牟　云，汪文倫，嚴(yán)　國，王會敏，高劍峰

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

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沙漠小球藻的蛋白雙向電泳分析

牟云，汪文倫，嚴(yán)國，王會敏，高劍峰*

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

為建立適用于小球藻(Chlorellasp. TLD6B)蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳體系，該研究比較了TCA/丙酮沉淀法和Trisol提取法對小球藻蛋白的提取效果，不同pH梯度IPG膠條(pH3～10和 pH4～7)、不同蛋白質(zhì)上樣量、不同聚焦程序?qū)π∏蛟宓鞍椎姆蛛x效果。結(jié)果表明：(1)采用Trisol提取法可獲得較高純度蛋白，當(dāng)選擇24 cm pH 3～10的線性IPG膠條時(shí)，上樣量為500 μg，聚焦80 000 Vh效果最佳，可分辨蛋白點(diǎn)達(dá)726個(gè)；當(dāng)選擇24 cm pH 4～7的線性IPG膠條時(shí)，上樣量為1 000 μg，聚焦80 000 Vh效果最佳，可分辨蛋白點(diǎn)達(dá)1 230個(gè)。(2)該實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選了10個(gè)膠內(nèi)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析表明，其中8個(gè)蛋白點(diǎn)鑒定成功，進(jìn)一步說明Trisol提取法可適用于小球藻雙向電泳分析。

小球藻；雙向電泳；Trisol提取法

雙向電泳(2-DE)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)由O’Farrell于1975年建立[1]，其利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差異可一次性分離幾千甚至幾萬的蛋白質(zhì)點(diǎn)，具有較高的靈敏度和分辨率。目前，2-DE技術(shù)已在細(xì)菌、真菌、動植物[2-4]中被廣泛應(yīng)用，但關(guān)于微藻、特別是小球藻的2-DE技術(shù)則報(bào)道的相對較少。在2-DE技術(shù)中，蛋白提取和體系優(yōu)化是最為重要的環(huán)節(jié)，小球藻中含有大量的多糖、淀粉、脂質(zhì)等干擾物質(zhì)，因此尋求適合的蛋白提取方法極為重要；此外，由于不同植物的生物學(xué)特征、生理生化特征不盡相同，不同植物的最適電泳條件也不盡相同[5]，所以探求小球藻的最適電泳條件有一定的必要性。

小球藻為球形或橢圓形、綠色、單細(xì)胞藻類植物，也是真核微生物的一種。其細(xì)胞直徑3～8 μm，是地球上最早的生命之一，出現(xiàn)在20多億年前，遺傳相對保守，其廣泛分布于海洋、土壤和荒漠。作為分布廣泛的單細(xì)胞低等生物，小球藻是在單細(xì)胞水平上研究植物逆境脅迫條件下蛋白表達(dá)及其調(diào)控的絕佳材料。目前，國內(nèi)外關(guān)于藻類抗逆蛋白組學(xué)的研究日趨活躍。同時(shí)，小球藻作為重要的生物質(zhì)能源的儲備資源也被廣泛應(yīng)用。Wang等[6]通過雙向電泳技術(shù)研究了雨生紅球藻細(xì)胞壁蛋白質(zhì)對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。Liska等[7]從蛋白組學(xué)角度分析了杜氏鹽藻的耐鹽性機(jī)制。Wagner等[8]通過雙向電泳技術(shù)研究了雷氏衣藻的晝夜節(jié)律蛋白。Murugaiyan J等[9]研究了致病無綠藻和非致病無綠藻之間的蛋白組學(xué)差異。Song等[10]通過雙向電泳技術(shù)比較分析了正常和缺氮組球等鞭金藻的蛋白組學(xué)變化，從蛋白組學(xué)水平揭示了氮元素對小球藻產(chǎn)油的影響。

