周丹+++崔曉嫻+++孫淑惠++蔣琳+++榮星喻+++汪慧菁+++趙超+++史虹莉

[摘要]目的 建立一種評價PBMC基因組DNA制備質(zhì)量的簡便有效的方法。方法 本研究采用實時定量PCR技術(shù)，對樣本中的單拷貝基因36B4進行擴增，以考察擴增效率與樣品質(zhì)量之間的關(guān)系。結(jié)果 經(jīng)DNase Ⅰ處理的基因組DNA中的36B4擴增效率顯著低于未處理樣品。采用該方法，對18份健康志愿者的血液標本基因組樣品進行檢測分析，結(jié)果顯示，其可以有效地評估血液標本基因組制備質(zhì)量。結(jié)論 該方法可用于評價健康體檢標本采集中的流程和操作對體檢的影響，提高涉及基因組DNA檢測體檢項目的準確性。

[關(guān)鍵詞]單拷貝基因；基因組DNA；血液標本；定量PCR

[中圖分類號] R-331 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（a）-0004-04

[Abstract]Objective To establish a simple and effective method for evaluating the preparation quality of the genomic DNA from PBMC.Methods In this study，real-time quantitative PCR technique was used to amplify the single copy gene 36B4 in a sample to investigate the relationship between the amplification efficiency and the quality of samples.Results The amplification efficiency of 36B4 in the genomic DNA treated by DNase Ⅰ was significantly lower than that of the untreated sample.By using this method，the blood samples from 18 healthy volunteers were detected and analyzed，the results showed that the preparation quality of blood sample genome was effectively evaluated.Conclusion The method can be used to evaluate the influence of the process and operation on the physical examination in the sample collection of health examination，and to improve the accuracy of the test item of the genomic DNA.

[Key words]Single-copy gene；Genomic DNA；Blood sample；Quantitative PCR

細胞基因組DNA含有重要的遺傳信息，通過檢測基因組的DNA序列、拷貝數(shù)等信息，可提供細胞遺傳和病理的信息，其被廣泛應(yīng)用于遺傳病、腫瘤和衰老等諸多領(lǐng)域。隨著精準醫(yī)學的廣泛應(yīng)用，基因組DNA需求也越來越多[1]。制備好的基因組DNA相對較穩(wěn)定，可長期存放用于相關(guān)研究。細胞采集、運輸、保存到基因組制備操作過程等多個環(huán)節(jié)可影響DNA制備的質(zhì)量，從而可能對后續(xù)檢測，特別是定量檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

評估基因組質(zhì)量可為后續(xù)檢測提供良好保障，常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳方法可比較直觀地觀察DNA的降解情況，但敏感度較差。利用DNA在紫外波長區(qū)的吸光度（OD），測定OD260與OD280比值，可以判定DNA的純度，利用OD260讀數(shù)，可以較精確地定量DNA含量，但是由OD260的讀數(shù)計算所得的基因組DNA含量包含了降解的DNA片段，并不能很好地反映基因組的質(zhì)量。

基因組中含有單拷貝的基因，其與基因組DNA含量有較高的一致性，在基因組降解時，單拷貝的基因也相應(yīng)降解。通過實時定量PCR技術(shù)檢測單拷貝基因擴增效率，可以反映基因組降解情況，能夠被用來作為評估基因組DNA質(zhì)量的方法。本研究選取編碼酸性核糖體磷酸蛋白PO的36B4基因為目的基因進行擴增[2]，可有效評估制備的基因組DNA的質(zhì)量。

1材料與方法

1.1全血基因組DNA制備

采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒（Qiagen公司，Lot No.148030300）抽提EDTA抗凝全血中外周血單核淋巴細胞（PBMC）的基因組DNA，方法見操作說明。簡要過程：20 μl蛋白酶K消化液加入溶解于200 μl PBS的PBMC細胞懸液，56℃恒溫水浴鍋中消化10 min，加入200 μl無水乙醇充分混勻后過柱，再分別用500 μl AW1和AW2洗滌1次，晾干后用100 μl超純水溶解DNA。

