王紹軍，郭思彤，吳闖，趙趕

(1廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，南寧 530003；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

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Mcl-1基因siRNA囊泡制備及其對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用觀察

王紹軍1，郭思彤2，吳闖3，趙趕1

(1廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，南寧 530003；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

目的 制備包載髓樣細(xì)胞白血病1(Mcl-1)基因的小干擾RNA(siRNA)囊泡(Mcl-1基因siRNA囊泡)，并觀察其對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。方法 ①M(fèi)cl-1基因siRNA囊泡制備及其功能鑒定：采用乙醇注入法制備空白囊泡，將其分別和FAM標(biāo)記(熒光標(biāo)記物，可在顯微鏡下被觀察)的正常siRNA(FAM-siRNA)、Mcl-1 基因siRNA溶液渦旋、靜電復(fù)合，室溫靜置30 min，獲得包載FAM-siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA囊泡。采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定空白囊泡、包載FAM-siRNA囊泡的平均粒徑和zeta電位；采用超濾離心-熒光分光光度法測(cè)定包載FAM-siRNA囊泡的熒光強(qiáng)度并計(jì)算包封率；觀察FAM-siRNA釋放情況，計(jì)算FAM- siRNA釋放率。取HepG2細(xì)胞分為A、B、C、D組，培養(yǎng)24 h時(shí)C組加入包載FAM- siRNA囊泡，D組加入包載FAM-siRNA囊泡和Lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑，B組加入游離FAM-siRNA，A組不做任何處理，繼續(xù)培養(yǎng)6 h時(shí)觀察各組細(xì)胞FAM- siRNA攝取情況。②轉(zhuǎn)染Mcl-1基因siRNA囊泡對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用觀察：取HepG2細(xì)胞，分為1、2、3、4、5組，5×105/孔接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h時(shí)1、2、3、4組分別加入游離Mcl-1 siRNA、包載FAM- siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA +Lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑，5組不做任何處理。培養(yǎng)78 h時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞Mcl-1蛋白。取HepG2細(xì)胞分為甲、乙、丙、丁組及對(duì)照組，培養(yǎng)24 h時(shí)甲、乙、丙、丁組分別加入終濃度為1、10、50、100、200 nmol/L的游離Mcl-1 基因siRNA、包載FAM- siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA囊泡、Mcl-1基因siRNA+ Lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑,對(duì)照組不做任何處理。培養(yǎng)48 h時(shí)觀察各組細(xì)胞生存情況，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果 空白囊泡、包載FAM- siRNA囊泡粒徑、zeta電位相比，P均<0.01。包載FAM- siRNA囊泡包封率82.3%±2.1%。培養(yǎng)1、3、6、12、24、36、48、72、96 h時(shí)FAM- siRNA囊泡的FAM-siRNA釋放率分別為13.5%±2.8%、26.1%±1.6%、38.0%±2.9%、50.6%±2.3%、56.8%±2.9%、59.9%±2.3%、63.3%±2.0%、65.0%±2.7%、67.2%±2.9%。C、D組對(duì)FAM-siRNA攝取情況優(yōu)于B組。1、2、3、4、5組細(xì)胞Mcl-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別102.0±4.9、103.8±8.3、25.2±3.7、29.4±6.4、96.1±5.8，3組Mcl-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于1、2、5組，P均<0.01。當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L時(shí)，丙、丁組細(xì)胞生存率均高于甲、乙組，P均<0.01；丁組細(xì)胞生存率高于丙組，P<0.01。結(jié)論 成功制備Mcl-1基因siRNA囊泡。HepG2細(xì)胞中Mcl-1蛋白低表達(dá)。轉(zhuǎn)染Mcl-1基因siRNA囊泡的HepG2細(xì)胞存在生長(zhǎng)抑制。