沙漠小球藻作為一種低等的單細(xì)胞植物，其個(gè)體生長的分子機(jī)制尚不明確；截止至今大規(guī)模培養(yǎng)小球藻未取得突破性進(jìn)展。為了深入研究小球藻個(gè)體生長的分子機(jī)制和其對干旱、高鹽等逆境的應(yīng)答機(jī)制，從蛋白組學(xué)和基因組學(xué)水平研究其蛋白和基因的表達(dá)差異就顯得尤為重要。因此，本研究比較了TCA/丙酮沉淀法和Trisol提取法對小球藻蛋白的提取效果，同時(shí)比較了不同pH梯度IPG膠條(pH3～10和 pH4～7)、不同蛋白質(zhì)上樣量、不同聚焦程序?qū)π∏蛟宓鞍椎姆蛛x效果；建立了一套沙漠小球藻2-DE技術(shù)方法，不僅為沙漠小球藻抗逆蛋白組學(xué)研究提供了技術(shù)條件，也為其他陸生藻類的蛋白組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用藻種由本實(shí)驗(yàn)室從新疆塔克拉瑪干沙漠沙樣中分離、純化并鑒定。將Chlorellasp.(TLD6B)原藻液以10%接種量轉(zhuǎn)至3個(gè)裝有500 mL BBM培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中；接種后的藻樣置于光照箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4 000 lx，12 h光照，溫度23 ℃；至對數(shù)生長期離心收集藻體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白質(zhì)提取(1)TCA/丙酮沉淀法參見Damerval等[11]的方法。(2)Trisol提取法參見Fred等[12]的方法。具體步驟為：取適量藻液6 000 r/min離心5 min，所得藻泥用蒸餾水洗3次；液氮研磨破壁，加入1 mLTrisol試劑，室溫下靜置5 min，加入200 μL三氯甲烷于細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，充分混勻，室溫下靜置5 min，之后4℃、12 000 r/min離心15 min，棄無色頂層；加入300 μL乙醇，4℃、12 000 r/min離心5 min；將上清轉(zhuǎn)移到新離心管中并加入1.5 mL異丙醇，室溫下靜置20 min，之后12 000 r/min離心10 min；所得沉淀用95%乙醇清洗之后在用80%預(yù)冷丙酮沉淀30 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀空氣中干燥。

1.2.2蛋白樣品的裂解及定量加入一定體積的裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer,1%DTT)溶解蛋白，30℃水浴促溶2 h，15 000 r/min離心30 min；上清即為蛋白液。采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(2-D Quant-Kit, GE-Healthcare)對所提蛋白進(jìn)行定量。

1.2.3SDS-PAGE 蛋白電泳采用常規(guī)SDS-PAGE對所提蛋白進(jìn)行分離；其中分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，上樣量為30 μg；電泳完畢采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色。

1.2.4雙向電泳一向等電聚焦采用24 cm線性IPG膠條(GE-Healthcare)，根據(jù)蛋白濃度確定上樣量，用水化液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，0.5%IPG buffer,1%DTT，0.0002%溴酚藍(lán))補(bǔ)齊至450 μL。在泡脹盤中對膠條進(jìn)行過夜被動泡脹后，使用Ettan IPGphor3等電聚焦儀進(jìn)行第一向等電聚焦，聚焦程序?yàn)椋?00 V 2 h；300 V 3 h；1 000 V 3 h；3 000 V 3 h；8 000 V 3 h；8 000 V，分別聚焦60 000 Vh、70 000 Vh、80 000 Vh；500 V，任意時(shí)間。聚焦完成的膠條立即進(jìn)行平衡，平衡分兩步，每次15 min。平衡液Ⅰ含6 mol/L 尿素、2% SDS、75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、20% Glycerol (甘油)、0.000 2%溴酚藍(lán)和1% DTT，平衡液Ⅱ含6 mol/L 尿素、2% SDS、75 mmol/L pH 8.8Tris-HCl、20% Glycerol和2.5% Iodacetamide(碘乙酰胺)。每次平衡后用蒸餾水沖洗膠條并于濾紙上瀝干水分。將平衡后的膠條放入二向膠上，并用0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠，使用EttanDaltSix垂直板電泳儀進(jìn)行第二向SDS-PAGE蛋白電泳，調(diào)恒溫水浴15 ℃，每張10 mA電泳30 min，然后每張38 mA電泳5～6 h，待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)凝膠底部停止電泳。

