魏巍 趙曉亮 蘇延軍 尤健 張真發(fā) 王勐 宮立群 張振 張彬 王長利

·臨床研究與應(yīng)用·

WNT5A與小細(xì)胞肺癌臨床特征的相關(guān)性研究及其對細(xì)胞遷移作用的影響*

魏巍 趙曉亮 蘇延軍 尤健 張真發(fā) 王勐 宮立群 張振 張彬 王長利

目的：檢測WNT5A在小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）中的表達(dá)及其促細(xì)胞遷移作用的機制。方法：采用免疫組化的方法檢測79例SCLC和25例正常肺組織中WNT5A的表達(dá)量。通過細(xì)胞劃痕和Transwell小室檢測WNT5A及JNK對SCLC細(xì)胞系DMS153遷移能力的作用，應(yīng)用Western blot檢測干擾WNT5A后磷酸化JNK含量的變化。結(jié)果：WNT5A在SCLC中表達(dá)高于正常肺組織，并且與腫瘤的臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，WNT5A的表達(dá)與神經(jīng)元特性烯醇化酶（NSE）、胃泌素釋放肽前體（Pro-GRP）也有明顯相關(guān)性。干擾WNT5A導(dǎo)致DMS153遷移能力下降，應(yīng)用JNK抑制劑SP600125能夠阻止WNT5A造成的細(xì)胞遷移增加。結(jié)論：WNT5A在SCLC中高表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，WNT5A通過磷酸化JNK促進(jìn)SCLC細(xì)胞遷移，并且可以作為SCLC的預(yù)測指標(biāo)和治療靶點。

小細(xì)胞肺癌 WNT5A JNK 細(xì)胞遷移

肺癌是我國死亡率最高的惡性腫瘤，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung caner，SCLC）為其中的一種，約占15%左右［1］。SCLC侵襲性高、易復(fù)發(fā)，容易發(fā)生早期廣泛轉(zhuǎn)移。多數(shù)患者在初次就診時已處于疾病的廣泛期，僅約30%的患者處于局限期。雖然對放化療相對敏感，但SCLC的治愈率不高，中位生存期僅12～18個月，5年生存率＜10%［2］。雖然目前的治療手段可以為SCLC的治療提供一定幫助，但關(guān)于SCLC高轉(zhuǎn)移的機制仍然是困擾臨床工作和影響SCLC治療的一大難題。

WNT5A是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞自分泌型蛋白，WNT5A定位于3p14～p21區(qū)域。最近研究表明WNT5A的過度表達(dá)與惡性腫瘤的遷移、侵襲有著密切聯(lián)系［3-6］。其表達(dá)在不同的腫瘤具有差異性［7-12］。本研究對WNT5A在SCLC及正常肺組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測，分析WNT5A的表達(dá)與SCLC不同臨床病理特征的相關(guān)性，并對WNT5A促進(jìn)SCLC細(xì)胞系DMS153遷移及其作用機制進(jìn)行研究，為后續(xù)探索WNT5A是否可以成為預(yù)測SCLC轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物以及治療新的靶點提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象選取天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2010年8月至2015年7月臨床資料完整的SCLC石蠟標(biāo)本作為研究對象共79例。其中男性55例，女性24例。年齡41～82歲，平均年齡60.3歲。腫瘤TNM分期Ⅰ期24例、Ⅱ期18例、Ⅲ期16例、Ⅳ期21例。所有病例通過手術(shù)、氣管鏡、穿刺獲得病理標(biāo)本并確診為單純性SCLC，取得病理前均未進(jìn)行過抗腫瘤治療，治療前均已簽署知情同意書，同時選取25例正常肺組織石蠟標(biāo)本作為對照。

1.1.2 細(xì)胞、抗體及試劑SCLC細(xì)胞系DMS153購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫，小鼠抗人WNT5A抗體（購自美國Abcam公司），JNK抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司），磷酸化Thr 183和Tyr 185位點的p-JNK抗體（購自美國Cell Signaling Technology公司），重組人源WNT5A（rhWNT5A，購自臺灣Abno?va公司），JNK抑制劑SP600125（購自美國Cayman公司）

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)將SCLC石蠟標(biāo)本以4 μm的厚度進(jìn)行切片，貼敷于載玻片上70℃恒溫過夜，經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水，組織浸泡在3%的H2O210 min，消除內(nèi)源過氧化物酶活性，PBS清洗后于pH6.0的枸櫞酸溶液中，微波加熱至沸騰20 min，用1%的血清工作液滴在組織片上封閉，室溫孵育30 min。加入WNT5A抗體（1:200）4℃過夜，PBS清洗后后滴加HRP羊抗小鼠/兔二抗工作液，室溫2 h，DAB室溫下顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化氨水反藍(lán)，脫水透明后封片，顯微鏡下觀察記錄結(jié)果并保存圖像。

