馬娜，胡浩，賈政軍，席惠，王華

（湖南省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，湖南 長沙 410008）

罕見的4q13.1-13.3微缺失導(dǎo)致患者智力低下及生長發(fā)育遲緩表型*

馬娜，胡浩，賈政軍，席惠，王華

（湖南省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，湖南 長沙 410008）

目的對1例智力低下、生長發(fā)育遲緩及語言發(fā)育障礙患兒進(jìn)行細(xì)胞及分子遺傳學(xué)分析，探討基因型與表型的關(guān)系。方法應(yīng)用G顯帶技術(shù)分析患兒及其父母的外周血染色體，用單核苷酸多態(tài)微陣列芯片（SNP-Array）對患兒進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異分析，并用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）驗證SNP-Array結(jié)果。結(jié)果

單核苷酸多態(tài)微陣列芯片；智力低下；熒光原位雜交

4號染色體長臂微缺失是一種罕見的染色體微缺失綜合征，主要表現(xiàn)除身材矮小、發(fā)育遲緩、青春期發(fā)育延遲、智力低下等常見染色體異常表型外，還有額部隆起、鼻梁寬、低位耳、內(nèi)置贅皮等顏面畸形[1]。其中4號染色體長臂近端的微缺失綜合征臨床表現(xiàn)個體間有差異，且缺失片段大小不一，目前全世界僅有少數(shù)報道[2-3]，國內(nèi)尚未見報道。因此，闡述此類綜合征的臨床表型，發(fā)現(xiàn)其候選基因，對進(jìn)一步明確其基因型和表型關(guān)系顯得尤為重要。

本研究中筆者應(yīng)用SNP-Array、G顯帶核型分析和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)對1例智力低下伴多發(fā)畸形患兒進(jìn)行細(xì)胞及分子遺傳學(xué)的分析，明確4q13.1微缺失是患兒智力低下和多發(fā)畸形的遺傳學(xué)病因，并用FISH技術(shù)證實該缺失。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

患兒，男性，8歲，湖南人，2014年9月因“智力低下、語言發(fā)育遲緩、身下矮小顏面部發(fā)育畸形”來本院就診?；純合档?胎39+1周順產(chǎn)，出生體重2920g。無出生窒息史。患兒運動發(fā)育正常，3個月抬頭，7個月獨坐，12個月獨站并且2歲獨走。8歲時，患兒身高103.3 cm，坐高60.0 cm，體重16.45 kg。體格檢查：患兒額部扁平，發(fā)際線高，短人中，低位耳。第二性征發(fā)育顯示胡須Ⅰ期，腋毛Ⅰ期，陰毛Ⅰ期，外生殖器Ⅰ期，雙側(cè)睪丸不足1 ml，無首精。葉氏骨齡5.3歲，R系列分135分。GH藥物激發(fā)試驗提示完全性生長激素缺乏癥?；純褐橇β浜螅粫f話。大腦MRI檢查未見異常。外院查心電圖正常。串聯(lián)質(zhì)譜（色譜）對常見遺傳代謝病篩查未見明顯異常。

否認(rèn)出生缺陷家族史、毒物及輻射接觸史、藥物史，否認(rèn)親屬有遺傳病發(fā)生史。本研究獲患兒家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)檢測采集患兒及其父母的外周血，接種于含植物血凝素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按常規(guī)操作制備染色體，G顯帶處理。選擇400條帶以上的核型進(jìn)行分析，核型按《2013人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN）》描述。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片檢測取患兒靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝，抽提外周血全基因組DNA。采用美國Affymetrix公司提供的Cyto Scan 750K SNP-Array（含約200 000 SNPs探針，550 000個CNV探針）進(jìn)行全基因拷貝數(shù)變異檢測。取250 ng完整基因組DNA按照標(biāo)準(zhǔn)試驗流程：NspⅠ酶切，接頭連接，聚合酶鏈反應(yīng)擴增，產(chǎn)物純化，片段化，標(biāo)記，雜交進(jìn)行實驗。采用Affymetrix Fluidics Stations 450Dx進(jìn)行洗滌，Affymetrix 7G掃描儀進(jìn)行掃描，掃描信號經(jīng)Affymetrix CHAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 FISH檢測采用針對4q13.2區(qū)域的特異性探針RP11-111K19（chr4：67586902-67781121，194 kb，棕色信號）進(jìn)行4p13.1-p13.3區(qū)域微缺失檢測；針對4p16.3區(qū)域的特異性探針RP11-350C22（chr4：57716-216840，153 kb，紅色信號）、4q35.1區(qū)域的特異性探針RP11-159A22（chr15：185524560-185696883，172 kb，綠色信號）、15q26.3區(qū)域的特異性探針RP11-90E5（chr15：100030325-100216834，186 kb，綠色信號）驗證患兒4號和15號染色體的易位。取患兒外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞懸液制片，玻片進(jìn)行預(yù)處理后，按照試劑說明書步驟探針與染色體經(jīng)過變性、雜交、洗滌，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察雜交信號。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)染色體核型分析