1.2.5圖像掃描與分析使用ImageScannerⅢ對圖像進(jìn)行掃描，并用Labscan軟件進(jìn)行照相，圖像分辨率300 dpi；用ImageMaster Platinum 7.0對掃描結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6挖點(diǎn)及膠內(nèi)酶解與質(zhì)譜分析根據(jù)ImageMaster Platinum 7.0軟件分析的結(jié)果，用200 μL槍頭(根據(jù)蛋白點(diǎn)大小減去前端適當(dāng)部分)插取蛋白點(diǎn)，并放入PCR小管中，送上海生工生物工程股份有限公司完成膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析。將得到的肽質(zhì)量指紋圖提交到Mascot (www.matrixscience.com)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，搜索參數(shù)設(shè)定如下：檢索數(shù)據(jù)庫為NCBInr，物種選擇綠色植物，胰蛋白酶酶解，固定修飾為Carbamidomethyl (C)，可變修飾為Acetyl (Protein N-term)、Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)、Oxidation (M)，肽段偏差100 ppm。

2　結(jié)果與分析

2.1不同蛋白質(zhì)提取方法的比較分析

采用Trisol提取法和TCA/丙酮沉淀法提取小球藻的全蛋白，結(jié)果(圖1)顯示。2種蛋白提取方法均能獲得較為清晰的條帶，Trisol法提取的蛋白大致分布在18.4 ～116.0 kD之間；TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白大致分布在25.0 ～116.0 kD之間，說明對于分子量小于25.0 kD的蛋白該方法不能有效提取，造成了蛋白的丟失(圖1，A)。Trisol提取法獲得的蛋白溶液濃度為(9.87±0.52) mg/mL，而TCA/丙酮沉淀法所獲蛋白濃度則為(4.93±0.56) mg/mL(圖1,B)。綜上說明Trisol提取法更適用于小球藻蛋白的提取和后續(xù)的雙向電泳實(shí)驗(yàn)。

2.2不同蛋白上樣量的雙向電泳結(jié)果比較

為了使電泳圖像有更高的分辨率，對雙向電泳中蛋白的上樣量進(jìn)行了對比分析。

用Trisol提取法提取小球藻全蛋白，分別選用24 cm、pH 3～10和pH 4～7 IPG膠條。選用24 cm、pH 3～10的IPG膠條時(shí)分別取1 100、800和500 μg的蛋白樣品進(jìn)行上樣;選用24 cm、pH 4～7 IPG膠條時(shí)分別取1 200和1 000 μg蛋白樣品進(jìn)行上樣。結(jié)果(圖2)顯示，采用pH 3～10 IPG膠條，上樣量為1 100 μg時(shí)，蛋白基本不能聚焦成規(guī)則的點(diǎn)且橫條紋嚴(yán)重，蛋白圖譜中可識別的蛋白點(diǎn)僅有172個(gè)(圖2，A)；上樣量為800 μg時(shí)，蛋白點(diǎn)數(shù)較多，但一些高豐度蛋白點(diǎn)過大導(dǎo)致飽和重疊現(xiàn)象的發(fā)生，蛋白圖譜中可識別的蛋白點(diǎn)有333個(gè)(圖2，B)；上樣量為500 μg時(shí)，蛋白點(diǎn)清晰且無橫條紋，聚焦效果好，蛋白圖譜中可識別的蛋白點(diǎn)高達(dá)726個(gè)，能更好地滿足實(shí)驗(yàn)分析的需求(圖2，C)。采用pH 4～7 IPG膠條，上樣量為1 200 μg時(shí)，同樣高豐度蛋白掩蓋了部分低豐度蛋白的分離，可識別蛋白點(diǎn)有935個(gè)(圖2，D)；減少上樣量至1 000 μg，蛋白點(diǎn)相對清晰，圖譜質(zhì)量較佳，可識別的蛋白點(diǎn)高達(dá)1 230個(gè)(圖2，E)。

A.不同蛋白提取方法制備的蛋白SDS-PAGE分析；B.不同蛋白提取方法所得蛋白濃度比較；M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～3和a. Trisol提取法；4～6和b. TCA/丙酮沉淀法圖1　不同蛋白提取方法的比較A. SDS-PAGE of proteins extracted by different methods; B.Comparison of protein concentrations; M. Protein molecular weight marker; 1～3 and a.Trisol extraction;4～6 and b.TCA/acetone precipitationFig.1　Comparison of different protein extraction methods

