing the 33 strains of DENV-2 isolated in this study; Black circles representing the strains isolated from Ruili in 2014Fig.2　Phylogenetic tree based on the C/PrM genes of 33 DENV-2 strains isolated from Xishuangbanna in 2015 and the 5 DENV-2 strains isolated from Ruili city of Dehong in 2014

3　討論

西雙版納州位于云南省西南部，與DF地方性流行區(qū)緬甸、老撾和泰國(guó)相鄰，有4個(gè)國(guó)家級(jí)口岸以及多條邊貿(mào)通道及眾多的邊民互市點(diǎn)，為我國(guó)連接?xùn)|南亞地區(qū)的重要陸路通道。此外，西雙版納機(jī)場(chǎng)的航班和瀾滄江港口航船均往返于老撾、緬甸和泰國(guó)。大量的出入境人員和交通工具的流動(dòng)，DF可通過輸入性病例傳播到該地區(qū)并引起流行，如2013年西雙版納州景洪市DENV-3暴發(fā)[11]以及2013年和2014年瑞麗市DENV-1和DENV-2流行[12, 13]均由來自老撾和緬甸的輸入性病例引起。本研究證實(shí)，2015年西雙版納DF疫情的病原為DENV-2，并發(fā)現(xiàn)從流行初期到末期患者中獲得的所有DENV-2之間高度同源，但與2014年滇西邊境瑞麗市同型流行株存在明顯不同，表明兩地疫情無相關(guān)性。流行病學(xué)調(diào)查表明，2015年西雙版納州DF疫情首先發(fā)生于景洪市，7月出現(xiàn)輸入性病例，8月發(fā)生本地病例，9月病例數(shù)快速上升并持續(xù)到11月，12月顯著下降；根據(jù)流行株進(jìn)化分析，首例來自泰國(guó)的輸入性病例(BND1529，7月15日)與早期2例本地感染病例(BND1523，8月17日；BND1521，8月19日)的病原(DENV-2)高度同源，并與9-11月本地流行株屬同一進(jìn)化群，親緣關(guān)系最近。由此認(rèn)為，2015年景洪市的本地DF流行與來自泰國(guó)的輸入性病例密切相關(guān)。雖然勐海和勐臘縣均有DF輸入性病例，但勐臘來自老撾的2例病例的輸入時(shí)間為10月，勐海來自緬甸的33例病例的輸入時(shí)間為9-12月，流行病學(xué)分析認(rèn)為，這些輸入性病例與景洪市本地DF流行無相關(guān)性。

20世紀(jì)80和90年代的媒介調(diào)查顯示，白紋伊蚊在西雙版納州廣泛分布，并從該蚊中分離到登革3和4型病毒[14-16]，還從當(dāng)?shù)厝巳貉逯袡z測(cè)到DENV抗體，表明20世紀(jì)后期，該地區(qū)曾發(fā)生過DF流行。近期調(diào)查亦表明，白紋伊蚊仍在西雙版納州廣泛分布[17]。埃及伊蚊是DF最重要的傳播媒介[2, 3]，云南省首次于2004年在瑞麗市姐告口岸發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊[18]，隨后，2009和2011年在西雙版納州的勐臘關(guān)累港和景洪港相繼發(fā)現(xiàn)該蚊，2013年景洪市DF流行期間該蚊在該市城區(qū)的構(gòu)成比明顯高于白紋伊蚊，2014年在西雙版納3個(gè)縣、市的13個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)該蚊并主要分布在城市地區(qū)[17]。本次調(diào)查進(jìn)一步證實(shí)埃及伊蚊為景洪城區(qū)(允景洪鎮(zhèn))和嘎灑鎮(zhèn)的優(yōu)勢(shì)蚊種，其分布區(qū)域與本地DF流行區(qū)相一致，提示該蚊種是本次疫情的主要傳播媒介。

