伍潔

[摘要] 目的 研究結(jié)直腸癌組織與靜脈血中KRAS基因突變情況，探討其對臨床治療及預后的意義。 方法 整群收集2013年1月—2014年12月經(jīng)病理科診斷手術(shù)的129例原發(fā)結(jié)直腸癌組織標本和肘靜脈血5 mL及60例癌旁正常組織對照。用PCR-DNA直接測序法檢測KRAS突變情況。 結(jié)果 ①癌組織KRAS突變率為39.53%（51/129），靜脈血KRAS突變率為32.56 %（42/129）。靜脈血KRAS基因突變率比癌組織的低6.97%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。癌旁正常組織無基因突變。②KRAS基因有7種突變類型， 12密碼子為主要突變占78.43%（40/51）。③癌組織與靜脈血野生型與突變型整體的一致率為89.92%（116/129），一致性較高（K=0.783）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌組織KRAS基因突變與靜脈血高度一致，在腫瘤組織無法獲取的情況下能代替其作為檢測靶點。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；KRAS基因；突變；靜脈血

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）02（a）-0051-03

Analysis and Clinical Significance of KRAS Mutations in the Colorectal Carcinoma and Venous Blood

WU Jie

Mudanjiang Second People's Hospital，157000 China

[Abstract] Objective To research the KRAS mutations in the colorectal carcinoma and venous blood and discuss the significance of it to the clinical treatment and prognosis. Methods 129 cases of primary colorectal carcinoma specimen receiving the diagnostic operation in the department of pathology from January 2013 to December 2014 and 5ml elbow vein blood were collected and 60 cases of adjacent normal tissues were collected as controls， KRAS mutations were detected by PCR-DNA direct sequencing method. Results 1.The KRAS mutation rate was 39.53%（51/129） in the cancer tissues and 32.56 %（42/129） in the venous blood， the KRAS mutation rate in the venous blood was 6.97% lower than that in the cancer tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）， and there was no mutation in adjacent normal tissues. 2.there were 7 types of mutations in the KRAS gene， 12 codons were the main mutation， accounting for 78.43%（40/51）. 3.the concordance rate between cancer tissues and venous blood of wild type and mutant type was 89.92%（116/129）， and it was higher （K=0.783）. Conclusion The KRAS mutation in the colorectal carcinoma is highly consistent with that in the venous blood， and it can be used as the detection target instead in the case of the tumor tissues unavailable.

[Key words] Colorectal cancer； KRAS gene； Mutation； Venous blood

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)生發(fā)展是一個復雜多基因信號通路激活的過程，它的惡性進展機制尚未完全清楚。EGFR基因在60%～75%的結(jié)腸癌患者中高表達，隨著抗EGFR靶向藥物臨床廣泛應用，有效降低患者死亡率同時也提高生存質(zhì)量。原癌基因KRAS是下游重要細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導因子，相關(guān)臨床試驗證實KRAS突變型的患者不能從抗治療中獲益，KRAS基因狀態(tài)可決定患者治療方案、臨床耐藥及預后[1]?；驒z測是個體化治療的基礎，由于腫瘤組織的獲取是有創(chuàng)性操作，對不能耐受手術(shù)無法活檢的患者來說，意味無法準確施制個體化治療方案。隨著藥物治療原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶基因狀態(tài)也可能會發(fā)生改變，臨床治療需要既方便獲取又能夠?qū)崟r反映機體狀態(tài)的靶標[2]。該研究分析該院2013年1月—2014年12月129例結(jié)腸癌患者癌組織和靜脈血的KRAS基因突變情況，探討靜脈血替代癌組織進行基因檢測的可行性及其對臨床治療和預后的意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群收集該院129例原發(fā)結(jié)腸癌經(jīng)病理診斷手術(shù)切除的石蠟標本及60例癌旁正常組織對照，取患者術(shù)前空腹肘靜脈血5 mL，離心后取上層血漿，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｄ行?2例，女性57例；年齡21～76歲，平均（48.9±10.1）歲。入選患者術(shù)前均未行任何治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 血漿DNA提取 DNA抽提試劑盒（純化柱式）購自碧云天生物技術(shù)研究所。復溫后向Ep管中加入PBS緩沖溶液渦旋搖散沉淀至絮狀，加蛋白酶K、裂解液B渦旋混勻，置于70 ℃恒溫箱中10 min后加無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入DNA純化柱中置于廢液收集管上離心。向純化柱內(nèi)先后加入洗滌液Ⅰ、Ⅱ及空離一次水浴后。將DNA純化柱轉(zhuǎn)入標記好的Ep管中放入-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 組織DNA提取 采用碧云天生物技術(shù)公司的DNA提取試劑盒。對組織標本切8 μm厚10張，切取4 μm厚1張HE染色鏡下觀察腫瘤細胞集中區(qū)域，將切片對應歸入EP管中脫蠟醇化，加入裂解液55 ℃水浴過夜，蛋白酶K消化，沉淀洗鹽，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，取樣本行純度測定稀釋后行PCR檢測。

1.2.3 PCR擴增純化 由上海碧云天生物技術(shù)有限公司利用軟件Premier 5.0設計PCR引物序列如下：KRAS基因第2號外顯子：上游引物5-GTCGATATAGTTTGTAAATGAAGT-3下游引物5-CAGCTAAATTAAACATTTACTTC-3擴增片段長度為178 bp。PCR反應體系50 μL，反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；降至4℃結(jié)束反應。于美國BIO-RAD580BR PCR儀器上進行基因擴增。用純化試劑盒將PCR產(chǎn)物純化。取5 μL PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)溴化乙啶染色，紫外燈下照相存盤。紫外凝膠分析成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并打印。

