劉 璐， 孫典榮， 李純厚， 韓志強， 高天翔， 沈康寧， 宋 娜**

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；3. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022； 4. 臺灣海洋大學(xué)海洋中心，臺灣 基隆 20224)

?

DNA條形碼技術(shù)在鯔科魚類鑒定中的應(yīng)用*

劉 璐1， 孫典榮2， 李純厚2， 韓志強3， 高天翔3， 沈康寧4， 宋 娜1**

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；3. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022； 4. 臺灣海洋大學(xué)海洋中心，臺灣 基隆 20224)

本研究選用DNA條形碼的通用基因片段，采用特異性擴(kuò)增測序及與GenBank已有序列結(jié)合分析的方法，進(jìn)行了鯔科(Mugilidae)6屬17種魚類的COI基因片段的序列比較、分子樹構(gòu)建和系統(tǒng)進(jìn)化研究。研究表明，在所得的17種鯔科魚類共有的555bp COI基因片段中平均GC含量為46.9%。其中，第二密碼子位點含量最高(49.8%～56.2%)，平均54.9%;第一密碼子變化范圍最大(31.9%～48.6%)，平均42.9%;第三密碼子差別不顯著(42.5%～43.4%)，平均42.7%。依據(jù)Kimura-2-parameter模型(K2P)，17種鯔科魚類種內(nèi)遺傳距離的平均值為0.004 5，種間遺傳距離為0.191，是種內(nèi)遺傳距離的42倍。在分子系統(tǒng)樹上，所有物種均呈單系，5屬為獨立分支，只有隸屬于梭屬(Liza)的尖頭梭(Lizatade)與莫鯔屬(Moolgarda)聚類，表現(xiàn)出與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類不一致的結(jié)果。本研究結(jié)果驗證了線粒體COI基因作為DNA條形碼對鯔科魚類進(jìn)行物種鑒定的有效性，可用于輔助探討鯔科科下屬、種分類階元系統(tǒng)發(fā)育問題。

鯔科；COI基因；DNA條形碼；物種鑒定；系統(tǒng)發(fā)育

海洋生物分類和物種快速鑒定是開展?jié)O業(yè)生物多樣性和漁業(yè)資源管理的基礎(chǔ)和根本前提，也是海洋生物多樣性保護(hù)研究的重要內(nèi)容[1][2]。形態(tài)學(xué)鑒定作為一種傳統(tǒng)的分類方法已經(jīng)成功的描述了地球上近百萬種生物，為物種的分類和鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。但同時傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在著很多不足[3-4]，而DNA條形碼(DNA Barcoding)技術(shù)作為近年來發(fā)展迅速的一種物種鑒定的手段已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注，尤其是在保護(hù)生物學(xué)和生物多樣性調(diào)查等領(lǐng)域[5]，主要應(yīng)用于鑒定已有物種和發(fā)現(xiàn)新種[6]。相對于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)生物鑒定，DNA條形碼優(yōu)勢在于可以揭示隱存種，鑒定缺少形態(tài)數(shù)據(jù)(比如未成熟的、部分或損壞樣本、胃含物)或者從形態(tài)方面不易被區(qū)分的物種[7]，目前DNA條形碼已經(jīng)成功的應(yīng)用于多種海洋生物及其他多種生物類群的鑒定[10-13]。Hebert等發(fā)現(xiàn)線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基 1基因(Cytochrome oxidase subunit I,COI)能夠?qū)游锝绲奈锓N進(jìn)行有效的鑒定，并且在多數(shù)動物類群中，基因能被通用引物所擴(kuò)增，且都存在顯著的序列變異，所選用的區(qū)域片段長度在580 bp左右[14]。