G顯帶核型分析顯示患兒染色體核型為46，XY，t（4∶15）（p14；q26.1）；患兒母親和父親G顯帶核型分析結(jié)果正常，表明患兒為新發(fā)4號和15號染色體易位，見圖1。

圖1 患兒外周血G顯帶核型分析圖

2.2SNP-Array檢測結(jié)果

患兒高密度SNP-Array芯片結(jié)果為arr[hg19]4q 13.1q13.3（63，042，514-74，655，453）×1，在4q13.1q 13.3存在約11.6 Mb的缺失，其父母檢測結(jié)果正常。

2.3FISH檢測結(jié)果

患兒中期分裂相RP11-111K19探針FISH結(jié)果顯示其中1條4號染色體4q13.2缺少探針RP11-111K19信號，驗證患兒存在4q13.2缺失。此外，4號染色體RP11-350C22（4p16.3）探針易位至15號染色體長臂末端形成衍生15號染色體，RP11-90E15（15q26.3）探針仍位于15號染色體上。同時FISH結(jié)果也驗證4q13.2缺失染色體與衍生4號染色體為同一條染色體,見圖2。

圖2 患兒中期分裂相探針FISH分析結(jié)果

3 討論

智力障礙在人群中發(fā)病率約為3%，遺傳因素約占40%，其中染色體異常和單基因病分別占25%和10%[4]。染色體異常可以用傳統(tǒng)的核型分析和微陣列分析技術(shù)檢測。染色體異?？梢詸z出5～10 Mb以上的片段異常；但受到檢測者經(jīng)驗、中期染色體的質(zhì)量以及異常片段本身的結(jié)構(gòu)限制。本研究中患兒4q13.1-13.3缺失片段大小為11.6 Mb，未能在檢測時被發(fā)現(xiàn)，其原因是患者本身有染色體的易位，一開始想到的是易位的染色體打斷基因從而導(dǎo)致患者的表型異常；另外4號染色體長達(dá)190Mb，因而當(dāng)4q13這條深帶變窄時，也容易被忽視。微陣列分析技術(shù)可以分析全基因組以及亞顯微結(jié)構(gòu)異常，且目前這項技術(shù)可以解釋將近30%的智力低下病因[4]。2010年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)協(xié)會推薦對于智力低下和生長發(fā)育遲緩的患者，染色體芯片應(yīng)該作為一線檢測手段[5]，筆者的研究也證實該點，本研究進(jìn)一步強調(diào)這類患者應(yīng)用染色體芯片檢測的重要性。

4號染色體長臂缺失報道較少，發(fā)生率約為1/ 10萬[6]，且其缺失常見于q33至染色體末端，而4q13.1-13.2區(qū)域的缺失報道更為罕見。在已報道的4號染色體長臂中間缺失病例中，斷點易發(fā)生于4q13.1，4q13.2和4q13.3[2-3]，但是據(jù)筆者所知，目前尚無4q13.1-4q13.3缺失報道。雖然所報道病例缺失區(qū)域有一定差異，但臨床表現(xiàn)有一定共性，Decipher數(shù)據(jù)庫中該綜合征臨床表型包括智力低下、顏面部畸形、鼻梁低平、低位耳、胃食管反流等。有學(xué)者研究4號染色體長臂中的部分基因與疾病的關(guān)系，取得了很大進(jìn)展。EPHA5受體在個體發(fā)育中發(fā)揮重要作用，COOPER等[7]表明，EphA5與其配體相互作用后通過阻止促進(jìn)紋狀體中腦多巴胺神經(jīng)元釋放調(diào)節(jié)多巴胺能系統(tǒng)軸突間相互作用，GERLAI等[8]實驗表明，EPHA5活化后成年小鼠海馬中的微管蛋白表達(dá)水平下調(diào)，該結(jié)構(gòu)說明EphA5與其配體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突和樹突的形成中發(fā)揮重要作用。