A～C為pH 3～10 IPG膠條所得圖譜，上樣量分別為1 100、800和500 μg；D～E為pH 4～7 IPG膠條所得圖譜，上樣量分別為1 200和1 000 μg圖2　不同上樣量2-DE圖譜比較 A～C were 2-DE maps which using pH 3～10 linear IPG strip, loading volume were 1 100 ,800 and 500 μg, respectively; D～E were 2-DE maps which using pH 4～7 linear IPG strip, loading volume were 1 200 and 1 000 μg, respectivelyFig.2　2-DE maps of different loading volumes

圖3　不同聚焦程序的2-DE圖譜比較A.60 000 Vh；B. 70 000 Vh；C.80 000 VhFig.3　2-DE maps of different IEF time

2.3不同聚焦程序的雙向電泳結(jié)果比較

采用pH 3～10 IPG膠條，上樣量500 μg，聚焦時(shí)間分別為60 000 Vh、70 000 Vh和80 000 Vh，電泳結(jié)果(圖3)顯示，聚焦時(shí)間為60 000 Vh時(shí)，電泳圖譜中存在大量的橫條紋且可分辨的蛋白點(diǎn)較少，僅有196個(gè)(圖3，A)；聚焦時(shí)間為70 000 Vh時(shí)，圖譜中的橫條紋相對減少，但仍存在部分橫條紋，說明一些蛋白還未充分聚焦，可分辨的蛋白點(diǎn)為398個(gè)(圖3，B)；聚焦時(shí)間為80 000 Vh時(shí)，圖譜中橫條紋明顯減少，可分辨的蛋白點(diǎn)達(dá)到763個(gè)(圖3，C)。而pH 4～7 IPG膠條的聚焦程序優(yōu)化建立在pH 3～10 IPG膠條的基礎(chǔ)之上，采用80 000 Vh的聚焦時(shí)間可獲得較高質(zhì)量的蛋白圖譜(圖2，E)。由此可見，采用pH 3～10和pH 4～7IPG膠條時(shí)，聚焦80 000 Vh可獲得分辨率高且橫條紋少的電泳圖譜。

2.4小球藻蛋白的質(zhì)譜分析鑒定

隨機(jī)選取pH 4～7的2-DE圖譜中10個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定(圖4)，8個(gè)蛋白點(diǎn)鑒定成功(表1)，其中點(diǎn)C15得分210，序列覆蓋度為15%，為捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白I型；點(diǎn)C16得分151，序列覆蓋度為7%，為一個(gè)表達(dá)蛋白；點(diǎn)C17得分108，序列覆蓋度為5%，為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白；點(diǎn)C18得分102，序列覆蓋度為9%，為外膜蛋白/肽聚糖結(jié)合(脂)蛋白；點(diǎn)C19得分290，序列覆蓋度為2%，為ATP合酶β亞基；點(diǎn)C21得分58，序列覆蓋度為1%，為假想蛋白VITISV_024100；點(diǎn)C22得分98，序列覆蓋度為33%，為核酮糖磷酸異構(gòu)酶；點(diǎn)C24得分108，序列覆蓋度為3%，為假想蛋白CHLNCDRAFT_138237。說明從電泳圖譜中挖取的蛋白點(diǎn)可較好地滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析要求。

圖4　用于質(zhì)譜分析的10個(gè)蛋白點(diǎn)Fig.4　Ten randomly selected protein spots on 2-DE gel wereidentified by mass spectrometry表1　蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1　Identification of selected protein spots using MALDI-TOF-TOF

樣品名SamplenameGI號GInumber等電點(diǎn)Isoelectricpoint分子量Proteinmass匹配的肽段Matchedpeptide序列覆蓋度Sequencecoverage/%搜索得分Mascotscorea蛋白名稱ProteinnameC157604419815.93267832(2)15210Chlorophylla-bbindingproteinofLHCIItypeI捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白I型C165528460794.51193762(2)7151Expressedprotein表達(dá)蛋白C174937780374.99469042(1)5108ABCtransportersubstrate-bindingproteinABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白C183977183554.81138691(1)9102Outermembraneprotein/peptidoglycan-associated(lipo)protein,partial外膜蛋白/肽聚糖結(jié)合(脂)蛋白,部分C197604378715.301517882(2)2290ATPsynthasesubunitbeta,mitochondrialATP合酶β亞基,線粒體C211478162126.71880621(1)158HypotheticalproteinVITISV_024100假想蛋白VITISV_024100C2291879874.3846333(2)3398Putativeribulose-phosphate3-epimerase核酮糖磷酸異構(gòu)酶C245528454245.69286801(1)371HypotheticalproteinCHLNCDRAFT_138237假想蛋白CHLNCDRAFT_138237