鯔科(Mugilidae)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes)鯔形目(Mugiliformes)，在熱帶、亞熱帶、溫帶海域均有分布，是世界上分布最廣泛的經(jīng)濟(jì)魚類之一，亦是許多國家和地區(qū)的重要漁業(yè)和增養(yǎng)殖對象。由于大多數(shù)鯔科魚類的外部形態(tài)都極為相似(尤其是在幼魚階段)，因此一些鯔科魚類的種類鑒定尚存在一定困難，導(dǎo)致鯔科魚類的分類及系統(tǒng)演化關(guān)系存在爭議[15-18]。鯔科魚類曾歸屬于鱸形目(Perciformes)，現(xiàn)在已單獨劃分到鯔形目[19]。Thomson等通過詳細(xì)的調(diào)查取樣并且綜合近年來相關(guān)研究成果，將鯔科魚類定為14個屬，64個有效種[20]，而2014年Eschmeyer[15]等將鯔形目又重新劃分為10個屬31個種。但目前研究表明仍有一些屬被認(rèn)為是無效屬， 此外還可能存在有大量的隱存種(沈康寧等未發(fā)表*源于沈康寧待出版的書籍)。因此，本項研究采集了4屬9種鯔科魚類，同時結(jié)合已發(fā)表的5屬8種鯔科魚類的COI基因序列，開展了利用DNA條形碼對鯔科魚類分類鑒定的研究。本研究系統(tǒng)地分析了6屬17種鯔科魚類的線粒體COI基因，通過比較該基因序列在種內(nèi)和種間的差異，構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹，一方面，檢驗COI基因作為鯔科魚類DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行物種鑒別的有效性；另一方面，剖析COI基因在鯔科魚類輔助系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

本研究采集了梭屬(Liza)、鯔屬(Mugil)、莫鯔屬(Moolgarda)鯔科魚類共計45個個體(見表1)，其中采自中國近海的鯔科魚類物種分類鑒定參照陳大剛等的分類方法[21]，樣品保存于中國海洋大學(xué)漁業(yè)生態(tài)學(xué)實驗室。另有采自巴基斯坦近海鯔科魚類，參照NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2550 1/)以及Fishbase(http://fishbase.sinica.edu.tw/search.php)進(jìn)行物種鑒定，樣品保存于巴基斯坦卡拉奇大學(xué)漁業(yè)實驗室。以上樣品均取背部肌肉保存于酒精中，以備DNA基因組提取。

采用酚-氯仿[22]抽提方法提取基因組DNA, 將乙醇沉淀后的基因組DNA用50 μL超純水溶解，儲存在-20℃冰箱中備用。

1.2 引物設(shè)計、PCR及序列測定

擴(kuò)增線粒體DNA COI片段的引物參照文獻(xiàn)[9]中通用引物設(shè)計，分別為FishF1：5’—TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC—3’；FishR1: 5’— TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA—3’。PCR反應(yīng)體系總體積25μL，包括10 mmol/L Tris，pH=8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，dNTP 200 μmol/L，上、下游引物各200 nmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U，DNA模版1 μL，最后加滅菌蒸餾水至25 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃變性60 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，最后72 ℃延伸10 min。為了避免DNA的污染，以上反應(yīng)均設(shè)陰性對照組。將2 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物取出，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(U=5V/cm)，經(jīng)試劑盒對目的片段進(jìn)行回收純化，將陽性PCR產(chǎn)物送北京英濰捷基生物公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 基因序列信息下載

從Genbank下載5屬8種27個個體的鯔科魚類的COI基因序列，與本研究所檢測的9種鯔科魚類，共計6屬17種72個個體的COI基因同源序列進(jìn)行比對，以鯔形目魣科的油魣(Sphyraenapinguis)、斑條魣(Sphyraenajello)的同源序列作為外群進(jìn)行分析。物種的COI基因及其相關(guān)信息見表1。

表1 所用的鯔科6屬17種魚類的COI基因以及外群相關(guān)信息

續(xù)表1

物種①分類地位②樣品數(shù)③樣品采集地點及編號④GenBank登錄號⑤金梭梭屬5土耳其(Lau1、Lau2、Lau3)，西班牙(Lau4)，意大利(Lau5)KC500813，JQ623946，KC500816，EU715468，KJ552773前鱗梭梭屬5土耳其(Lc1、Lc2、Lc3、Lc4)，埃及(Lc5)KC500833，KC500835，KC500837，JQ62394F，N600159大鱗梭梭屬2菲律賓(Lma1、Lma2)KJ202168，JN021221綠背梭梭屬1菲律賓(Ls1)KJ013050英氏莫鯔莫鯔屬2菲律賓(Me1、Me2)JQ434913，JQ434911庫里鯔鯔屬5加勒比海(Mcu1、Mcu2、Mcu3、Mcu4、Mcu5)JQ842589，JX185206，JQ365432，JQ842247，JQ842246吻鯔吻鯔屬2印度(Rc1)，孟加拉國(Rc2)JX983483，KT364790油魣魣科魣屬1日本南部JF952863斑條魣魣科魣屬1南非KF489766