本文中患者除了4q缺失綜合征常見特征外，還具有不完全性生長激素缺乏和第二性征發(fā)育延遲的特點。筆者搜索患者4q13.1-13.3微缺失區(qū)域的49個在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫基因，發(fā)現(xiàn)以下基因與本文患者表型具有相關(guān)性。促性腺激素釋放激素受體基因編碼1型促性腺激素釋放激素的受體，高表達(dá)于促性腺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胸腺、卵巢和前列腺[9]。此基因突變可導(dǎo)致部分或全部促性腺激素釋放激素功能喪失，從而導(dǎo)致低促性腺素性功能減退癥（MIM# 146110）或無睪癥（MIM#228300）發(fā)生。MUC7編碼唾液腺黏蛋白，其主要表達(dá)于支氣管和唾液腺，其主要通過促進(jìn)口腔細(xì)菌清除發(fā)揮免疫屏障作用，另外其也有輔助咀嚼、發(fā)音和吞咽功能[10]。剩下的泛素活化酶6、突觸結(jié)合蛋白14以及UGT2B基因家族（UGT2B17，UGT2B15，UGT2B10，UGT2B7，UGT2B11，UGT2B28和UGT2B4）皆在雄激素分解代謝中發(fā)揮作用[3]。

本文筆者報道1例4q13.1-13.3雜合缺失合并4p14和15q26.1染色體平衡易位伴智力低下病例，雖然筆者不能完全排除染色體斷裂處基因打斷對患兒表型影響，但是患者在4q13.1-4q13.3區(qū)域存在11.6 Mb的微缺失，而父母均不存在該缺失，該區(qū)域有多達(dá)49個在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫基因，并且多個基因與患者的表型明顯相關(guān)，因而患者4q13.1-4q13.3微缺失所致的單倍劑量不足更可能是患兒表型原因，但由于報道的病例較少，對該綜合征關(guān)鍵區(qū)域的進(jìn)一步明確及來源與表型的關(guān)系需要更多病例的積累和分析。SNP-array技術(shù)可以高分辨檢測亞顯微水平的染色體畸變，因此對于染色體微缺失/微重復(fù)檢測有著較大的優(yōu)越性，已成為不明原因智力低下、發(fā)育異常檢測的重要手段[11]。并且因為該技術(shù)精確定位染色體斷裂點，從而有利于基因型與表型關(guān)系的研究。

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[2]LIPSKA B S,BRZESKWINIEWICZ M,WIERZBA J,et al.8.6 Mb interstitial deletion of chromosome 4q13.3q21.23 in a boy with cognitive impairment,short stature,hearing loss,skeletal abnormalities and facial dysmorphism[J].Genet Couns,2011,22(4):353-363.

[3]QUINTELA I,BARROS F,FERNANDEZ-PRIETO M,et al.Interstitial microdeletions including the chromosome band 4q13.2 and the UBA6 gene as possible causes of intellectual disability and behavior disorder[J].Am J Med Genet A,2015,167A(12): 3113-3120.

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（申海菊 編輯）

R749.94

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.030

1005-8982（2016）23-0140-03

2016-09-29

衛(wèi)生部公益性行業(yè)科研專項項目（No：1013-72）

王華，E-mail：wanghua213@aliyun.com

G顯帶核型分析檢測提示患兒核型為46，XY，t（4∶15）（p14；q26.1），高密度SNP-array芯片檢測顯示患兒在4q13.1-13.3存在11.6 Mb的微缺失；父母親外周血核型分析未見異常。結(jié)論經(jīng)過SNP-array結(jié)合G顯帶和FISH技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)染色體微缺失以及進(jìn)一步分析該綜合征表型-基因型關(guān)系，為家系再次生育時進(jìn)行產(chǎn)前診斷提供了可靠的遺傳學(xué)證據(jù)。