林忠

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

臨床論著

MicroRNA-93在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

林忠

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

目的探討microRNA-93（miR-93）在宮頸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法收集2014年1月-2014年7月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院有完整病歷資料的41例宮頸癌患者組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)癌旁組織，實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測宮頸癌組織中miR-93表達(dá)水平；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-93模擬片段（mimic）轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)miR-93表達(dá)；活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）和流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-93對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及凋亡的影響；Transwell小室法檢測其對(duì)Hela細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響；Western blot檢測Hela細(xì)胞中上皮生長因子受體（EGFR）及其下游蛋白的表達(dá)量變化。結(jié)果41例宮頸癌患者腫瘤組織中miR-93表達(dá)量（0.048±0.013）低于癌旁組織（0.113±0.025），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）；轉(zhuǎn)染miR-93模擬片段后，宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-93表達(dá)恢復(fù)；與對(duì)照組和空白組比較，實(shí)驗(yàn)組宮頸癌細(xì)胞增殖能力下降（P=0.004），早期凋亡比例增加（P=0.032），侵襲（P=0.003）和遷移能力下降（P=0.003）；過表達(dá)miR-93的Hela細(xì)胞EGFR及下游的p-AKT表達(dá)下降（P=0.005），而總AKT蛋白無明顯變化（P=0.372）。結(jié)論miR-93在宮頸癌組織中的表達(dá)量下降，恢復(fù)其在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)能夠明顯抑制其細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制部分與miR-93抑制宮頸癌細(xì)胞EGFR/AKT信號(hào)通路活性有關(guān)。

宮頸癌；microRNA-93；EGFR/AKT信號(hào)通路；生物學(xué)行為

宮頸癌是美國女性中第6位常見癌癥，也是第2位常見的婦科腫瘤。美國平均每2 500例絕經(jīng)婦女中就有1例宮頸癌，占因癌癥死亡病例的5%～6%。為提高宮頸癌患者長期生存率，改善患者臨床結(jié)局，降低宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，篩選和識(shí)別能夠早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌的生物標(biāo)志物具有十分重要的意義[1]。

MicroRNA（miRNA）是一系列高度保守非編碼RNA，其長度為18～25個(gè)核苷酸。近年來研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中的miRNA表達(dá)異于正常組織，很多miRNA具有致腫瘤活性或腫瘤抑制活性[2-3]，miRNA在致癌過程中起重要作用，可以作為宮頸癌診斷的生物標(biāo)志物。

miR-93、miR-106b和miR-25屬于同一個(gè)miRNA集群，即miR-106b-25[4]，其參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程[5-7]。此外，大量的實(shí)驗(yàn)表明miR-93在不同的人類惡性腫瘤中起重要作用。本研究通過檢測miR-93在宮頸癌及其癌旁組織中的表達(dá)及對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的主要生物學(xué)行為的影響，探討miR-93在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能機(jī)制，為宮頸癌早期臨床診斷和靶向治療提供新的理論依據(jù)與方向。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月-2014年7月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的原發(fā)性宮頸癌患者凍存的癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織（距病灶2 cm的正常組織）標(biāo)本共41例，均有完整病歷資料?；颊呤中g(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療、生物治療等。釆用2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期10例，Ⅱ期8例，Ⅲ期23例；病理組織學(xué)分級(jí)中，高、中分化19例，低分化22例；患者年齡26～61歲，平均（46±12）歲。

1.2 細(xì)胞系

人宮頸癌細(xì)胞株Hela、siha、caski，c4-1和人正常宮頸上皮細(xì)胞株H8均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center For Type Culture Collection，CCTCC），細(xì)胞在37℃、含5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%小牛血清的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）高糖培基（美國Hyclone公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別加入終濃度為100 mg/L的鏈霉素與青霉素，細(xì)胞貼壁生長24 h。細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenedinitrilo tetraacetic acid，EDTA）消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-93表達(dá)水平