西雙版納州2013年和2015年DF本地流行均主要發(fā)生在景洪城區(qū)及其鄰近地區(qū)，雖然這兩起疫情的上升和下降以及高峰期存在明顯差異，但疫情均始于7月，止于12月，與氣溫、降雨量和伊蚊密度密切相關(guān)。雖然這兩起疫情均引起了當(dāng)?shù)卣母叨戎匾?，采取了?qiáng)有力的控制措施，但也暴露出對(duì)早期疫情控制的不足，如2015年早期病例僅局限在景洪市某住宅小區(qū)，由于該疫點(diǎn)未能及時(shí)消除，以至疫情逐漸擴(kuò)散并波及整個(gè)城區(qū)及鄰近地區(qū)。2013年的情況亦然。鑒于埃及伊蚊在該地區(qū)的快速擴(kuò)散以及相鄰東南亞國(guó)家DF病例輸入的風(fēng)險(xiǎn)，今后應(yīng)全面落實(shí)經(jīng)常性的全民參與的蚊蟲控制措施，并加強(qiáng)全年輸入性和本地病例的監(jiān)測(cè)，其中6月和7月應(yīng)作為監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)時(shí)段；因蚊媒BI開始明顯上升且輸入性病例也開始出現(xiàn)，此期如能及時(shí)發(fā)現(xiàn)每一例DF病例尤其是境外入境人員中的病例，盡早采取有效的防蚊隔離和應(yīng)急滅蚊措施，對(duì)防止因輸入性病例引起的本地疫情至關(guān)重要；同樣，對(duì)局部早期發(fā)生的本地疫情也可有效控制其傳播擴(kuò)散。

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Investigation on an outbreak of dengue serotype 2 virus in Xishuangbanna prefecture of Yunnan province in 2015

LiYuanyuan,FengYun,FanJianhua,LiHongbin,ZhuJin,PanHong,LiWeiping,GaoYang,ZhangHailin

XishuangbannaPrefectureCenterforDiseaseControlandPrevention,Jinghong666100,China(LiYY,FanJH,LiHB,ZhuJ,LiWP,GaoY);YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention,YunnanProvincialKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,Dali671000,China(FengY,PanH,ZhangHL)

LiYuanyuanandFengYunarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

ZhangHailin,Email:zhangHL715@163.com;FanJianhua,Email:bncdcfjh@163.com

ObjectiveTounderstandtheepidemiologicfeaturesofanoutbreakofdenguefever(DF)inXishuangbannaprefectureofYunnanprovincein2015,withitsviralserum-typeandtransmissionsource.MethodsThedataofDFcasesinXishuangbannaprefecturewerecollected.TheserumsamplesfromacutestageofthesepatientswerecollectedtodetecttheviralnucleicacidbyRT-PCRassay.ThephylogenetictreewasgeneratedandanalyzedbasedonthenucleotidesequencesofC/PrMgenefragmentsofdenguevirus(DENV).ResultsAtotalof1 132casesofDFwerereportedinXishuangbannaprefecturein2015.Ofthem, 1 089wereindigenouscases(96.20%), 43wereimportedcases(3.80%),i.e., 38fromMyanmar, 3fromLaosand2fromThailand.AutochthonousDFoccurredinurbanareaandGasatowanofJinghongcitythattherewasdistributionofAedes aegyptimosquitoes.EpidemicmonthofDFwasfromJulytoDecember.Themajorityofpatientswereagedfrom20to49years-old,withtheyoungest2yearsoldandtheeldest93yearsold.Themaletofemaleratiowas1:1.05.TheresultsofvirusnucleicaciddetectionandsequencingindicatedthatnucleotidesequencesofC/PreMof33virusstrainswereobtainedfromtheDFcases.Phylogeneticanalysisindicatedthatthe33strainsbelongedtoDENVserotype2 (DENV-2),andthestrainfromtheimportedcasesofThailandsharedhighhomologywiththestrainsfromindigenouscasesaswellasbelongedtosameclade.TheseDENV-2strainsfromXishuangbannahadaclosergeneticrelationshipwiththestrainsisolatedfromSoutheastAsia,FujianandGuangdongprovincesofChina,however,distantrelativeswithDENV-2strainsfromRuilicityofYunnanprovincein2014.ConclusionsTheautochthonousDFepidemicoccurredinXishuangbannain2015wascausedbyDENV-2.ThestudyalsosuggeststhatthetransmissionofDFfromThailandtoXishuangbannaofChinawasthemaincauseoftheautochthonousDFepidemic,andAedes aegyptimosquitowasthemaintransmittingvectorinthelocal.ShouldstrengthensurveillanceandmanagementontheimportedcasesandindigenouscasesofDFandmosquitocontrolinthisregionisthekeymeasurestopreventprevalenceofthediseaseonceagain.

Denguefever;Denguevirus;Phylogeneticanalysis;Epidemiology

張海林，Email: zhangHL715@163.com；范建華，Email: bncdcfjh@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.002

2016-06-01)