趙強(qiáng) 周立英 賴紅梅 馬麗 彭輝

乙醇攝入對乙醛脫氫酶2不同基因型小鼠急性心肌梗死及DNA氧化損傷的影響

趙強(qiáng) 周立英 賴紅梅 馬麗 彭輝

目的 探討大劑量乙醇攝入對乙醛脫氫酶2（ALDH2）不同基因型小鼠急性心肌梗死及DNA氧化損傷的影響。方法將23只ALDH2基因敲除型（KO）和19只野生型（WT）小鼠隨機(jī)分為4組：KO組11只，KO+乙醇（E）組12只，WT組9只，WT+E組10只，其中KO+E組及WT+E組經(jīng)口灌胃大劑量乙醇[2g/（kg·d），連續(xù)8d]，而KO組及WT組每日經(jīng)口予以等量0.9%氯化鈉溶液連續(xù)8d。所有小鼠均制備急性心肌梗死模型，建模4周后經(jīng)超聲診斷儀檢測心功能，采用伊文藍(lán)顏料測定心肌梗死面積，ELISA法測定心肌8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）水平。結(jié)果 （1）急性心肌梗死造模后4周，KO組、KO+E組、WT組、WT+E組小鼠存活數(shù)量分別為7、8、7、7只，病死率分別為18.2%、33.3%、22.2%、30.0%，4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）WT組小鼠左室短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)均高于KO組小鼠，4組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。（3）心肌梗死面積由大至小依次為：KO+E組＞KO組＞W(wǎng)T+E組＞W(wǎng)T組，4組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。（4）心肌8-OHdG水平由高至低依次為：KO+E組＞KO組＞W(wǎng)T+E組＞W(wǎng)T組，4組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 增強(qiáng)ALDH2表達(dá)可有效地拮抗大劑量乙醇攝入對急性心肌梗死的損害作用，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與減輕心肌細(xì)胞DNA氧化損傷有關(guān)。

乙醛脫氫酶2 急性心肌梗死 心功能 DNA氧化損傷

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是在某些誘因作用下冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致冠狀動脈完全或不完全閉塞，引起的心肌缺血壞死現(xiàn)象，其病死率高、預(yù)后差，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1-2]。冠心病家族史、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒等已被公認(rèn)為AMI的危險(xiǎn)因素。其中，大劑量乙醇攝入可明顯增加冠心病的發(fā)病率及病死率[3]。乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenases-2，ALDH2）是哺乳動物體內(nèi)代謝乙醇的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2表達(dá)缺乏可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，而增強(qiáng)ALDH2表達(dá)則可對抗心力衰竭的發(fā)生和心功能的降低[4]。因此，ALDH2在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。然而，ALDH2具有高度遺傳多態(tài)性，隨編碼基因不同，其活性亦不同，從而影響乙醇及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的作用效果。本研究通過對ALDH2不同基因型的小鼠實(shí)施大劑量乙醇干預(yù)，觀察小鼠心肌梗死面積、心肌梗死后的心功能及8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）水平，探討大劑量乙醇攝入對ALDH2不同基因型小鼠AMI及DNA氧化損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 23只ALDH2基因敲除型（KO）及19只野生型（WT）小鼠均由日本大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，為8～12周齡C57BL/6雄性小鼠。主要試劑：DNA ExtractorTIS Kit（日本W(wǎng)ako公司，貨號296-67701），核酸酶P1（美國Sigma公司，貨號N8630），堿性磷酸酶（美國Sigma公司，貨號1197075001），8-羥基脫氧鳥苷ELISA試劑盒（美國OXIS公司，貨號21026）等。主要儀器：小動物高分辨率超聲系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司），倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）、酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司），小動物呼吸機(jī)（中國青松生物醫(yī)學(xué)儀器有限公司），冰凍切片機(jī)（德國Leica公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng) 小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，室溫22～25℃，濕度50%～60%，光照控制12h明/12h暗，顆粒飼料購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及乙醇干預(yù) 將小鼠隨機(jī)分為4組，即KO組11只、KO+乙醇（E）組12只、WT組9只、WT+E組10只，KO+E組、WT+E組小鼠均經(jīng)口灌胃施以大劑量乙醇造成亞急性的乙醇中毒，具體劑量：乙醇2g/（kg· d），1次/d，連用8d[5]，KO組、WT組每日經(jīng)口給予等量的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)8d。