Trizol提取宮頸癌及宮頸癌細(xì)胞株總RNA，用miR-93檢測試劑盒檢測miR-93表達(dá)水平，取10 ng總RNA與3μl逆轉(zhuǎn)錄酶混合，在15μl反應(yīng)體系中，16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。而后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 150倍稀釋，取2μl稀釋的cDNA與2μl Taqman引物混合，在20μl反應(yīng)體系中，95℃變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)。細(xì)胞中miRNA表達(dá)用U6sn RNA為內(nèi)對(duì)照，相對(duì)miRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCt計(jì)算改變倍數(shù)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞增殖和周期分析

Hela宮頸癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期，隨機(jī)將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-93 mimics和對(duì)照mimics分別轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Hela細(xì)胞24 h后，細(xì)胞置無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓12 h后，換用DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過夜。離心收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次，加入PBS溴化乙啶染色液避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測，活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細(xì)胞增殖情況。

1.5 Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)

Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓16 h。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，每個(gè)侵襲小室加100μl細(xì)胞懸液，每個(gè)侵襲小室下室加600μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。其中侵襲實(shí)驗(yàn)在小室接種細(xì)胞前一晚，Matrigen（基質(zhì)膠）用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋成濃度為1∶7，每個(gè)侵襲小室加60μl，而遷移實(shí)驗(yàn)不加基質(zhì)膠。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，侵襲實(shí)驗(yàn)28 h后再遷移實(shí)驗(yàn)20 h，取出小室用90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取4個(gè)低倍視野（×100）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6 Western blot檢測miR-93對(duì)ATK蛋白表達(dá)的影響

將兩組細(xì)胞裂解后收集細(xì)胞，經(jīng)超聲機(jī)粉碎、離心，取上清液與上樣緩沖液煮沸制成蛋白質(zhì)樣品。取等量樣品依次經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis，SDS-PAGE），偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（美國MilliPore公司）轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉及Western blot封膜液封閉，然后分別加入AKT、p-AKT、表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、磷酸化表皮生長因子受體（phospho-epithelial growth factor receptor，pEGFR）、兔抗大鼠多克隆抗體及大鼠抗β-actin單克隆抗體，再加入山羊抗兔及山羊抗鼠二抗，采用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，將化學(xué)發(fā)光底物加于PVDF膜上，并在SYNGENE Chem Genius成像系統(tǒng)成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊則組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-93在宮頸癌及宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測41例宮頸癌及其相應(yīng)癌旁組織中miR-93的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-93在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其相應(yīng)癌旁組織（0.048±0.013vs0.113±0.025，P= 0.026）（見圖1）。41例宮頸癌組織中，有29例miR-93表達(dá)水平低于其相應(yīng)癌旁組織（70.73%，29/41）。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞中miR-93的表達(dá)明顯低于正常宮頸上皮細(xì)胞株H8，尤其是Hela細(xì)胞，后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)均采用Hela細(xì)胞作為研究對(duì)象以分析miR-93對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（見表1和圖2）。

表1 miR-93在宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)±s）

表1 miR-93在宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)±s）

組別Helasihacaskic4-1宮頸癌細(xì)胞0.017±0.0110.038±0.0120.042±0.0140.029±0.007正常宮頸上皮細(xì)胞株H80.072±0.0160.072±0.0160.072±0.0160.072±0.016 t值12.3749.4278.73510.162 P值0.0010.0100.0120.005

圖1 miR-93在宮頸癌組織及其癌旁組織的表達(dá)（±s）

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將miR-93 mimics轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。見圖2。

2.3 miR-93對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-93 mimics 72 h后細(xì)胞增殖能力逐漸下降，實(shí)驗(yàn)組72、96和120 h的細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組和空白組（P=0.004）。見圖3。

2.4 miR-93對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的凋亡率分別為（6.8± 0.8）%、（8.1±1.1）%和（15.3±1.5）%，對(duì)3組凋亡率進(jìn)行隨機(jī)方差分析后發(fā)現(xiàn)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.246，P=0.027），空白組和對(duì)照組比較經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.286）；實(shí)驗(yàn)組和空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032）。提示miR-93可促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡。見圖4。