1.4 序列分析

所得測序結(jié)果通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和BOLD(http://www.barcodinglife.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性檢索，確認(rèn)實驗所得序列的準(zhǔn)確性。通過DNASTAR軟件對測得的COI基因片段序列進(jìn)行比對，并通過人工校正，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的序列，使用MEGA 3.0計算所得序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉(zhuǎn)換、顛換頻率及其比率。通過PAUP v.4.0(Swofford, 2002)[23]軟件基于鄰接關(guān)系法(Neighbor-joining, NJ)、最大簡約法(Maximum parsimony, MP)和最大似然法(Maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。通過MrBayes 3.0b4[24]軟件基于貝葉斯推斷法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。采用Modeltest v.3.06[25]根據(jù)AIC[26]準(zhǔn)則對各序列片段的最適替換模型進(jìn)行評估。NJ法采用1 000次自展分析檢驗各節(jié)點的置信度；MP法采用啟發(fā)式搜索(Heuristic search)和TBR(Tree bisection reconnection)枝長交換法，重復(fù)1 000次；構(gòu)建ML樹時，在1 000次重復(fù)中選擇似然率最大的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)作為最終樹，采用1 000次無參數(shù)自展分析計算各節(jié)點的支持率[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯔科魚類COI基因序列特征

本研究所用引物為FishF1和FishR1[14]，共計擴(kuò)增4屬9種鯔科魚類45條序列，以上序列均不存在序列長度上的變異，采用DNAStar系列軟件對以上序列和已發(fā)表的鯔科魚類COI同源序列進(jìn)行比對分析，保留共有序列得到序列片段長度為555 bp，編碼氨基酸185個。用MEGA 3.0軟件計算72條序列(本研究得到擴(kuò)增45條序列以及Genbank下載27條序列)的堿基組成，平均堿基組成為A：23.4%、T：29.7%、G：17.6%、C：29.3%，A+T含量(53.1%)高于G+C(46.9%)。針對鯔科魚類COI片段的平均G+C含量為46.9%。其中，第二密碼子位點含量最高54.9%，第一密碼子為42.9%。第三密碼子為42.7%(見表2)。

表2 鯔科17種魚72個個體的COI基因部分序列中各堿基平均分布頻率

所有個體序列核苷酸變異情況見表3。其中保守位點有343個，轉(zhuǎn)換位點有59個，顛換位點有24個。其中第三密碼子的保守位點數(shù)最多，有174個。第一密碼子的轉(zhuǎn)換位點和顛換位點數(shù)最多，分別為53和23個。

表3 鯔科17種魚72個個體的COI基因部分序列3個密碼子堿基變異情況

Note:①Codon sites;②Invariable sites;③Transition sites;④Transversion sites

如表4中所示，17種鯔科魚類的COI基因片段平均GC含量為43.2%～49.0%，其中第二密碼子位點的GC含量最高(49.8%～56.2%)，第一密碼子變化范圍最大(31.9%～48.6%)。第三密碼子GC含量差別不顯著(42.5%～43.4%)。鯔魚COI基因片段的GC含量最低(43.2%)，多耙梭COI基因片段的GC含量最高(49.0%)。17種鯔科魚類中吻鯔、長鰭莫鯔、鯔魚等種內(nèi)GC含量差異較大。