1.2 DNase Ⅰ處理DNA樣品

取Takara公司DNA酶Deoxyribonuclease Ⅰ（DNase Ⅰ，Lot No.CE5301A）0.7 U加入1 μg DNA樣品，25℃孵育，分別處理1、5、15 min，處理后經(jīng)Qiagen DNA純化試劑盒純化回收。

1.3分光光度儀定量DNA含量

采用Epoch微孔板分光光度計（BioTek公司）對基因組DNA進行定量，并讀取OD260/OD280讀數(shù)，以評估DNA純度，并對DNA進行定量。

1.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳

采用1%瓊脂糖凝膠電泳，每孔上樣量200 ng，條件為100 V恒壓，45 min，經(jīng)復日科技凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Takara公司DL5000（M5 kb）、DL15000（M15 kb）DNA marker作為分子量參照。

1.5實時定量PCR檢測

PCR體系的組成：150 nmol/L 6-ROX，0.2×Sybr Green Ⅰ，15 nmol/L Tris-HCl（pH=8.0），50 nmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，dNTP各0.2 mmol/L，5 mmol/L DTT，1% DMSO以及1.25 U GoTaq Gold DNA 多聚酶（Promega公司）[3]?；蚪MDNA模板40 ng，引物濃度0.5 μmol/L，反應(yīng)體系體積20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，58℃延伸1 min（35個循環(huán)）。標準曲線為一份抽提的基因組DNA按照梯度稀釋，最高濃度42 ng，依次按照1.68倍等比稀釋。

引物由生工生物工程上海有限公司合成，序列[4]如下：

36B4u，CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC；

36B4d，CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。

2結(jié)果

2.1瓊脂糖凝膠電泳較難分辨降解條帶

經(jīng)DNA酶（DNase Ⅰ）處理的基因組DNA很快被降解成小片段。瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1A）可以看到，在同樣上樣量條件下，基因組DNA主條帶含量下降，但并未見到明顯的拖尾現(xiàn)象。同樣，未被及時處理的抗凝血標本中，也發(fā)現(xiàn)在同樣上樣量條件下，基因組DNA主條帶含量下降，而并未見到明顯的拖尾現(xiàn)象。原因在于DNA被降解成過小片段，加之凝膠成像分辨率有限，難以被該方法顯示出來（圖1B）。

M15 kb和M5 kb分別為分子量參照。A中為基因組DNA未經(jīng)DNase Ⅰ處理和分別處理1 min（D1）、5 min（D5）和15 min（D15）的電泳圖。B為同一份血清立刻抽提（G1）、4℃冷藏放置24 h（G2）和室溫放置24 h（G3）后抽提的基因組DNA

2.2利用實時定量PCR法擴增標本中的34B4基因可評估DNA質(zhì)量

借助標準曲線，實時定量PCR法可對樣本中的目的基因進行定量，敏感度較高。利用該技術(shù)擴增標本中的34B4基因，可以反映出完整的基因組DNA的含量，用此數(shù)據(jù)能夠評估DNA質(zhì)量高低。對來自同一份健康志愿者的抗凝血在不同條件下抽提，或加DNase Ⅰ處理后，在同樣條件下進行擴增，繪制閾值循環(huán)數(shù)（Ct）-濃度（以2為底的對數(shù)值）曲線（圖2）。結(jié)果顯示，立刻抽提組（G1）的擴增效率最高，經(jīng)DNase Ⅰ處理的基因組DNA的Ct值明顯升高（D1和D5），而D15組已不能有效擴增出目的基因。相對于G1組，4℃冷藏放置24 h（G2）和室溫放置24 h（G3）后抽提組的Ct值增加，提示擴增效率降低，DNA發(fā)生降解。這說明該方法可靈敏地分辨出基因組DNA的降解情況，進而評估DNA質(zhì)量。