髓樣細(xì)胞白血病1；小干擾RNA；RNA干擾；囊泡；肝癌；細(xì)胞存活率

髓樣細(xì)胞白血病1(Mcl-1)基因是Bcl-2抗凋亡基因家族的成員之一，在腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、分化等過(guò)程具有重要作用[1]。Mcl-1蛋白在肝癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]和白血病[5,6]等惡性腫瘤組織中中均有表達(dá)，降低其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)可能成為治療腫瘤疾病的有效途徑之一。小干擾RNA(siRNA)常被用于介導(dǎo)RNA干擾一種新型SiRNA載體[7,8]，但非特異性分布、細(xì)胞穿透性差、易被細(xì)胞內(nèi)酶降解等特性限制了其應(yīng)用范圍[6]。目前國(guó)內(nèi)尚未有文獻(xiàn)報(bào)道將囊泡用于Mcl-1基因 siRNA的遞送。2010年1月～2016年4月，我們制備了包載Mcl-1基因的siRNA囊泡(Mcl-1基因siRNA囊泡)，并觀察其對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 HepG2細(xì)胞[2]來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，置于含10%胎牛血清(PBS)的DMEM培養(yǎng)液、5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Mcl-1 siRNA(上游引物5′-AAGUAUCACAGACGUUCUCTT-3′，下游引物5′-GAGAACGUCUGUGAUACUUTT-3′)，F(xiàn)AM(熒光標(biāo)記物，可在顯微鏡下被觀察)標(biāo)記的陰性對(duì)照 siRNA(FAM-siRNA)均購(gòu)自上海吉瑪公司，其他試劑均為分析純。

1.2 包載FAM-siRNA囊泡、Mcl-1 基因siRNA囊泡制備方法 采用乙醇注入法制備空白囊泡[9]，分別稱(chēng)取50 mg DOTAP、50 mg司盤(pán)-60、100 mg膽固醇溶于10 mL無(wú)水乙醇中，將上述溶液以1.0 mL/min注入50 mL PBS(50 ℃，pH=7．4)中，不停攪拌直至乙醇揮發(fā)完全。待冷卻至室溫后繼續(xù)攪拌30 min，控制終體積為100 mL，將所得混懸液依次過(guò)0.45 μm和0.22 μm的微孔濾膜后得空白囊泡。將10 μL濃度為20 μmol/L的FAM-siRNA、Mcl-1 siRNA分別與1 mL空白囊泡溶液渦旋，室溫靜置30 min。

1.3 包載FAM-siRNA囊泡功能觀測(cè)方法

1.3.1 包載FAM-siRNA囊泡粒徑及zeta電位測(cè)定方法 采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定空白囊泡、包載FAM-siRNA囊泡平均粒徑和zeta電位，取樣品用蒸餾水稀釋10倍，設(shè)定激光束波長(zhǎng)為633 nm,入射光與散射光夾角為90°，平衡120 s。所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 FAM-siRNA囊泡包封率測(cè)定方法 取包載FAM-siRNA囊泡1 mL，5 000 r/min離心10 min，取濾液加甲醇定容至5 mL，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm。發(fā)射波長(zhǎng)520 nm條件下測(cè)其熒光強(qiáng)度F1。另外取制劑相同量的FAM-siRNA加甲醇定容至5 mL后測(cè)其熒光強(qiáng)度F2。計(jì)算包載FAM-siRNA囊泡的包封率。包封率=(1-F1/F2)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 包載FAM-siRNA囊泡的FAM-siRNA釋放情況觀測(cè) 取包載FAM-siRNA囊泡1 mL，5 000 r/min離心10 min，將樣品轉(zhuǎn)移至4 mL pH為7.4的PBS中，37 ℃搖床振蕩，將釋放介質(zhì)分離至超濾離心管中，5 000 r/min離心10 min后回收濾液。采用熒光分光光度法觀察釋放1、3、6、12、24、36、48、72、96 h 時(shí)FAM-siRNA釋放情況，計(jì)算FAM-siRNA釋放率。釋放率=(藥物釋放量/藥物總量)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 HepG2細(xì)胞對(duì)包載FAM-siRNA囊泡、游離FAM-siRNA攝取情況觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，分為A、B、C、D組，1×104/孔接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h時(shí)取C、D組分別加入包載FAM-siRNA囊泡和包載FAM- siRNA的Lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑(制作方法同1.2)，B組加入等量游離FAM-siRNA，A組不做任何處理，其中每孔FAM-siRNA終濃度為100 nmol/L。共培養(yǎng)6 h后棄上清，PBS清洗細(xì)胞2次，加入胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，過(guò)200目篩網(wǎng)后上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞FAM-siRNA攝取情況。