圖2 miR-93 mimics轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

圖3 轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后抑制Hela細(xì)胞生長（x±s）

圖4 miR-93過表達(dá)后對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

2.5miR-93對(duì)宮頸癌A2890細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

宮頸癌Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后，其遷移和侵襲功能受到明顯影響。隨機(jī)方差分析后發(fā)現(xiàn)3組細(xì)胞侵襲（t=6.472，P=0.031）和遷移（t=7.886，P=0.025）結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后，細(xì)胞的遷移（t=7.984，P=0.024）、侵襲（t=6.837，P=0.029）能力顯著降低（見表2）。

表2 miR-93對(duì)Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s）

表2 miR-93對(duì)Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s）

組別空白組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)118.4±8.4127.6±14.3 114.5±7.9124.5±11.7 67.8±5.875.2±7.8

2.6miR-93表達(dá)對(duì)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

本研究檢測表達(dá)過miR-93后宮頸癌細(xì)胞中EGFR蛋白及其下游的AKT及p-AKT蛋白表達(dá)量的變化。Hela轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后細(xì)胞中p-EGFR及p-AKT蛋白表達(dá)下降（P=0.005），但是總的EGFR和AKT蛋白表達(dá)無明顯變化（P=0.372），提示過表達(dá)miR-9后抑制宮頸癌細(xì)胞中EGFR/AKT信號(hào)通路的活性。見圖5。

圖5 Western blot檢測miR-93對(duì)EGFR及AKT表達(dá)的影響（±s）

3 討論

宮頸癌惡性程度高的主要原因是難以早期發(fā)現(xiàn)而且缺乏治療晚期及復(fù)發(fā)患者的有效方法。因此，識(shí)別和發(fā)現(xiàn)能夠早期診斷宮頸癌，并能協(xié)助優(yōu)化和個(gè)體化治療的預(yù)測性標(biāo)志物對(duì)宮頸癌診治具有十分重大的意義。目前已有大量研究證實(shí)，miRNAs發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因作用。有學(xué)者建議將數(shù)種miRNAs作為宮頸癌的特異性標(biāo)志，血液循環(huán)中miRNAs水平有望成為有價(jià)值的預(yù)后和診斷性生物標(biāo)志物，如miR-200家族、miR-199/214簇或者let-7等。多種miRNAs都可能成為宮頸癌擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)，盡管還有很多困難尚未解決，但是miRNAs療法可能是預(yù)防和治療宮頸癌的有效手段。

miR-106b-25簇由高度保守的miRNA-106b（miR-106b）、miRNA-93（miR-93）和miRNA-25（miR-25）組成，以往研究表明在多種癌癥中miR-106b-25簇過表達(dá)，如胃癌、前列腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和多發(fā)性骨髓瘤等[8]。研究表明miR-106b-25 miRNA簇可作為原癌基因。許多研究還證實(shí)腫瘤形成的主要機(jī)制包括與MCM7協(xié)作進(jìn)行靶向PTEN促使細(xì)胞增殖[9]。盡管證據(jù)表明miR-106b-25簇成員可作為原癌基因，但是在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)miR-106b-25簇成員也能作為腫瘤抑制因子抑制腫瘤生長[10]，這一矛盾的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常宮頸組織比較，宮頸癌組織中miR-93表達(dá)顯著降低。大量的研究表明miRNAs參與了各種類型人類腫瘤發(fā)生以及發(fā)展，與正常組織比較，腫瘤組織中miR-93是眾多異常表達(dá)的miRNA之一。以往研究認(rèn)為miR-93是致瘤miRNA，在小細(xì)胞肺癌[11]、骨肉瘤[12]、喉癌[13]和肝細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)。然而TANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-93在結(jié)腸癌癌中的表達(dá)明顯低于正常結(jié)腸黏膜組織，本研究中筆者也發(fā)現(xiàn)與癌旁正常宮頸組織比較，宮頸癌組織中miR-93表達(dá)水平顯著降低，猜測miR-93在不同腫瘤中作用的差異可能是由不同的腫瘤異質(zhì)性引起。