3　討　論

在雙向電泳整個(gè)環(huán)節(jié)中，蛋白提取、IPG膠條pH范圍選擇、上樣量和聚焦時(shí)間是影響電泳圖譜質(zhì)量的必要因素。由于不同植物所含蛋白量和組分各不相同，因而對每種植物都需要進(jìn)行體系優(yōu)化[5]。

TCA/丙酮沉淀法是現(xiàn)今提取植物蛋白的常用方法之一，已在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用[13-14]。但此方法最大的弊端在于所提蛋白很難復(fù)溶，會導(dǎo)致一部分蛋白的缺失。Fred Wang-Fat Lee等[12]以亞歷山大藻和斯克里普藻為研究對象，采用Trisol提取法對這兩種微藻的蛋白進(jìn)行提取，得到的雙向電泳圖譜分辨率高，重復(fù)性好。

朱方超等[15]比較了TCA/丙酮沉淀法和改良酚法對水稻種子提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)TCA/丙酮沉淀法獲得的電泳圖譜中存在部分蛋白點(diǎn)的丟失，類似的情況在本實(shí)驗(yàn)中也得到了體現(xiàn)。與TCA/丙酮沉淀法相比，Trisol提取法可更有效去除小球藻中的色素、多糖、脂質(zhì)等干擾電泳結(jié)果的物質(zhì)且所提蛋白相對完整；此外，該方法還可減少高豐度蛋白對電泳結(jié)果的影響。所以，本實(shí)驗(yàn)采用Trisol提取法提取小球藻蛋白。

理論上，pH 3～10 IPG膠條比pH4～7 IPG膠條可分離得到更多的蛋白點(diǎn)，能更好地反映植物組織細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)情況。但是小球藻蛋白大多集中在pH5～7之間，極酸、極堿蛋白相對較少，采用pH3～10的IPG膠條就會使蛋白過于集中，無法使不同蛋白點(diǎn)有效分開，從而導(dǎo)致電泳圖譜的分辨率降低。多數(shù)學(xué)者采用pH4～7的IPG膠條進(jìn)行植物蛋白的分離，如甘露等[16]采用pH4～7 IPG膠條對甘藍(lán)型油菜蛋白進(jìn)行分離，王珊珊等[17]也采用pH4～7 IPG膠條對黃瓜根系蛋白進(jìn)行分離，Nicola等[18]在研究缺氮條件下硅藻的蛋白變化時(shí)采用了pH4～7 IPG膠條。但并非所有植物都可采用pH 4～7IPG膠條進(jìn)行分離，當(dāng)研究極酸和堿性蛋白時(shí)，采用pH3～10 IPG膠條才可達(dá)到分離效果[19]。本實(shí)驗(yàn)分別研究了pH4～7和pH3～10 IPG膠條的最適電泳條件，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

在雙向電泳過程中，上樣量也決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。提高上樣量有利于低豐度蛋白的檢出，但過高的上樣量則會導(dǎo)致鹽離子濃度過高，從而使一向等電聚焦不完全，蛋白圖譜則會出現(xiàn)較多的橫條紋，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)分析[20]；而過低的上樣量則不利用低豐度蛋白的顯現(xiàn)。梁文裕等[21]在發(fā)菜雙向電泳的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中采用24 cm、pH4～7 IPG膠條，上樣量為1 500 μg時(shí)能得到較清晰的蛋白圖譜。石海波等[22]在玉米籽粒的雙向電泳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中采用24 cm、pH3～10 IPG膠條，上樣量為800 μg時(shí)能得到較清晰的蛋白圖譜。因此，上樣量的選擇不僅要根據(jù)IPG膠條的pH范圍來考慮，還要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料、IPG膠條的長度、染色方法等因素綜合考慮。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)選擇24 cm、pH3～10 IPG膠條時(shí)，上樣量為500 μg，效果最佳；當(dāng)選擇24 cm、pH4～7 IPG膠條時(shí)，上樣量為1 000 μg，效果最佳。

