蒙珊　趙萬(wàn)紅　張亦琳　王芳俠　田村秀人　山下泰史

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 陜西 西安 710004；2.日本醫(yī)科大學(xué)附屬病院血液內(nèi)科， 日本 東京 113-860)

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PD-1在骨髓增生異常綜合征中的表達(dá)及意義*

蒙珊1趙萬(wàn)紅1張亦琳1王芳俠1田村秀人2山下泰史2

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 陜西 西安 710004；2.日本醫(yī)科大學(xué)附屬病院血液內(nèi)科， 日本 東京 113-860)

目的檢測(cè)負(fù)性共刺激分子PD-1在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與相關(guān)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，探討其在MDS發(fā)病過(guò)程中所起的作用。方法收集44例MDS患者外周血標(biāo)本(MDS組)和25例健康者外周血作陰性對(duì)照(NC組)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1在T細(xì)胞上的表達(dá)， RT-PCR檢測(cè)T細(xì)胞亞群中PD-1 mRNA的表達(dá)，同時(shí)ELISA法檢測(cè)MDS患者血清中可溶性PD-1的水平。收集MDS患者相關(guān)臨床指標(biāo)，線性相關(guān)分析法分析PD-1mRNA水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果MDS組患者中PD-1mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為(11.31±0.18)%，而NC組陽(yáng)性率為(6.46±0.25)%，與NC組相比，MDS患者中CD3+、CD4+及 CD8+ T 細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平及PD-1 mRNA水平顯著升高。MDS組患者血清sPD-1水平較NC組明顯升高。在MDS組患者中，CD3+、CD8+ T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平與LDH水平呈顯著正相關(guān)，CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)水平與CRP呈顯著正相關(guān)。 結(jié)論 T細(xì)胞表面PD-1分子的高表達(dá)可能在MDS發(fā)病過(guò)程中起到一定作用。

PD-1；骨髓增生異常綜合征(MDS)；T細(xì)胞；LDH；CRP

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是一種造血干細(xì)胞異?？寺∷碌难合到y(tǒng)惡性疾病，目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為，自身免疫因素在其發(fā)病中起了重要作用[1,2]。該觀點(diǎn)認(rèn)為由于多種免疫負(fù)調(diào)控機(jī)制的參與，使患者自身免疫細(xì)胞不能有效清除異?？寺。瑥亩鴮?dǎo)致本病的發(fā)生[3]。

近年來(lái)，PD-1(programmed death-1)/B7-H1信號(hào)通路作為重要的免疫負(fù)調(diào)控通路，由于其在多種自身免疫病及惡性腫瘤的免疫耐受中的作用而備受關(guān)注[4]。PD-1分子屬于免疫球蛋白超家族的一員，在T、B淋巴細(xì)胞抗原受體激活后呈誘導(dǎo)性的表達(dá)于T、B細(xì)胞表面。PD-1有兩個(gè)屬于B7家族的配體，分別為B7-H1(又稱為PD-L1或CD274)和B7-DC(也稱PD-L2或CD273)。PD-1與B7-H1結(jié)合后，與T細(xì)胞受體共同傳遞抑制性信號(hào)給T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞增殖、活化和細(xì)胞因子的分泌，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡[5]。

目前多項(xiàng)研究證實(shí)，PD-1與B7-H1的相互作用在多種血液系統(tǒng)疾病如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、再生障礙性貧血中起著重要作用[6]，但關(guān)于MDS患者中PD-1/B7-H1通路的研究較少，該通路在MDS發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確[7]。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)MDS患者體內(nèi)PD-1的表達(dá)水平，分析其表達(dá)水平與相關(guān)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，以探討PD-1在MDS發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1　材料與方法