表4 鯔科17種魚COI基因密碼子位點GC含量

2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離

采用ModeltestV 3.06版本篩選得到Kimura-2-parameter模型，利用MEGA 3.0軟件基于Kimura-2-parameter計算17種鯔科魚類的種內(nèi)和種間遺傳距離(見表5)。鯔科魚類種內(nèi)遺傳距離的平均值為0.0045，種間遺傳距離的平均值為0.191，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的42倍。本研究中鯔魚的種內(nèi)遺傳距離最大，為0.016。所有鯔科魚類種內(nèi)遺傳距離均小于2%，符合種內(nèi)遺傳距離標(biāo)準(zhǔn)[14]。17種鯔科魚類的種間遺傳距離符合物種種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)的遺傳距離，二者之間的差異大約在10倍左右的標(biāo)準(zhǔn)。遺傳距離最大的是庫里鯔和平頭莫鯔，遺傳距離為0.262。前鱗梭和大鱗梭的遺傳距離最小，為0.040。

表5 鯔科17種魚兩兩比對的種間平均遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離

2.3 鯔科魚類分類及分子系統(tǒng)樹

本研究采用MP法、NJ法、ML法和貝葉斯法，對鯔科6屬17種的72條COI基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，結(jié)果如圖1所示，4種分子系統(tǒng)樹的結(jié)果具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并都具有較高的節(jié)點支持率。從圖1和2中可知，MP、NJ、ML法構(gòu)建的鯔科魚類分子系統(tǒng)樹顯示：同一種魚的不同個體均聚集在同一分支。所有物種均為單系，隸屬于梭屬的尖頭梭與莫鯔屬聚類，表現(xiàn)出與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類不一致的結(jié)果。6屬鯔科魚類的聚類結(jié)果顯示，它們的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度依次為鯔屬、粒唇鯔屬、莫鯔屬、斧鯔屬、梭屬、劍鯔屬。由貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的結(jié)果與其他3種系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果稍有不同，除隸屬于梭屬的尖頭梭與莫鯔屬聚類外，劍鯔屬的孟加拉劍鯔與梭屬聚類也表現(xiàn)出與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類不一致的結(jié)果。此外，梭屬、劍鯔屬與鯔屬、斧鯔屬的遺傳關(guān)系相較莫鯔屬、粒唇鯔屬更近。

3 討論

本研究分析了17種鯔科魚類的COI基因序列片段，其GC含量為43.2%～49.0%，平均46.9%；其中第二密碼子位點的GC含量最高，第三密碼子GC含量最低。以上研究的結(jié)果與柳淑芳等的研究結(jié)果一致[28]。2005年有ward等[9]對澳大利亞204種魚(包括143種硬骨魚和61種軟骨魚)的COI基因序列片段GC含量的分析結(jié)果顯示，第三密碼子位點的GC含量最低。2009年彭居俐等[7]針對鯉科鲌屬4種魚類的32條COI基因序列片段的GC含量研究同樣顯示第三密碼子位點的GC含量最低。以上結(jié)果表明，線粒體基因組存在很強的GC→AT的進(jìn)化選擇壓力。

利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種分類鑒定必須滿足以下條件：其一，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上能夠檢測出物種的單系性。本研究中的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，17種鯔科魚類均為單系，且分支支持率均較高，同一種鯔科魚類的不同個體緊密的聚類在一起。其二，物種種間遺傳距離應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳距離。2003年Hebert等[29]通過研究DNA條形碼確定了基于COI進(jìn)行物種鑒定的遺傳距離臨界值，同時驗證了DNA條形碼在生物物種分類中的作用。該研究指出物種種內(nèi)遺傳距離小于1%，物種種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)的遺傳距離，二者之間的差異大約在10倍左右。本研究中17種鯔科魚類的種內(nèi)遺傳距離的平均值為0.004 5，種間遺傳距離平均值為0.191，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的42倍。由此說明COI基因序列能夠?qū)︴櫩启~類進(jìn)行有效的物種鑒定。

