錢家樹 林學(xué)正 盧光濤

小潮氣量高頻機(jī)械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷和炎癥因子的影響

錢家樹 林學(xué)正 盧光濤

目的 觀察小潮氣量高頻機(jī)械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷和炎癥因子的影響。方法成年雄性C57BL/6N小鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病+機(jī)械通氣組（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸組（Dia-SB）、正常對照+機(jī)械通氣組（Con-MV）和正常對照+自主呼吸組（Con-SB組），各10只。檢測各組小鼠血漿腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織勻漿TNF-α、IL-6和IL-10表達(dá)量。改良組織學(xué)評分系統(tǒng)評估肺損傷程度。結(jié)果 與治療前相比，Dia-MV組血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平隨通氣持續(xù)時間逐漸增加，而Con-SB組無顯著變化。肺勻漿上述促炎細(xì)胞因子定量RT-PCR分析與血漿結(jié)果類似。Dia-MV組血漿SOD活性隨著機(jī)械通氣進(jìn)行降低，MDA水平增加。肺勻漿SOD/MDA定量RT-PCR分析與血漿結(jié)果類似。與Con-SB組[（0.64±0.05）分]相比，Dia-MV組[（3.83±0.34）分，P＜0.05）]、Dia-SB組[（2.11±0.20）分，P＜0.05]、Con-MV[（1.98±0.18）分，P＜0.05]肺損傷評分增加。結(jié)論 小潮氣量高頻機(jī)械通氣增加糖尿病模型小鼠肺損傷。

小鼠；糖尿??；機(jī)械通氣；小潮氣量；肺損傷；TNF-α；IL-6；IL-10

機(jī)械通氣（mechanical ventilation，MV）是用于全身麻醉的必要的呼吸支持方法。不適當(dāng)?shù)耐?，特別是高潮氣量通氣可導(dǎo)致肺損傷，其特征在于增加肺血管通透性和促使炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[1]。與傳統(tǒng)的通氣方法相比，小潮氣量通氣策略具有低潮氣量和平臺壓力，能夠降低機(jī)械通氣過程中肺損傷發(fā)生幾率[2]。近年來，越來越多的證據(jù)表明糖尿病與肺損傷密切相關(guān)[3-5]，在慢性高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞外基質(zhì)沉積和肺纖維化，導(dǎo)致肺泡氣體與血液交換障礙。糖尿病對小潮氣量機(jī)械通氣策略下肺功能的影響尚不清楚。本研究通過建立糖尿病動物模型，運(yùn)用小潮氣量高頻率通氣策略，檢測炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)和血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平，探討小潮氣量高頻機(jī)械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 成年雄性C57BL/6N小鼠（50～60g）40只，來自溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK-20120031。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：糖尿病+機(jī)械通氣組（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸組（Dia-SB）、正常對照+機(jī)械通氣組（Con-MV）、正常對照+自主呼吸組（Con-SB組），各10只。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 糖尿病動物模型制作 C57BL/6N小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2天，糖尿病+機(jī)械通氣組（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸組（Dia-SB）予脂類誘導(dǎo)飼料喂養(yǎng)4周后，予鏈脲佐菌素（STZ）溶于檸檬酸緩沖液（pH4.3，0.1mol/L）30mg/kg一次性腹腔注射，繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)2周后禁食8h，按2g/kg灌服20%葡萄糖溶液，做口服糖耐量試驗(yàn)，0min和120min血糖分別＞7.0mmol/L和11.0mmol/L為造模成功[6]。