1.1材料FITC標(biāo)記的抗PD-1單抗及PE標(biāo)記的抗CD8單抗購(gòu)自eBioscience公司，PE標(biāo)記的抗CD3、抗CD4單抗購(gòu)自美國(guó)BD公司；FACScan雙色流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Priemix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；CD3免疫磁珠分選試劑盒購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集收集2007～2009年日本醫(yī)科大學(xué)附屬病院血液內(nèi)科收治的44例MDS患者(MDS組)，其診斷及分型符合WHO標(biāo)準(zhǔn)[8]，患者一般臨床資料(見(jiàn)表1)。獲得相關(guān)知情同意后，收集上述患者的肝素抗凝外周血及其血清(-80℃保存)用于下一步實(shí)驗(yàn)。另選25例健康者(NC組)的外周血作陰性對(duì)照(negative control, NC)。同時(shí)收集患者的相關(guān)臨床指標(biāo)，包括血紅蛋白、血小板、LDH、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)等指標(biāo)。

表1　44例MDS患者一般臨床資料

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDS患者及健康者外周血T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)每個(gè)流式檢測(cè)管中分別加入50 μl稀釋好的FITC標(biāo)記的抗PD-1單抗及PE標(biāo)記的抗CD3單抗(或抗CD4、抗CD8的單抗)，同型對(duì)照管中加入50 μl緩沖液，隨后每管分別加入100 μl全血輕輕混勻后，避光孵育15～30 min，每管分別加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫避光孵育10 min，室溫300 g離心5 min，棄上清后緩沖液洗滌細(xì)胞2次，重懸后上機(jī)檢測(cè)，采用儀器自帶的Cellquest software 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)MDS患者及健康者外周血T細(xì)胞上PD-1mRNA的表達(dá)水平取5例健康者及2例MDS患者的外周血，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMNCs)，采用免疫磁珠分選法分離CD3+T細(xì)胞，純度達(dá)98%以上。健康者的CD3+T細(xì)胞使用植物血凝素刺激2 d(終濃度為10 μg/ml)后作為陽(yáng)性對(duì)照。提取CD3+T細(xì)胞的總RNA，使用SuperscriptⅡ 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后采用SYBR Priemix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為PD-1上游：CGCACGAGGGACAATAGGAG，PD-1下游：GGTCTTCTCTCGCCACTGGAA，內(nèi)參基因ACTB引物上游:TGGCACCCAGCACAATGAA，下游CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA。PD-1 mRNA表達(dá)水平使用ABI PRISM 7500快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行分析，2-ΔΔCt法分析PD-1mRNA的相對(duì)含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4ELISA法檢測(cè)MDS及其健康者血清中可溶性PD-1(soluble PD-1, sPD-1)的水平取出-80℃保存的血清，室溫融化，取出4 ℃保存的試劑盒，室溫平衡后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，隨后采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的OD值。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算各樣本sPD-1的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件及GraphPad Prism5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各變量數(shù)值采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，兩組之間連續(xù)變量的比較采用Student’st檢驗(yàn)，采用線性相關(guān)分析法分析PD-1水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PD-1在MDS患者T細(xì)胞上的表達(dá)水平流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，PD-1在MDS患者CD3+T細(xì)胞、CD4+T、CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，兩組PD-1表達(dá)水平，見(jiàn)表2。

表2　兩組病例PD-1 在T細(xì)胞上的表達(dá)

注:與NC組相比①P<0.05

2.2PD-1mRNA在MDS患者CD3+T細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高從5例健康者及2例MDS患者血標(biāo)本中分離出了高純度的CD3+T細(xì)胞，并對(duì)CD3+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平進(jìn)行了定量研究。結(jié)果顯示，1例MDS患者的PD-1mRNA表達(dá)水平明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組，另外1例MDS患者PD-1mRNA表達(dá)水平與NC組中最高者的表達(dá)水平相似，見(jiàn)圖1。

圖1PD-1mRNA在CD3+T細(xì)胞上的相對(duì)表達(dá)量

Figure 1Expression of D-1 mRNA in CD3+ T cells

注：PC. 陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞(PHA刺激后的健康者CD3+T細(xì)胞); NC. 陰性對(duì)照(健康者); P. MDS患者