圖1 貝葉斯法構(gòu)建的鯔科魚類分子系統(tǒng)樹

分子系統(tǒng)樹顯示，隸屬于梭屬的尖頭梭與莫鯔屬聚類，劍鯔屬的孟加拉劍鯔與梭屬聚類，均表現(xiàn)出與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類不一致的結(jié)果。2012年Durand等[30]通過線粒體序列片段分析發(fā)現(xiàn)采自緬甸和澳大利亞北部的Lizatade存在世系的分化，繼而在2015年提出了隱存種存在的潛在可能(Durand JD等)[31]。由于樣品采集自巴基斯坦，樣品的形態(tài)學(xué)鑒定由卡拉奇大學(xué)研究人員協(xié)助完成，而分子生物學(xué)鑒定是通過與NCBI中序列比對得到的結(jié)論，所以Lizatade和Sicamugilcascasia也存在物種鑒定錯誤的可能性。關(guān)于梭屬、劍鯔屬和莫鯔屬、粒唇鯔屬的分化衍生的先后順序由貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的結(jié)果與其他三種系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果有微弱差異存在。這可能是由于基于不同的構(gòu)樹方法，序列信息量的不同會導(dǎo)致在使用線粒體某個特定的片段進(jìn)行獨立分析時不能得到一致的結(jié)論[32-34]。在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時，有時不同的方法不能得到一致的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，基于信息量較少的序列構(gòu)建的基因樹可能會與物種樹有所偏差，序列所含的信息量越多，越能夠反映物種真實的進(jìn)化情況。

綜上所述， 本研究結(jié)果表明線粒體COI基因片段不但可以作為DNA條形碼用于鯔科魚類的物種鑒定，同時也可以用于鯔科魚類種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的輔助探討。

致謝：感謝中國海洋大學(xué)肖家光、周偉在數(shù)據(jù)分析中提供的幫助；集美大學(xué)黃良敏老師、國家海洋局第三研究所李淵博士、防城港市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局紀(jì)東平博士、大連市水產(chǎn)研究所閆龍、中國海洋大學(xué)單斌斌幫助采集樣品。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Application of DNA Barcoding in Classification of Mugilidae Fishes

LIU Lu1, SUN Dian-Rong2, LI Chun-Hou2, HAN Zhi-Qiang3, GAO Tian-Xiang3,SHEN Kang-Ning4, SONG Na1

(1.College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 3.Fishery College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 4.Center of Excellence for the Oceans, National Taiwan Ocean University, Keelung 20224, China)

A total of 72 individuals from 17 species pertaining to 6 genera of Mugilidae were barcoded with COI gene which were sequenced and compared with each other. Our results indicated that the average GC content of the gene accounted for 46.9%. The GC content of codons was 42.9% (31.9%～48.6%) at the firstnucleotide position, 54.9% (49.8%～56.2%) at the second, and 42.7% (42.5%～ 43.4%) at the third. The average Kimura-2-parameter (K2P) distances within-species and pairwise-species were 0.45% and 19.1%, respectively. The K2P distance of pairwise-species was 42 times of that within-species. According to the maximum parsimony and neighbor-joining trees for all 72 sequences, 17 species, all individuals of each species formed a strong monophyletic group. However,Lizatadebelonging toLizagenera clustered withMologardagenera, which was different from the morphological characters. Our research demonstrated that the COI barcoding was a useful tool for fish species identification, which may also afford auxiliary discussions about the phylogeny of Family Mugilidae

Mugilidae; COI genes; DNA barcoding; species classification; phylogeny

國家自然科學(xué)基金項目(41506158)；農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室開放基金課題(LSF2014-02)；海洋公益性行業(yè)科研專項(201305043,201405010,201303050)資助

2016-07-28；

2016-09-13

劉 璐(1988-)，女，博士生，從事漁業(yè)生態(tài)學(xué)研究。E-mail：liulouc@163.com

** 通訊作者：E-mail：songna624@163.com

S931

A

1672-5174(2016)11-178-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20160270

劉璐， 孫典榮， 李純厚， 等. DNA條形碼技術(shù)在鯔科魚類鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 46(11)： 178-186.

LIU Lu, SUN Dian-Rong, LI Chun-Hou, et al. Application of DNA barcoding in classification of mugilidae fishes[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(11)： 178-186.

Supported by National Natural Science Foundation of China(41506158)；Key Laboratory for Exploitation & Utilization of Marine Fisheries Resource in South China Sea, Ministry of Agriculture(LSF2014-02)；the Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean(201305043,201405010,201303050)