1.2.3 小鼠AMI模型制備 小鼠用乙醚麻醉后固定，置于4×10放大倍數(shù)的倒置顯微鏡下。予氣管插管，用呼吸機(jī)維持呼吸，其間用乙醚維持麻醉狀態(tài)。乙醇消毒皮膚，自頸正中切開，斷2、3肋骨，充分暴露主動脈和心臟。用眼科纖維手術(shù)鑷子撕開心包膜，充分暴露心臟左室前壁，在肺動脈圓錐和左心耳交界處，略靠近左心耳下方分離左冠狀動脈前降支，穿10號醫(yī)用縫合線結(jié)扎。術(shù)后正常飲食，每日定時(shí)觀察。

1.2.4 心功能檢測 術(shù)后4周乙醚麻醉小鼠，將其仰臥位固定，用小動物高分辨率超聲診斷儀行超聲檢查。在二維切面上顯示胸骨旁左心長軸，用M型超聲心動圖法分別測量左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。超聲檢測儀所用參數(shù)均相同，每個數(shù)據(jù)測量5個不同的心動周期取其平均值。

1.2.5 心肌梗死面積測定 術(shù)后4周時(shí)乙醚麻醉小鼠，將20g/L的伊文藍(lán)顏料經(jīng)主動脈逆行灌注左心室腔。摘取心臟，沖洗染料，制備左心室切片（厚度2mm），用含10g/L四氮唑的磷酸鹽緩沖液染色20min，以10%的甲醛溶液固定1d，根據(jù)顏色不同區(qū)分各區(qū)域。藍(lán)色為正常心肌，紅色為缺血心肌，灰白色為梗死心肌。掃描儀掃描染色的心臟切片。使用Image-Pro Plus圖像軟件測量相關(guān)區(qū)域面積，計(jì)算心肌組織梗死率，心肌組織梗死率=灰白色梗死區(qū)面積/（紅色缺血區(qū)+灰白色梗死區(qū)）×100%。

1.2.6 心肌8-OHdG水平的測定 利用DNA ExtractorRTIS Kit提取小鼠心肌DNA，經(jīng)核酸酶和堿性磷酸酶在37℃條件下反應(yīng)1h進(jìn)行DNA酶解處理，隨后采用8-OHdG ELISA試劑盒測定8-OHdG水平，操作方法均按照上述產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較選擇Bonferroni法；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況及病死率的比較 AMI造模術(shù)后4周，KO組、KO+E組、WT組、WT+E組小鼠存活數(shù)量分別為7、8、7、7只，4組病死率分別為18.2%、33.3%、22.2%、30.0%，各組小鼠病死率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。存活小鼠均出現(xiàn)不同程度的食量減少、體重減輕、活動緩慢等情況。

2.2 各組小鼠心功能指標(biāo)的比較 心臟超聲檢測發(fā)現(xiàn)，與KO組及KO+E組相比，WT組、WT+E組FS、LVEF值均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而LVEDD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。KO與KO+E組、WT與WT+E組相比，上述指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表1、圖1。

表1 各組小鼠心臟超聲檢查指標(biāo)的比較

圖1 AMI造模后4周小鼠心臟超聲心動圖

2.3 各組小鼠心肌梗死面積及8-OHdG水平的比較 心肌梗死面積測定發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌梗死面積由大至小依次為：KO+E組＞KO組＞W(wǎng)T+E組＞W(wǎng)T組，4組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ELISA檢測8-OHdG水平由高至低依次為：KO+E組＞KO組＞W(wǎng)T+E組＞W(wǎng)T組，4組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表2。