1.3 機(jī)械通氣 使用動物呼吸機(jī)對Dia-MV和Con-MV組小鼠進(jìn)行4h高頻低潮氣量機(jī)械通氣，參數(shù)設(shè)置如下：潮氣量8mL/kg，呼吸頻率150次/分鐘，吸氣氧分?jǐn)?shù)0.35。同時，將Dia-SB和Con-SB兩組小鼠暴露于室內(nèi)空氣中自主呼吸4h。在實(shí)驗(yàn)過程中，使用多通道生理記錄儀連續(xù)監(jiān)測氧飽和度、血壓和心率，并且輸注林格氏溶液（8～10mL/h）以補(bǔ)充液體損失并將血壓保持在正常范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)開始后每小時從左頸動脈獲得血液樣品以分析血清參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束斷頭處死小鼠，取肺組織標(biāo)本備用。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 （1）采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，比色法檢測超氧化物歧化酶（SOD）/丙二醛（MDA）水平。（2）RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織 TNF-α、IL-6和IL-10相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)后取左肺組織100mg勻漿，采用Trizol試劑盒（上海生物工程技術(shù)有限公司）抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。目標(biāo)基因是與內(nèi)參GAPDH基因檢測的引物（Invitrogen公司提供），序列為：Primer 1（Forward，5′→3′）；Primer 2（Reverse，5′→3′）GAPDH TGAAGGTCGGTGTGAAC GGATTTG GTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGTC；IL-6 GCACCCACTTCAAGCTCCA AAATTTGAAGGTGAGCATCCTG；IL-10 TGCCTTCAGCCAGGTGAAACTTT C CTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTCTG；TNF-α AT ACCAACTATTGCTTCAGCTCCACAG GTACTGTGTG TCCAGGCTCCAAATAT；IL-1β GCACAGTATTGAAA GCCTAGAAAGTCGGTAGAAAGAGATAATCTGCTC TG。（3）肺組織病理學(xué)評估：中性粒細(xì)胞計數(shù)（PMN）、濕/干重比（W/D）和肺損傷評分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取左肺部分肺葉，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，嵌入石蠟包埋，連續(xù)切片厚約4μm。HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。肺損傷程度采用改良組織學(xué)評分系統(tǒng)[11]進(jìn)行評估：①肺泡壁厚度；②炎性細(xì)胞浸潤、聚集；③出血。每一項(xiàng)按以下五點(diǎn)進(jìn)行分級：0為最小傷害，1為輕度損傷，2為中度損傷，3為重度損傷，4為最大損傷。肺損傷程度0～12分。中性粒細(xì)胞計數(shù)用來評估中性粒細(xì)胞浸潤的程度，隨機(jī)選擇十個區(qū)域，計算每高倍視野肺泡（HPF，400×）的中性粒細(xì)胞數(shù)，取平均值。取右肺上葉樣品進(jìn)行稱重，然后置60℃烤箱中，24h后再次稱重，計算濕/干重比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間總體比較采用雙因素方差分析，組間各時間點(diǎn)參數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿和肺組織勻漿炎癥因子比較 機(jī)械通氣前，Dia-MV組和Dia-SB組血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平高于Con-MV組和Con-SB組，機(jī)械通氣后，Dia-MV組上述指標(biāo)高于其它三組（P＜0.05）。與治療前相比，Dia-MV組血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平隨著通氣持續(xù)時間逐漸增加，而Con-SB組無明顯變化（圖1A～C，插頁）。肺勻漿中上述促炎細(xì)胞因子的定量RT-PCR分析顯示與血漿結(jié)果類似（P＜0.05）（圖2，插頁）。

2.2 血漿和肺組織勻漿氧化應(yīng)激參數(shù)比較 機(jī)械通氣前，Dia-MV和Dia-SB組血漿 SOD活性低于Con-MV組和Con-SB組，而MDA水平則呈反向趨勢。Dia-MV組血漿SOD活性隨著機(jī)械通氣進(jìn)行降低，MDA 水平則增加（圖 1D～E，插頁）。Con-SB 組中未發(fā)現(xiàn)MDA水平和SOD活性的顯著變化。肺勻漿SOD/MDA定量RT-PCR分析顯示與血漿結(jié)果類似（P＜0.05）（圖 2，插頁）。

2.3 肺組織病理學(xué)改變及肺損傷評分 與Con-SB組[（0.64±0.05）分]相比，Dia-MV組[（3.83±0.34）分，P＜0.05]、Dia-SB組[（2.11±0.20）分，P＜0.05]、Con-MV[（1.98±0.18）分，P＜0.05]肺損傷評分增加（圖3，插頁）。Dia-MV組中的肺組織可見間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡破裂出血，而在Dia-SB組或Con-MV組中僅發(fā)現(xiàn)輕微的肺微觀結(jié)構(gòu)變化。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病增加低潮氣量高頻通氣小鼠肺損傷，可能與炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10增加和機(jī)體氧化應(yīng)激平衡被打破有關(guān)。低潮氣量（6mL/kg）和低平臺壓力保護(hù)性機(jī)械通氣策略被證明可減少急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者肺損傷，降低死亡率[7-8]。本研究對象為小鼠，為了避免通氣不足使用潮氣量8mL/kg和頻率150次/min行機(jī)械通氣。