1.2.4 DNA分子直接測序 將檢測有單一條帶的樣本送上海生物公司采用PCR-DNA直接測序法測序，經(jīng)人工校對記錄后用DNAMAN6.0軟件與基因庫BRAF基因序列比較結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用（n，%）表示，采用χ2檢驗，應用Kapparel方法統(tǒng)計一致性。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變情況

癌組織中KRAS基因突變率為39.53%（51/129）。靜脈血中突變率為32.56 %（42/129）。癌組織較靜脈血的突變率高9例6.97%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.92，P=0.027，P<0.05） 。60例癌旁正常腸組織無一例突變。

2.2 KRAS基因突變類型

突變類型有7種，主要為2號外顯子突變。G12D、G13D常見。12密碼子為主要突變占78.94%（40/51），其中G12D突變18例占35.29%最高。見表1。

表1 結(jié)直腸癌KRAS基因2號外顯子突變類型

2.3 癌組織與靜脈血基因檢測結(jié)果比較

癌組織與靜脈血的突變檢測結(jié)果同時存在突變的有40例，以癌組織中檢測的KRAS狀態(tài)為準一致率78.43%（40/51），野生與突變整體的一致率為89.92%（116/129），一致性較高（Kappa=0.783）。見表2。

表2 癌組織與血漿KRAS基因突變分析

3 討論

KRAS突變?yōu)槟[瘤特異性的體細胞遺傳改變，在正常細胞中無KRAS突變，腫瘤細胞的標志物也可能隨著有效治療發(fā)生改變，同時疾病進展腫瘤細胞的分化增殖是個動態(tài)的過程[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤在發(fā)展過程中細胞從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血，然后瘤細胞發(fā)生凋亡壞死并釋放出遺傳物質(zhì)，導致血中存在游離腫瘤DNA，我們即可從血液中檢測出基因突變[4]。

該研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變?yōu)?9.53%（51/129）。結(jié)果與文獻[5-7]報道的30%～50%數(shù)據(jù)相符。外周血和腫瘤組織檢測KRAS基因突變一致性達88.37%（114/129），馬文華等人[6]檢測48例CRC患者癌組織和血液KRAS基因突變一致率達73.7%，王建新等人[7]檢測42例CRC患者癌組織和血漿KRAS基因突變一致率高達95.2%，為靜脈血代替腫瘤組織檢測KRAS突變提供了依據(jù)。有數(shù)據(jù)顯示[5-8]KRAS基因突變率隨著患者臨床分期增高，KRAS基因突變率亦顯著升高，提示有突變的患者更容易病情進展發(fā)生轉(zhuǎn)移預后不良。密切觀察患者病情進展情況，隨訪同時加強監(jiān)測KRAS基因狀態(tài)，為評價KRAS在預測轉(zhuǎn)移及腫瘤進展的作用提供線索，并能基于血液檢測基因突變情況開展靶向治療研究，為有效干預結(jié)直腸癌的發(fā)病，降低患者死亡率提供理論依據(jù)。這也是我們今后研究的重要內(nèi)容。

綜上所述， 結(jié)直腸癌患者KRAS基因狀態(tài)可以預測靶向藥物療效及預后，指導制定治療方案，提高靶向治療效果。結(jié)合文獻該研究認為靜脈血KRAS突變和癌組織突變檢測率高度一致，標本容易獲取，創(chuàng)傷較小適合臨床治療需求，患者在無法獲取病理組織標本或樣本量不足時能代替腫瘤組織實時監(jiān)測KRAS基因突變情況，臨床規(guī)范檢測方法以提高結(jié)腸癌的早期診斷率及指導臨床治療，以實現(xiàn)患者的個體化治療。

[參考文獻]

[1] 涂金花，余英豪.基因突變與結(jié)直腸癌靶向治療新進展[J].世界華人消化雜志，2012，20（16）：1447-1452.

[2] 范少安，袁軼偉，趙新泰.中國人結(jié)直腸癌454 例K-ras基因突變狀態(tài)分析[J].腫瘤，2013，33（4）：355-360.

[3] 陳慧娟，李洪波，李碩敏，等.KRAS基因突變與結(jié)直腸癌的關(guān)系[J].腫瘤研究與臨床，2010（22）：461-463.

[4] Morgan S R， Whiteley J， Donald E， et al .Comparison of KRAS mutation assessment in tumor DNA and circulating free DNA in plasma and serum samples[J].Clin Med Insights Pathol，2012，5（1）：15-22.

[5] 徐晨，劉亞嵐，黃潔，等.結(jié)直腸腺癌KRAS基因突變的檢測及其臨床意義[J].中華病理學雜志，2012，41（10）：667-670.

[6] 馬文華，李娜，趙利平，等.結(jié)直腸癌組織與血液KRAS/BRAF基因突變表達一致性檢測分析[J].河北醫(yī)藥，2014， 36（7）：1048-1050.

[7] 王建新，呂艷鋒，丁克，等.結(jié)直腸癌患者血漿K-ras基因突變情況分析[J].山東醫(yī)藥，2008，48（30）：76-77.

[8] 涂露霞，萬紅萍，熊磊，等.結(jié)直腸癌BRAF和K-ras基因狀態(tài)及其病理意義[J].廣東醫(yī)學，2014，35（21）：3368-3371.

（收稿日期：2015-11-03）