表2 小鼠心肌梗死面積及8-OHdG水平的比較

3 討論

現(xiàn)有研究表明大量飲酒會加速動脈硬化的進(jìn)展，長期酗酒甚至?xí)鹚ㄗ用撀浼癆MI[6]。近期大規(guī)模薈萃分析證實(shí)，乙醇攝入量與冠心病的發(fā)病率、病死率呈“U”或“J”形曲線關(guān)系，適當(dāng)飲酒或不飲酒能夠降低包括AMI在內(nèi)的心血管疾病的發(fā)生率及病死率，發(fā)揮保護(hù)心血管的作用[7-8]。乙醇通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝，主要在ALDH作用下轉(zhuǎn)化成乙醛，后者積聚導(dǎo)致氧化應(yīng)激對組織細(xì)胞造成損害[9]，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。主要存在于線粒體內(nèi)的ALDH2能催化乙醛代謝生成乙酸，并最終被氧化為二氧化碳和水排出體外。ALDH2活性降低使乙醛向乙酸分解的過程受到阻遏，導(dǎo)致乙醛濃度增高，刺激肥大細(xì)胞釋放血管活性物質(zhì)引起一系列反應(yīng)[10]。Chen等[11]報(bào)道在部分對心肌缺血誘發(fā)的損傷具有很強(qiáng)抵抗力的大鼠心臟中ALDH2活性一直處于較高水平，推測很可能是在ALDH2的作用下，大鼠心肌缺血時(shí)體內(nèi)醛類物質(zhì)減少所造成的。人類ALDH2基因的Glu504Lys位點(diǎn)具有單核苷酸多態(tài)性，包括具有催化活性的野生型與無催化活性的突變型基因型。突變型ALDH2基因編碼的酶活性降低，催化乙醛的作用顯著減弱，攜帶該基因型的個體更易罹患AMI等心血管疾病[12-13]。本研究通過建立ALDH2不同基因型小鼠AMI模型，給予大劑量乙醇干預(yù)造成亞急性乙醇中毒，觀察乙醇、不同的ALDH2基因型與AMI的交互作用。結(jié)果顯示，亞急性乙醇中毒及ALDH2基因敲除均會增加小鼠心肌梗死面積，且兩者具有協(xié)同作用，而增強(qiáng)ALDH2表達(dá)能夠有效減少心肌梗死面積。同時(shí)，ALDH2基因敲除小鼠的心功能損害較野生型小鼠為嚴(yán)重。

目前普遍認(rèn)為，大劑量乙醇攝入使血液及心臟組織內(nèi)乙醛蓄積，導(dǎo)致心肌肥厚、減弱心臟收縮功能、破壞心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，而ALDH2能夠顯著降低乙醛的水平，從而拮抗乙醇的上述不良生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)改善心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡[14]。外源性給予ALDH2激動劑Alda-1能夠清除心肌缺血/再灌注損傷積聚的細(xì)胞毒性醛類物質(zhì)，減少60%心肌缺血損傷導(dǎo)致的心肌梗死面積[11]。ALDH2還能夠分解乙醛代謝產(chǎn)物4-羥壬烯醛，減輕乙醛及其代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的氧化損傷，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2拮抗乙醇心臟毒性是通過抑制蛋白激酶2A和2C，調(diào)節(jié)Akt和AMPK這兩個關(guān)鍵酶活化，改變其下游產(chǎn)物mTOR、STAT3、Notch1等的平衡，抑制轉(zhuǎn)錄因子Foxo3的磷酸化，減輕心肌細(xì)胞凋亡、自噬及線粒體功能障礙等實(shí)現(xiàn)的[15-16]。在乙醇代謝過程中，伴隨著大量ROS的生成[17]，ROS堆積可以引起DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)損傷。DNA的損傷可直接導(dǎo)致突變，造成細(xì)胞功能蛋白的缺失甚至可能導(dǎo)致癌變。ROS攻擊DNA形成加合物8-OHdG，后者被認(rèn)為是DNA氧化損傷的重要標(biāo)志物[18]。乙醇攝入可以誘發(fā)腦和肺組織中DNA氧化損傷，且在ALDH2基因敲除型小鼠中表現(xiàn)更為突出[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，亞急性乙醇中毒及ALDH2基因敲除均可使AMI小鼠心肌內(nèi)8-OHdG水平增加，而增強(qiáng)ALDH2表達(dá)可以降低8-OHdG水平、減少心肌細(xì)胞的DNA氧化損傷，這可能是ALDH2在AMI中發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。