2.3MDS患者血清sPD-1的表達(dá)水平明顯升高對(duì)20例MDS患者及11例健康者的血清，采用ELISA法檢測(cè)了血清中sPD-1的水平。結(jié)果顯示，MDS組患者血清中sPD-1水平較NC組明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4PD-1高表達(dá)與LDH、CRP水平密切相關(guān)采用線性相關(guān)分析法對(duì)PD-1的表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在MDS組患者中，PD-1在CD3+、CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)水平與LDH水平呈顯著正相關(guān)(見(jiàn)圖3)，在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)水平與CRP呈顯著正相關(guān)(見(jiàn)圖4)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PD-1表達(dá)水平與血小板水平趨勢(shì)一致，但兩者之間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，見(jiàn)圖5)，未發(fā)現(xiàn)PD-1表達(dá)水平與血紅蛋白之間存在相關(guān)性。

圖2兩組病例血清sPD-1水平比較

Figure 2 Serum sPD-1

3　討論

PD-1為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的負(fù)性共刺激分子之一，通過(guò)與其配體B7-H1相結(jié)合，在T細(xì)胞免疫應(yīng)答的初始階段及效應(yīng)階段抑制T細(xì)胞的活化、促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，從而介導(dǎo)免疫耐受。MDS為惡性克隆性疾病，目前已有研究表明，MDS患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能低下，T細(xì)胞數(shù)量明顯降低，CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量減少、功能受抑[9]。因此我們推測(cè)PD-1/B7-H1信號(hào)通路可能在MDS的發(fā)病中起著一定作用。

本課題組前期采用MDS細(xì)胞系及患者標(biāo)本進(jìn)行的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MDS原始細(xì)胞表面B7-H1表達(dá)水平較健康者明顯增高，細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，抑制T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的能力越強(qiáng)，且其表達(dá)水平與MDS患者疾病危險(xiǎn)度密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些B7-H1能與正常T細(xì)胞上表達(dá)的PD-1相結(jié)合，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡[10]。由此推測(cè)，T細(xì)胞表面可能存在PD-1的過(guò)度表達(dá)，其接受B7-H1介導(dǎo)的負(fù)性共刺激信號(hào)后， T細(xì)胞增殖受抑制、凋亡過(guò)度，從而導(dǎo)致MDS的發(fā)生。

圖3T細(xì)胞上PD-1表達(dá)與LDH水平之間的相關(guān)性

Figure 3Relationship of expression of PD-1 and LDH in T cell

注：NS.無(wú)顯著性差異

圖4T細(xì)胞上PD-1表達(dá)與CRP水平之間的相關(guān)性

Figure 4Relationship of expression of PD-1 and CRP in T cell

注：NS.無(wú)顯著性差異

圖5T細(xì)胞上PD-1表達(dá)與血小板水平之間的相關(guān)性

Figure5Relationship of expression of PD-1 and platelet

注：NS.無(wú)顯著性差異

本研究進(jìn)一步證實(shí)，MDS患者T細(xì)胞通常存在PD-1的過(guò)度表達(dá)，其表達(dá)陽(yáng)性率和mRNA表達(dá)水平均明顯高于健康者，且在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)水平具有一定的差異性。其可能原因是在負(fù)性免疫調(diào)節(jié)的過(guò)程中，不同的T細(xì)胞亞群起著不同的作用[11]。另外我們還發(fā)現(xiàn)，PD-1mRNA表達(dá)水平與患者血漿LDH及CRP水平呈顯著正相關(guān)，與血小板水平趨勢(shì)一致，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與血紅蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)性。

LDH是一種常用的腫瘤標(biāo)志酶，其活性水平很大程度上可以反映惡性細(xì)胞的增殖、代謝等生物學(xué)性狀[12]。而CRP作為一種炎癥蛋白，已被證實(shí)與多種惡性疾病的預(yù)后相關(guān)[13]。由此推測(cè)，PD-1表達(dá)水平也與MDS患者的預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)水平越高，與B7-H1結(jié)合后傳遞的負(fù)性免疫調(diào)控作用越強(qiáng)，抑制T細(xì)胞增殖、促進(jìn)T細(xì)胞凋亡的作用越強(qiáng)，預(yù)后越差。國(guó)內(nèi)學(xué)者曾慧等研究認(rèn)為，MDS患者PD-1表達(dá)水平升高的同時(shí)，伴隨著其他一些負(fù)性信號(hào)，從而共同起到抑制T細(xì)胞活化的作用；另外他們還發(fā)現(xiàn)，PD-1表達(dá)水平隨著MDS疾病的進(jìn)展而升高[14]。本課題組研究結(jié)論與該結(jié)論一致[15]。