1.4 轉(zhuǎn)染Mcl-1基因siRNA囊泡對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用觀察

1.4.1 轉(zhuǎn)染Mcl-1基因siRNA囊泡對(duì)HepG2細(xì)胞Mcl-1蛋白的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，分為1、2、3、4、5組，5×105/孔接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。設(shè)1、2、3、4組，培養(yǎng)24 h時(shí)分別加入終濃度為100 nmol/L游離Mcl-1-siRNA、包載FAM-siRNA囊泡、包載Mcl-1-siRNA囊泡、包載Mcl-1基因siRNA+Lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑，5組不做任何處理。轉(zhuǎn)染6 h后吸棄培養(yǎng)液，加入含血清DMEM培養(yǎng)72 h后收集各組細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)Mcl-1蛋白。以β-actin作為內(nèi)參，以Mcl-1蛋白條帶與β-actin條帶灰度值之比表示Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 轉(zhuǎn)染包載Mcl-1基因siRNA的囊泡對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用觀察 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，分為甲、乙、丙、丁組及對(duì)照組，1×104/孔接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h時(shí)甲、乙、丙、丁組分別加入終濃度為1、10、50、100、200 nmol/L的游離Mcl-1 siRNA、包載FAM-siRNA囊泡、包載Mcl-1基因siRNA囊泡、包載Mcl-1基因siRNA+Lipofectamin轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)照組不做任何處理。培養(yǎng)6 h吸棄上清液，加入含血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTT繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清液，加入150 μL DMSO，避光震蕩5 min，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各組490 nm處吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率(%)=(A觀察組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用表示，結(jié)果比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 包載FAM-siRNA囊泡粒徑、zeta電位、包封率、釋放率及攝取率 空白囊泡、包載FAM-siRNA囊泡粒徑分別為(159.0±2.4)、(193.4±2.7)nm，二者比較，P<0.01?？瞻啄遗荨dFAM-siRNA囊泡zeta電位分別為(51.9±1.2)、(38.4±1.9)mV，二者比較，P<0.01。包載FAM-siRNA囊泡包封率(82.3±2.1)%。釋放1、3、6、12、24、36、48、72、96h包載FAM-siRNA囊泡的FAM-siRNA釋放率分別為13.5%±2.8%、26.1%±1.6%、38.0%±2.9%、50.6%±2.3%、56.8%±2.9%、59.9%±2.3%、63.3%±2.0%、65.0%±2.7%、67.2%±2.9%。B、C、D組FAM-siRNA攝取情況見(jiàn)圖1。C、D組對(duì)FAM-siRNA攝取情況優(yōu)于B組。

圖1 各組FAM-siRNA攝取情況

2.2 轉(zhuǎn)染Mcl-1基因siRNA囊泡的HepG2細(xì)胞的Mcl-1蛋白表達(dá)及細(xì)胞生存率 1、2、3、4、5組細(xì)胞Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為102.0±4.9、103.8±8.3、25.2±3.7、29.4±6.4、96.1±5.8,3組Mcl-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于1、2、5組，P均<0.01。各組轉(zhuǎn)染不同濃度Mcl-1基因SiRNA囊泡的HepG2細(xì)胞生存率比較見(jiàn)表1。