有證據(jù)表明DM與肺損傷密切相關(guān)，研究[9-11]認(rèn)為，在慢性高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞外基質(zhì)沉積和肺纖維化是糖尿病肺損傷病變的早期病理特征，但導(dǎo)致DM患者肺功能下降的主要原因是肺泡氣體與血液交換障礙[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著機(jī)械通氣時間增加，血漿炎性細(xì)胞因子和MDA顯著增加，SOD水平降低，肺組織勻漿定量RT-PCR分析顯示類似的結(jié)果。糖尿病小鼠機(jī)械通氣4h后肺部可見間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡破裂或出血，肺損傷評分顯著高于其他組（P＜0.05），而非糖尿病小鼠對機(jī)械通氣耐受性較好。這一結(jié)果與 Zarogoulidis 等[13]、Klein 等[14]和 Mirrakhimov[15]學(xué)者的調(diào)查結(jié)果相同，上述研究經(jīng)過大樣本的追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期高血糖患者肺功能下降與炎癥因子釋放呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的相關(guān)。另外的橫向比較研究還發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血液中血糖水平、炎癥因子與未來發(fā)生肺功能下降的風(fēng)險呈正相關(guān)[16]。

在糖尿病小鼠機(jī)械通氣肺損傷發(fā)病過程中，除了上述高血糖引起的肺組織微結(jié)構(gòu)性病變外，氧化應(yīng)激平衡被打破也是重要原因之一[17]。在本研究中，隨著機(jī)械通氣時間延長，反應(yīng)脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)MDA水平增加，而抗氧化指標(biāo)SOD則減少，可見糖尿病小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激平衡更容易被機(jī)械通氣破壞。氧自由基是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，與肺毛細(xì)管基底膜結(jié)合，從而損害肺毛細(xì)血管屏障通透性。在糖尿病影響下，除了葡萄糖可以自然氧化生成氧自由基外，NOS、NAD（P）H氧化酶和黃嘌呤氧化酶等多種活性物質(zhì)也會導(dǎo)致氧自由基增加[18-20]。此外，線粒體呼吸鏈已被視為非酶生成氧自由基的另一個來源。糖尿病抑制了內(nèi)源性抗氧化酶，包括谷胱甘肽、SOD、過氧化氫酶，從而影響活性氧的激活。

總之，低潮氣量和高頻保護(hù)性機(jī)械通氣策略，仍能增加糖尿病模型小鼠炎癥反應(yīng)和相關(guān)肺損傷，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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第五次世界中西醫(yī)結(jié)合大會第三輪會議征文通知

世界中西醫(yī)結(jié)合大會，每五年召開一次，已成功舉辦4次。第五次世界中西醫(yī)結(jié)合大會將于2017年12月7日—10日在廣州白云國際會議中心召開。本次大會的主題是“弘揚(yáng)結(jié)合醫(yī)學(xué)成果，服務(wù)人類健康”。大會由中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會主辦，廣東省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會、廣東藥科大學(xué)承辦，會議將全面展示近五年世界結(jié)合醫(yī)學(xué)（包括中西醫(yī)結(jié)合）的最新成果和研究進(jìn)展，并邀請國內(nèi)外著名專家學(xué)者進(jìn)行精彩報告，通過相互交流和共同提高，促進(jìn)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新?，F(xiàn)將征文相關(guān)事宜通知如下：

