王玉林，夏方亮

(濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,山東 濱州 256600)

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高效液相色譜法測定天杞補(bǔ)腎膠囊中馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

王玉林，夏方亮

(濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,山東 濱州 256600)

目的 建立高效液相色譜法(HPLC)測定天杞補(bǔ)腎膠囊中馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定方法。方法 用 C18柱為固定相，以甲醇-水(42∶58)為流動相，檢測波長為240 nm。結(jié)果 馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素分別在5.06～126.5、0.527 5～13.187 0、0.480 8～12.020 0 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2分別為1.000、1.000、1.000(n=6)，其平均回收率分別為98.93%，100.09%和98.97%。 結(jié)論 該方法具有較高的準(zhǔn)確性和專屬性。

天杞補(bǔ)腎膠囊；馬錢苷；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素

天杞補(bǔ)腎膠囊由哈爾濱同一堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，處方中有淫羊藿、陽起石、補(bǔ)骨脂、山茱萸、枸杞子等多味中藥材，臨床用于腎陰陽兩虛，癥見腰膝酸軟、頭暈耳鳴，倦怠乏力等。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法測定淫羊藿苷的含量，只能對處方中的淫羊藿進(jìn)行質(zhì)量控制，為提高本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增強(qiáng)對處方中其他藥材的質(zhì)控力度，本研究采用高效液相色譜法測定處方中山茱萸主要成分馬錢苷和補(bǔ)骨脂主要成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量，可作為原標(biāo)準(zhǔn)的有效補(bǔ)充。馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素能很好分離，理論板數(shù)較高，處方中的其他藥材成分無干擾，回收率高。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，Prominence SPD-20A/UV-VIS檢測器；天杞補(bǔ)腎膠囊為哈爾濱同一堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號04140402、04140409、04140512；馬錢苷對照品(批號111640-200604，純度為100.0%)、補(bǔ)骨脂素對照品(批號110739-201416，純度為99.9%)、異補(bǔ)骨脂素對照品(批號110738-201313，純度為100.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)，水為純化水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特Sinochrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(42∶58)[1-3]；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：240 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷對照品25.3 mg置50 mL量瓶中、補(bǔ)骨脂素對照品13.20 mg置250 mL量瓶中、異補(bǔ)骨脂素對照品12.02 mg置250 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取三份對照品貯備液各1 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例配制不含山茱萸或補(bǔ)骨脂的樣品，同“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取“2.2.1對照品溶液”、“2.2.2 供試品溶液”和“2.2.3 陰性樣品溶液”，按“2.1 色譜條件”進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素具有較高的分離度和理論板數(shù)，馬錢苷保留時(shí)間約為10.8 min，理論板數(shù)高于25 000，補(bǔ)骨脂素保留時(shí)間約為23.0 min，理論板數(shù)高于20 000，異補(bǔ)骨脂素保留時(shí)間約為26.7 min，理論板數(shù)高于22 000。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品貯備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，進(jìn)樣量10 μL，以馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程分別為：馬錢苷：Y= 8512.1X-1074.7,R2=1.000(n=6);補(bǔ)骨脂素：Y= 81855X-1652,R2=1.000(n=6);異補(bǔ)骨脂素：Y=77279X-856.64,R2=1.000(n=6)。結(jié)果表明，馬錢苷濃度在5.06～126.50 mg·L-1、補(bǔ)骨脂素濃度在0.527 5～13.187 0 mg·L-1、異補(bǔ)骨脂素濃度在0.480 8～12.020 0 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，記錄馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的峰面積，RSD分別為0.07%、0.05%、0.05%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1色譜條件”分別于0、3、6、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的峰面積，RSD分別為0.16%、0.25%、0.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取批號為04140402的天杞補(bǔ)腎膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.8 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1色譜條件”測定馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均含量并計(jì)算RSD，結(jié)果為：馬錢苷平均含量2.751 mg·g-1，RSD為0.22%；補(bǔ)骨脂素平均含量0.291 6 mg·g-1，RSD為0.12%；異補(bǔ)骨脂素平均含量0.328 9 mg·g-1，RSD為0.21%。

A.對照品

B.供試品

C.陰性樣品1(缺山茱萸)

D.陰性樣品2(缺補(bǔ)骨脂)