本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-93 mimics至內(nèi)源性低表達(dá)miR-93的宮頸癌Hela細(xì)胞，結(jié)果表明Hela細(xì)胞增殖、抗凋亡、侵襲和遷移能力下降，證實(shí)miR-93在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用。TANG等[14]研究也表明，miR-93過表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，也有大量研究表明，抑制miR-93表達(dá)能夠抑制宮頸癌、胃癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡、侵襲及遷移能力等。miR-93對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)影響不同，與不同腫瘤組織中miR-93表達(dá)也不同的研究結(jié)果相符合。提示考察miR-93的表達(dá)及臨床意義應(yīng)考慮腫瘤類型、腫瘤來源，等等，不能一概而論。

表皮生長因子受體位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，在宮頸癌細(xì)胞中異?；罨种艵GFR活化可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[15]。此外，大量研究表明miR-93的靶基因有EFGR、PTEN、RAD1、FGFR2S及酪氨酸蛋白激酶受體A4（ephrintype areceptor 4，EphA4）等。表皮生長因子受體信號(hào)通路在上皮惡性腫瘤包括宮頸癌中顯得尤為重要。然而，EGFR信號(hào)通路是通過何種分子機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的，仍然知之甚少。miR-93在多種腫瘤中呈低表達(dá)，能夠激活EGFR信號(hào)通路，從而促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。盡管基因芯片分析已經(jīng)證實(shí)EGFR是miR-93的靶基因，但關(guān)于其在宮頸癌中的有關(guān)調(diào)控機(jī)制的報(bào)道仍少見。基于以上研究報(bào)道，本研究推測miR-93可能影響宮頸癌細(xì)胞EGFR/AKT信號(hào)通路活性。本實(shí)驗(yàn)研究分析miR-93過表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela、EGFR、p-EGFR、AKT及p-AKT表達(dá)的影響，結(jié)果表明過表達(dá)miR-93后細(xì)胞中p-EGFR、p-AKT表達(dá)量明顯下降，但是總AKT和EGFR蛋白表達(dá)無明顯變化。miR-93通過靶向抑制EGFR活性，阻斷EGFR/AKT信號(hào)通路活，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

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（申海菊 編輯）

Characterization of miR-93 expression and investigation of its biological function in cervical cancer

Zhong Lin
(Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Objective To investigate the expression level of miR-93 in cervical cancer tissues and its effects on the biological functions of the cancer cells.Methods Forty-one paired cervical cancer tissues and adjacent normal tissues were collected from Xiangya Hospital of Central South University from Jan.2014 to Jul.2014,and all the collected tissues had complete medical records.Using qRT-PCR,the expression of miR-93 was explored in the 41 paired cervical cancer tissues and adjacent normal tissues.miR-93 mimic was transfected into cervical cancer Hela cells to restore the expression of miR-93.The proliferation and apoptosis effects of miR-93 on Hela cells were evaluated by cell counting kit-8(CCK-8)and flow cytometry, respectively.Moreover,the migration and invasion of transfected Hela cells were detected by Transwell chamber assay.Western blot was used to measure the expressions of EGFR and its downstream protein in the Hela cells.Results The expression of miR-93 was significantly decreased in the 41 cervical cancer tissues compared with the adjacent normal tissues[(0.048±0.013)vs(0.113±0.025),P=0.026].By transfection of miR-93 mimic fragment,miR-93 expression recovered in the cervical cancer Hela cells.Overexpression ofmiR-93 through exogenous transfection with miR-93 mimic significantly suppressed cell proliferation(P= 0.004),induced cell apoptosis(P=0.032),and inhibited cell migration and invasion(P=0.003).Moreover, miR-93 overexpression of Hela cells significantly suppressed the expressions of EGFR and its downstream p-AKT(P=0.005),while did not influence the expression of total AKT(P=0.372),which suggested that overexpression of miR-93 significantly suppressed the EGFR/AKT signaling pathway in cervical cancer cells. Conclusions The expression of miR-93 is significantly decreased in cervical cancer tissues.Restored expression of miR-93 could suppress cell proliferation,migration and invasion,and induce cell apoptosis through,at least partially,suppression of EGFR/AKT signaling pathway.

cervical cancer;miR-93;EGFR/AKT signaling pathway

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.010

1005-8982（2016）23-0047-06

2015-10-23