多項(xiàng)研究證實(shí)，除了細(xì)胞模型之外，PD-1還存在可溶型，即sPD-1。機(jī)體內(nèi)的sPD-1通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)靶器官或作用靶點(diǎn)，從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)腎癌患者血清中sPD-1水平明顯升高，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者sPD-1水平較健康對(duì)照組明顯升高，據(jù)此推測(cè)，MDS患者血清sPD-1水平可能在MDS患者的診斷及預(yù)后中具有一定的價(jià)值。

隨著對(duì)PD-1/B7-H1信號(hào)通路在惡性疾病中負(fù)性免疫調(diào)控作用的逐步揭示，針對(duì)PD-1/B7-H1的靶向治療逐漸成為研究熱點(diǎn)[18-19]。目前為止，PD-1/B7-H1通路阻斷劑和抗PD-1和PD-L1 單克隆抗體的研究已在相關(guān)領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。多項(xiàng)荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，阻斷PD-1/B7-H1通路可以增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)、延長(zhǎng)生存期、改善預(yù)后。Rosenblatt等[20]使用CT-011阻斷多發(fā)性骨髓瘤中的PD-L1通路，取得了良好效果，Hallett等[21]發(fā)現(xiàn)在小鼠多發(fā)性骨髓瘤模型中，聯(lián)合造血干細(xì)胞移植及PD-1/B7-H1阻斷治療，可使荷瘤小鼠存活率提高至40%。且在上述實(shí)驗(yàn)中并未觀察到明顯毒性和致死性不良反應(yīng)。目前，多種針對(duì)PD-1/B7-H1通路阻斷的單克隆抗體用于進(jìn)展期惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)都在進(jìn)行中[22-23]。因?yàn)樵撏吩贛DS發(fā)病中可能起著類似的作用，由此推測(cè)，在不久的將來(lái)，該療法可能也將為MDS的治療提供新的思路。

4　結(jié)論

本文資料提示，PD-1在MDS患者T細(xì)胞上呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者LDH及CRP水平呈正相關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示MDS的臨床發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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PD-1 expression in myelodysplastic syndromes and its clinical significance

MENG Shan1, ZHAO Wanhong1, ZHANG Yilin1,et al

(1.DepartmentofHematology,TheSecondHospitalAffiliatedMedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,Shanxi; 2.DivisionofHematology,DepartmentofMedicine,NipponMedicalSchool,Tokyo113-8603,Japan)

ObjectiveTo examine PD-1 expression in myelodysplastic syndromes (MDS) patients, analyze its correlation with some selected clinical parameters and explore its role in MDS pathophysiology. MethodsBlood specimens from 44 MDS patients were collected, and specimens from 25 healthy volunteers were used as negative control (NC). Flow cytometry assay and RT-PCR were used to detect PD-1 expression on T cells and PD-1 mRNA expression in different T cell subsets, respectively, and ELISA was applied to detect soluble PD-1 (sPD-1) in MDS patients serum. Then linear correlation analysis was performed to analyze the relationship between PD-1mRNA level and selected clinical parameters. ResultThe expression rate of PD-1 of MDS patients and NC were 11.31±0.18% and 6.46±0.25%. Compared with NC, MDS patients had high expression of PD-1 and PD-1mRNA in T cell subset including CD3+, CD4+ and CD8+T cells. sPD-1 in MDS patients was significantly high than that in NC group. In MDS patients, PD-1mRNA levels in CD3+ and CD8+T cells had positive correlation with LDH levels, whereas it mRNA level on CD4+T cells showed a positive correlation with CRP level. ConclusionPD-1 overexpresses on T cells of MDS patients, which may play some role in the genesis of MDS.

PD-1; Myelodysplastic Syndromes; T cells; LDH; CRP

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2013JZ011)

趙萬(wàn)紅, 醫(yī)學(xué)博士,E-mail: 13991365406@163.com.

R 551.3

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.004

2016-06-01； 編輯： 陳舟貴)