1、征文內(nèi)容（1）中西醫(yī)結(jié)合理論研究，包括對結(jié)合醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)地位與作用的認(rèn)識，對新形勢下發(fā)展結(jié)合醫(yī)學(xué)的思路、途徑和方法的理論探討與經(jīng)驗(yàn)總結(jié)等；（2）近五年來結(jié)合醫(yī)學(xué)在臨床研究、基礎(chǔ)研究、藥學(xué)研究、教學(xué)研究、學(xué)科建設(shè)、政策研究等方面取得的重要成果和寶貴經(jīng)驗(yàn)；（3）結(jié)合醫(yī)學(xué)各臨床專業(yè)學(xué)科新診療經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)和分析，中西醫(yī)結(jié)合新技術(shù)、新方法的推介與評價，以及實(shí)現(xiàn)科研成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的新經(jīng)驗(yàn)與新模式；（4）中西醫(yī)結(jié)合優(yōu)勢病種臨床診療路徑的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與臨床共性問題的探討，中西醫(yī)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化研究等；（5）結(jié)合醫(yī)學(xué)的未來研究，以及其他促進(jìn)結(jié)合醫(yī)學(xué)發(fā)展的相關(guān)研究等。

2、征文要求（1）向本次大會所提交的論文應(yīng)為未正式發(fā)表的論文。論文要求突出科學(xué)性、先進(jìn)性、實(shí)用性、原創(chuàng)性，論據(jù)充分，對專業(yè)實(shí)踐和行業(yè)管理具有一定的指導(dǎo)意義；（2）論文需提交中、英文摘要（800～1000字），欲了解更詳細(xì)的論文格式要求，請登錄世界中西醫(yī)結(jié)合大會網(wǎng)站www.wimco2017.com；（3）投稿前請在投稿網(wǎng)站詳細(xì)填寫“新用戶注冊信息”，務(wù)必注明作者所屬專業(yè)委員會（專業(yè)）、工作單位、職務(wù)職稱、通訊地址、電子郵箱和手機(jī)號碼等信息。

3、聯(lián)系方式地址：北京市東直門內(nèi)南小街16號 郵編：100700 電話：010-64093165 010-64025672 聯(lián)系人：孔令青李亮平 趙蓬悅 010-59001126 13810810901

中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會

2017年7月19日

The ProtectiveMechanical Ventilation Strategy Based on Low Tidal Volumes and High FrequencyIncreases Lung Injury in Diabetes Mice

QIAN Jiashu,LIN Xuezheng,LU Guangtao.

Department of Anesthesiology,Taizhou Central Hospital(TaiZhou University Hospital),Taizhou(318000),China

ObjectiveTo investigate the effects of protective mechanical ventilation（MV） strategyon inflammation and lung injury in mice withdiabetes.MethodsForty C57BL/6N mice were randomly divided two groups:diabetic model was established in 20 mice and then subdivided into MVgroup（Dia+MV group）and spontaneous respiratory（SB） group（Dia+SB group）,with 10 mice in each;another 20 normal mice served as controls,which were also subdivided into Con+MV group and Con-SB group,with 10mice in each.Tumor necrosis factor-α（TNF-α）,interleukin-6（IL-6）,interleukin-10（IL-10）,superoxide dismutase（SOD） and malondialdehyde（MDA） levels in serum were detected and the expression of inflammatory cytokine mRNA was also determined in lung tissue.Lung damage was assessed using a modified lung injury score.ResultsCompared to baseline values,the serum levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 were gradually increased over ventilation duration in Dia-MV group,while no similar results were observed in con-SB group.The activities of serum SOD decreased and MDA levels were conversely increased along with ventilation duration in Dia-MV group.Quantitative RT-PCR analysis of pro-inflammatory cytokines in lung homogenates presented similar results.The modified lung injury score was higher in Dia-MV group,Dia-SB group and Con-MV group as compared to that in Con-SB group（3.83±0.34,2.11±0.20,2.11±0.20 vs 0.64±0.05,P＜0.05）.ConclusionThe protectivemechanical ventilation strategy based on low tidal volumes and high frequency increased the inflammation reaction and associated lung injury in diabetic mice.

mice;diabetes;mechanical ventilation;low tidal volume;lung injury;TNF-α;IL-6;IL-10

浙江省臺州市中心醫(yī)院（臺州學(xué)院附屬醫(yī)院）麻醉科（臺州318000）

錢家樹，Email：2793913132@qq.com；Tel：13906631675

（收稿：2017-04-20 修回：2017-06-10）