Oyama等[5]以相同劑量乙醇造成ALDH2基因敲除小鼠亞急性乙醇中毒的研究中發(fā)現(xiàn)，敲除型小鼠的病死率高于野生型小鼠。在大規(guī)模人群流行病學(xué)研究中ALDH2基因多態(tài)性與心血管疾病的病死率密切相關(guān)，尤其是ALDH2基因突變型[13]。而本研究中觀察到ALDH2不同基因型及亞急性乙醇中毒對AMI小鼠的病死率并無明顯影響，且亞急性乙醇中毒對小鼠的心功能影響不大。筆者推測這可能與實(shí)驗(yàn)樣本量較少、乙醇干預(yù)及心肌梗死建模后觀察的時(shí)間相對較短有關(guān)。

綜上所述，ALDH2具有極其重要的心血管保護(hù)作用，增強(qiáng)ALDH2表達(dá)可有效地拮抗亞急性乙醇中毒對AMI的損害作用，作用機(jī)制可能與其減輕心肌細(xì)胞DNA氧化損傷有關(guān)。將來，保護(hù)和增強(qiáng)ALDH2的活性有望成為有效治療冠心病的新方向。

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Effects of aldehyde dehydrogenase-2 on acute myocardial infarction and DNA oxidative damage induced by ethanol intake in mice

ZHAO Qiang,ZHOU Liying,LAI Hongmei,et al.Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830001,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of aldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2)on myocardial infarction and DNA oxidative damage induced by ethanol intake in mice. Methods The mice with ALDH2(+/+)(WT group)and ALDH2(-/-)genotypes (KO group)were raised and then divided into two subgroups with or without ethanol treatment:KO group (n=11),WT group(n=9),KO+ethanol group(n=12)and WT+ethanol group(n=10).The KO+ethanol group and WT+ethanol group were fed with high dose of ethanol,while the KO group and WT group were treated with equal volume of saline.Acute myocardial infarction was induced in all mice;4 weeks later then the cardiac function were detected by ultrasonography,the myocardial infarct size was measured by Evan's blue pigment,and myocardial 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)level was determined by ELISA. Results The mortality rates of KO group,WT group,KO+ethanol group and WT+ethanol group were 18.2%,33.3%,22.2%and 30.0%,respectively(P＞0.05).The fraction shortening of left ventricular and ejection fraction were higher in WT group compared to KO group(P＜0.05).The area of myocardial infarction was the largest in KO+ethanol group, followed by KO group,WT+ethanol group,and WT group(all P＜0.05).The levels of 8-OHdG was highest in KO+ethanol group,followed by KO group,WT+ethanol group,and WT group(all P＜0.05). Conclusion Enhanced ALDH2 gene expression may effectively protect myocardium from infarction caused by high dose ethanol intake,which may be related to its attenuation of myocardial oxidative damage.

Aldehyde dehydrogenases-2 Acute myocardialinfarction Cardiac function DNAoxidative damage

2015-10-23）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012211A083）

830001 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心（趙強(qiáng)）；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（周立英、賴紅梅、馬麗、彭輝）

彭輝，E-mail：lucy-ph@163.com