3 討論

Mcl-1蛋白是一種抗凋亡蛋白，其在細(xì)胞系分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期的調(diào)控中起重要作用[6]。但也有研究[11,12]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞接收凋亡信號(hào)刺激后，另外一些BH3-only蛋白如Noxa蛋白，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Mcl-1蛋白，促進(jìn)細(xì)胞釋放Bak促凋亡蛋白，導(dǎo)致線粒體外膜上形成孔道并釋放細(xì)胞色素C，從而引起后續(xù)半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。Mcl-1蛋白的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、翻譯等多水平調(diào)節(jié)。研究[13]表明，許多腫瘤細(xì)胞能過(guò)度表達(dá)Mcl-1蛋白，導(dǎo)致抗凋亡成員與促凋亡成員之間的相互作用失衡，引發(fā)腫瘤細(xì)胞惡性增殖。除了抗凋亡功能之外，也有研究認(rèn)為Mcl-1蛋白分布于細(xì)胞核內(nèi)，可與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK-1)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)相互作用，調(diào)控細(xì)胞分化與細(xì)胞周期進(jìn)程。進(jìn)一步研究[8，10]表明,Mcl-1蛋白在胚胎形成、組織發(fā)育和免疫系統(tǒng)中具有重要作用,Mcl-1表達(dá)異常可以導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。最新研究[11]認(rèn)為，Mcl-1蛋白其異常表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的正常凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生。

表1 各組轉(zhuǎn)染不同濃度Mcl-1基因SiRNA囊泡的HepG2細(xì)胞生存率比較

本研究采用乙醇注入法制備囊泡，與siRNA靜電復(fù)合后得siRNA囊泡用于siRNA的胞內(nèi)遞送。文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤部位毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致大分子類(lèi)物質(zhì)可自由進(jìn)入細(xì)胞間隙，同時(shí)淋巴回流的缺失進(jìn)一步加劇了物質(zhì)的聚集，此現(xiàn)象為增強(qiáng)滲透滯留(EPR)效應(yīng)，一般粒徑為50～200 nm的載體可通過(guò)EPR效應(yīng)蓄積于實(shí)體瘤組織中[12]。本研究所制備的空白囊泡成功結(jié)合siRNA后表面形成水化層，導(dǎo)致其粒徑顯著增加，但仍舊小于200 nm，有望借助被動(dòng)靶向作用進(jìn)入腫瘤部位。由于細(xì)胞表面一般帶負(fù)電，因此同樣荷負(fù)電的游離siRNA很難在不借助載體的情況下進(jìn)入細(xì)胞中，細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)證明所制備囊泡可以很好地將siRNA遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)內(nèi)吞入胞的載體需有效釋放siRNA才能發(fā)揮其基因沉默作用，體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)包載FAM-SiRNA囊泡在釋放96 h時(shí)最終釋放量為67.2%±2.9%[10]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，Mcl-1基因siRNA囊泡可將Mcl-1基因siRNA運(yùn)送至HepG2細(xì)胞內(nèi)并抑制Mcl-1蛋白表達(dá)，最終抑制細(xì)胞生存。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L時(shí)，丙、丁組細(xì)胞生存率均高于甲、乙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，丁組細(xì)胞生存率高于丙組。表明Mcl-1基因siRNA囊泡可以顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞存活，原因是Mcl-1基因siRNA囊泡進(jìn)入細(xì)胞后釋放的Mcl-1 siRNA可抑制Mcl-1蛋白表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞正常凋亡通路。綜上所述，成功制備Mcl-1基因siRNA囊泡。HepG2細(xì)胞中Mcl-1蛋白低表達(dá)。轉(zhuǎn)染Mcl-1基因siRNA囊泡的人肝癌HepG2細(xì)胞存在生長(zhǎng)抑制。

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Preparation of Mcl-1 siRNA niosomes and its inhibitory effect on human hepatoma carcinoma HepG2 cells

WANGShaojun1,GUOSitong,WUChuang,ZHAOGan

(1TheMaternalandChildHealthHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530003,China)