G1、G2、G3、D1、D5和D15組PCR檢測起始上樣量均為40 ng，Ct值依次升高，D15組未能檢測出。橫坐標為DNA含量單位納克（ng），以Log2數(shù)值顯示，縱坐標為閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）

2.3在實際樣本中34B4基因擴增效率反映基因組DNA制備質(zhì)量

選取18份健康志愿者抗凝血，抽提基因組DNA，利用定量PCR擴增34B4基因，繪制閾值循環(huán)數(shù)（Ct）-濃度（以2為底的對數(shù)值）曲線（圖3）。結(jié)果顯示，13份標本較好地符合標準曲線，5份產(chǎn)生偏離，提示不同的標本基因組DNA質(zhì)量存在差異。該方法適用于臨床實際標本的評估。

3討論

隨著精準醫(yī)學在健康管理中的應(yīng)用，越來越多的基因組DNA標本被用于研究[5-7]?；蚪M的質(zhì)量受多個環(huán)節(jié)影響，包括樣本采集、運輸、儲存、后續(xù)制備等。對DNA質(zhì)量進行科學靈敏的評估，能夠?qū)颖咎幚憝h(huán)節(jié)的影響進行評價，進而發(fā)現(xiàn)影響樣本質(zhì)量的因素，促進樣本處理方法的改進，因此，開發(fā)簡單有效的評估方法顯得尤為重要。基因組DNA以雙鏈纏繞組蛋白的形式形成染色體，存在于細胞核內(nèi)?；蚪MDNA制備過程中，需裂解細胞膜和細胞核膜，去除蛋白質(zhì)和RNA干擾[8]?；蚪MDNA分子量大，易受機械剪切影響，因此，樣本取放時應(yīng)該格外注意[9-10]?；蚪MDNA樣品也受多因素影響，包括儲運條件、反復凍融、標本污染等，所以，標準化的流程和全程的管理并配合簡便易行的評估手段是保障后續(xù)實驗成功的必要條件。

單拷貝基因含量在基因組中穩(wěn)定，與完整的基因組含量成正比。當基因組DNA受損后，單拷貝基因也會隨機被降解，導致其擴增效率低于完整基因組DNA。實時定量PCR結(jié)果顯示，其擴增的Ct值變大[11]。本研究結(jié)果顯示，長時間放置的抗凝血標本擴增效率降低，而瓊脂糖凝膠電泳圖中未見明顯降解條帶，原因是由于后者的分辨率不足。利用DNase Ⅰ處理基因組DNA，作為降解的陽性對照，通過瓊脂糖凝膠電泳明顯可見DNA降解圖形，對應(yīng)的PCR擴增效率明顯降低，并且與凝膠結(jié)果正相關(guān)，這說明該方法是一種靈敏可靠的評估DNA降解的方法。目前常用的可供選擇的單拷貝基因有36B4、β-globin等[12-13]。本研究也發(fā)現(xiàn)利用不同單拷貝基因擴增對應(yīng)的評估效果類似。

實時定量PCR法用于目的基因的擴增，具有線性范圍廣、重復性好、易于批量化等優(yōu)點，適合在臨床科室中推廣應(yīng)用。目前，很多醫(yī)院檢驗科和中心實驗室已經(jīng)配備實時定量PCR儀，所以該方法的可移植性好。而其缺點同一般PCR（如易污染，過于靈敏）類似，但可以通過嚴格規(guī)范操作程序和采用復孔等方法避免[14]。

本方法可以作為評估基因組DNA質(zhì)量的簡單可靠的方法，具有便捷可靠的特點，易于在健康管理和臨床實踐中推廣使用，特別是對基因組DNA質(zhì)量要求較高的研究，如基因拷貝數(shù)、端粒檢測等[15-16]。

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（收稿日期：2016-07-19 本文編輯：祁海文）