注：1：馬錢苷;2：補(bǔ)骨脂素;3：異補(bǔ)骨脂素。

圖1 天杞補(bǔ)腎膠囊HPLC圖

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的天杞補(bǔ)腎膠囊(馬錢苷含量2.751 mg·g-1，補(bǔ)骨脂素含量0.2916 mg·g-1，異補(bǔ)骨脂素含量0.328 9 mg·g-1)6份，每份約0.4 g，精密稱定，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下馬錢苷對照品貯備液2 mL、補(bǔ)骨脂素對照品貯備液2 mL、異補(bǔ)骨脂素對照品貯備液3 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備得濃度約為樣品濃度100%的供試品溶液，按上述方法測定馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～3。

表1 天杞補(bǔ)腎膠囊中馬錢苷加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 天杞補(bǔ)腎膠囊中補(bǔ)骨脂素加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 天杞補(bǔ)腎膠囊中異補(bǔ)骨脂素加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批4份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件對本品進(jìn)行含量測定，計(jì)算平均含量和RSD，結(jié)果見表4。

表4 天杞補(bǔ)腎膠囊中馬錢苷、補(bǔ)骨脂素

2.10 檢測限(LOD)與定量限(LOQ) 取“2.2.1”項(xiàng)下馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的對照品貯備液，稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)樣測定，以信噪比3∶1計(jì)算馬錢苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的檢測限分別為0.253、0.132、0.120 ng；以信噪比10∶1計(jì)算定量限分別為1.012、0.396、0.481 ng。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 將三種對照品貯備液用甲醇稀釋后進(jìn)行紫外圖譜掃描，馬錢苷在238 nm波長處有最大吸收，補(bǔ)骨脂素在246 nm和294 nm波長處有最大吸收，在327 nm處有一肩峰，異補(bǔ)骨脂素在247 nm和300 nm波長處有最大吸收，為提高定量的準(zhǔn)確性，提高回收率，本文選用三種成分均響應(yīng)較高的240 nm作為檢測波長，試驗(yàn)取得了令人滿意的結(jié)果。

3.2 流動相和色譜柱的選擇 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素測定流動相多用甲醇-水[4-5]或乙腈-水[6]，馬錢苷多用乙腈-水[7-8]，也有文獻(xiàn)采用四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液[9]和甲醇-磷酸鹽緩沖液[10]，本研究經(jīng)試驗(yàn)篩選，采用C18柱為固定相和甲醇-水為流動相對三種成分分離最好，保留時(shí)間適宜，理論板數(shù)較高且經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

3.3 提取方法的選擇 在提取方式上，本研究嘗試了回流[8]、超聲[4-6]等，并考察了回流時(shí)間和超聲時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流和超聲的測定結(jié)果無明顯差異，當(dāng)超聲時(shí)間小于20 min時(shí)，三種成分含量測定結(jié)果均偏低，超聲30 min以上含量較高且穩(wěn)定，故本文的提取方法定為超聲30 min。

3.4 耐用性 分別用兩根色譜柱依利特Sinochrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)在兩臺高效液相色譜儀(日本島津LC-20AT、美國Agilent1260)上進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察，試驗(yàn)結(jié)果表明，上述兩種色譜柱和兩個(gè)型號的高效液相色譜儀均可取得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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Determination of loganin,psoralen and isopsoralen in tianqibushen capsules by HPLC

WANG Yulin,XIA Fangliang

(FoodandDrugInspectionandTestingCenter,Binzhou,Shandong256600,China)

Objective To establish a method for the determination of Loganin,Psoralen and Isopsoralen in Tianqibushen Capsules by HPLC.Methods The C18column was used,the mobile phase was methanol-water(42∶58),and the detection wavelength was 240 nm.Results The standard curves of Loganin,Psoralen and Isopsoralen were linear in the ranges of 5.06～126.5 mg·L-1(R2=1.000,n=6),0.527 5～13.187 0 mg·L-1(R2=1.000,n=6) and 0.480 8～12.020 0 mg·L-1(R2=1.000,n=6) respectively,and the average recoveries were 98.93%，100.09% and 98.97%.Conclusion The method is highly accurate and specific.

Tianqibushen capsule;Loganin;Psoralen;Isopsoralen

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.013

2016-05-06，

2016-08-01)