等電聚焦程序設(shè)置的好壞直接影響電泳圖譜的分辨率，一般采用低電壓除鹽、緩慢升壓的方式進(jìn)行等電聚焦。因植物蛋白樣品中含大量的鹽分，低電壓則有助于鹽分的去除，使電壓最終能升到預(yù)設(shè)值。本實(shí)驗(yàn)對24 cm pH4～7和pH3～10 IPG膠條聚焦80 000 Vh，均可得到分辨率較高的蛋白圖譜。

本研究的小球藻分離自塔克拉瑪干沙漠，生長于此的小球藻及其他植物經(jīng)過百萬年的進(jìn)化，已經(jīng)完全適應(yīng)了沙漠的極端環(huán)境。為了深入了解其逆境適應(yīng)性，采用雙向電泳技術(shù)揭示干旱脅迫和高鹽脅迫下小球藻蛋白調(diào)控機(jī)制，不僅能從單細(xì)胞水平闡明低等植物在水、鹽脅迫下蛋白表達(dá)情況，更重要的是，能夠通過比較分析了解低等植物的單個(gè)細(xì)胞和高等植物組織中的每個(gè)細(xì)胞在抗逆過程中的功能，從而能夠解析高等植物的細(xì)胞、組織和器官乃至整個(gè)植株在抗逆過程中各自發(fā)揮的作用，從而為更加全面、系統(tǒng)地認(rèn)識植物抗逆分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究通過對沙漠小球藻雙向電泳體系優(yōu)化，建立了一套適用于小球藻的雙向電泳技術(shù)體系。采用Trisol提取法提取蛋白的純度和濃度均能達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求；當(dāng)選用24 cm pH3～10線性IPG膠條時(shí)，上樣量為500 μg，聚焦80 000 Vh，所得蛋白圖譜分辨率高，可分辨蛋白點(diǎn)達(dá)726個(gè)；當(dāng)選用24 cm pH4～7線性IPG膠條時(shí)，上樣量為1 000 μg，聚焦80 000 Vh，所得蛋白圖譜分辨率高，可分辨蛋白點(diǎn)達(dá)1 230個(gè)。

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(編輯:宋亞珍)

Analysis of Two-dimensional Electrophoresis Protocol For Desert Chlorella(Chlorellasp. TLD6B) Proteome

MU Yun, WANG Wenlun, YAN Guo,WANG Huiming, GAO Jianfeng*

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000,China)

In order to establish a two-dimensional gel electrophoresis (2D-E)protocol for proteomic study of desert chlorella (Chlorellasp. TLD6B), we compared the performances of protein extraction methods from desert chlorella betweenTCA/ acetone precipitation method and Trisol extraction. The chose pH gradient gel strips and protein loading volume were also optimized. Our results showed that: (1) trisol extraction could obtain high pure protein. The improved 2-DE system for desert chlorella was come out as follows: we distinguished 726 proteins with linear IPG strips of 24 cm in length with the pH ranges from 3 to 10, 500 μg loading volume, 80000 Vh of IEF time. We distinguished 1230 proteins with linear IPG strips of 24 cm in length with the pH ranges from 4 to 7, 1 000 μg loading volume, 80 000 Vh of IEF time. (2) Ten randomly selected protein spots were identified by using MALDI-TOF/TOF-MS to confirm the establishment of two-dimensional electrophoresis protocol could be used for primary analysis of desert chlorella proteome.

Chlorella；two-dimensional gel electrophoresis (2D-E)；Trisol extraction

1000-4025(2016)09-1905-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1905

2016-05-20;修改稿收到日期:2016-07-27

國家自然科學(xué)基金(31460276)

牟 云(1992-)，女，在讀碩士研究生,主要從事可再生能源的開發(fā)與利用相關(guān)研究。E-mail：1171534413@qq.com

高劍峰，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事可再生能源的開發(fā)與利用相關(guān)研究。E-mail：jianfengg@shzu.edu.cn

Q503

A