Objective To prepare myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) small interfering RNA (siRNA) loaded niosomes and to observe its inhibitory effect on human hepatoma carcinoma HepG2 cells.Methods ①Preparation and functional identification of Mcl-1 siRNA loaded niosomes: Ethanol injection method was employed to prepare blank niosomes, which were then separately incubated with FAM-siRNA and Mcl-1 siRNA to form FAM-siRNA and Mcl-1 siRNA loaded niosomes through electrostatic interaction for 30 min. Malvern apparatus was used to determine the average particle size and zeta potential of blank niosomes and siRNA loaded niosomes. The encapsulation efficiency and in vitro release profile of siRNA were determined by centrifugal ultrafiltration-fluorescence spectrophotometry method. HepG2 cells were divided into groups A, B, C, and D for 24-hour cultivation, then groups C and D were treated with FAM-siRNA loaded niosomes and FAM-siRNA loaded Lipofectamin, respectively. Group B was exposed to equivalent free FAM-siRNA, while group A was subjected to no disposal. After 6-hour incubation, cellular uptake of FAM-siRNA in HepG2 cells was examined. ②The inhibitory effect of transfection of Mcl-1 siRNA loaded niosomes on HepG2 cells: Cells in logarithmic phase were divided into groups 1, 2, 3, 4, and 5 and were seeded at a density of 5×105per well for cultivation. At 24 h, cells in the groups 1, 2, 3, and 4 were treated with free Mcl-1 siRNA, FAM-siRNA loaded niosomes, Mcl-1 siRNA loaded niosomes, and Mcl-1 siRNA loaded Lipofectamin for 6 h, respectively. After another 72 h, Mcl-1 protein of cells in each group was detected. HepG2 cells were divided into groups a, b, c, d and the control group, and were treated as previously mentioned. The final concentration of siRNA of each group was at a gradient of 1, 10, 50, 100, and 200 nmol/L. The growth of cells was examined and cell viability was calculated. Results The particle size of blank niosomes was smaller while its zeta potential was larger as compared with FAM-siRNA loaded niosomes (allP<0.01). The encapsulation efficiency of FAM-siRNA was 82.3%±2.1%. The in vitro cumulative FAM-siRNA release rates of FAM-siRNA loaded noisomes at 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, and 96 h were 13.5%±2.8%, 26.1%±1.6%, 38.0%±2.9%, 50.6%±2.3%, 56.8%±2.9%, 59.9%±2.3%, 63.3%±2.0%, 65.0%±2.7%, 67.2%±2.9%, respectively. Compared with group B, cellular uptake of FAM-siRNA in groups C and D was better. The Mcl-1 protein expression levels of groups 1, 2, 3, 4 and 5 were 102.0±4.9, 103.8±8.3, 25.2±3.7, 29.4±6.4, and 96.1±5.8, respectively. Obviously, the level of group 3 was significantly less than that of groups 1, 2, and 5 (allP<0.01). Cell viability of groups c and d was significantly higher that that of groups a and b, meanwhile, the cell viability of group d was higher than that of group c (allP<0.01).Conclusion We successfully prepare Mcl-1 siRNA loaded niosomes and the expression of Mcl-1 protein is low expressed in HepG2 cells, and HepG2 cells are inhibited after transfection of Mcl-1 siRNA loaded niosomes.

myeloid cell leukemia-1; small interfering RNA; RNA interference; niosomes; liver carcinoma; cell viability

王紹軍(1978-)，男，中級(jí)藥師，主要研究方向?yàn)槟[瘤基礎(chǔ)與臨床治療研究。E-mail： sjwang2015@126.com

簡(jiǎn)介：趙趕(1961-)，男，副主任藥師，主要研究方向?yàn)槟[瘤基礎(chǔ)與臨床治療研究。E-mail： slys2015@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.002

R734.2

A

1002-266X(2016)39-0005-04

2016-04-19)