1.2.2 免疫組織化學(xué)半定量分析免疫組織化學(xué)中WNT5A在SCLC中的表達(dá)，根據(jù)染色的強度以及陽性細(xì)胞百分比例計算，其中強度得分由免疫組化的染色強度評分為：0：無染色，1：淺染色，2：中等染色，3：強染色。陽性細(xì)胞比例分為：0：無陽性細(xì)胞，1：陽性細(xì)胞＜10%，2：陽性細(xì)胞10%～50%，3：陽性細(xì)胞＞50%。染色總分=強度得分×比例得分（0～9分）。其中總分＜4分定義為低表達(dá)，總分≥4分定義為高表達(dá)。所有切片染色結(jié)果均由2名病理醫(yī)師獨立評分。1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用含10%胎牛血清及1%雙抗的MEM（NEAA）培養(yǎng)基進(jìn)行DMS153培養(yǎng)，細(xì)胞放置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中，按1:3的方式傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗操作。

1.2.4 細(xì)胞劃痕及Transwell實驗細(xì)胞劃痕實驗為取對數(shù)生長期的DMS153細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)80%匯合度時劃一直線，拍照并標(biāo)記拍照位置，按實驗要求進(jìn)行處理，并于處理后24 h進(jìn)行照像。Transwell實驗同樣取對數(shù)生長的DMS153細(xì)胞，按1× 105/mL的密度接種于Transwell小室上層，下層按實驗設(shè)計加入含不同添加物的MEM（NEAA）培養(yǎng)基，其中外源rhWNT5A的添加濃度為500 ng/mL，SP600125添加后的終濃度為80 μM。

1.2.5 小干擾RNA的構(gòu)建通過應(yīng)用美國invitrogen公司網(wǎng)站中RNAi軟件（https：//rnai designer.invitrogen.com/ rnaiexpress/index.jsp）設(shè)計人WNT5A基因（MGC：71588 IMAGE：30346200）的干擾RNA片段：Si-WNT5A：（5′-GCTGGAAGTGCAATGTCTT-3′），Si-Ctrl：（5′-GGGCTA AGCGTAATCTGTT-3′）。應(yīng)用lipofectamine 2000對DMS153細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每2×105個細(xì)胞加入5 μL的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，為了提高轉(zhuǎn)染效率，siRNA-WNT5A在第一次轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)染。48 h后通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率取對數(shù)生長期的DMS153細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合程度達(dá)80%按實驗要求進(jìn)行處理完成細(xì)胞后應(yīng)用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。按10%SDS-PAGE配制凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后應(yīng)用5%脫脂牛奶封閉，1抗封閉過夜（WNT5A抗體濃度為1:1 000，JNK抗體濃度為1:800，p-JNK抗體濃度為1:1 000）。顯色液顯色，暗室曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各臨床病理特征中WNT5A表達(dá)的比較應(yīng)用卡方檢驗。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析及獨立t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WNT5A在SCLC組織中的表達(dá)

WNT5A在SCLC組織中表達(dá)明顯高于正常肺組織（圖1A），其中在SCLC組織中表達(dá)評分為4.52± 0.33，而正常肺組織僅為0.40±0.12。表達(dá)率為差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.68，P＜0.001）。在SCLC組織中，WNT5A表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞間質(zhì)中也可見表達(dá)，而細(xì)胞核中無表達(dá)（圖1B）。

2.2 SCLC組織中WNT5A的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

SCLC中WNT5A的表達(dá)在性別，年齡，吸煙指數(shù)，腫瘤生長部位，腫瘤大小等方面無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。并且對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)WNT5A的表達(dá)在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而是否為N1或N2轉(zhuǎn)移則無顯著差異（P＞0.05）。并且NSE及Pro-GRP異常升高的病例WNT5A的表達(dá)也較高（P＜0.05，表1）。

2.3 WNT5A對SCLC細(xì)胞DMS153遷移能力的影響

SiRNA干擾后通過Western blot檢測WNT5A的干擾效率大約下降為對照組的30%（圖2A）。細(xì)胞劃痕和Transwell實驗結(jié)果顯示干擾WNT5A可以導(dǎo)致DMS153遷移能力下降近50%（圖2B、C）。

2.4 WNT5A通過磷酸化JNK促進(jìn)DMS153的遷移

添加500 ng/mL的外源性WNT5A（rhWNT5A）導(dǎo)致DMS153細(xì)胞遷移能力提升。而加入JNK抑制劑SP600125后，雖然繼續(xù)給與rhWNTA仍不能增加DMS153的遷移能力（圖3A，B）。并且在干擾WNT5A的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)JNK的磷酸化水平明顯下降，而非磷酸化JNK的表達(dá)水平無明顯變化（圖3C）。

圖1 WNT5A在小細(xì)胞肺癌及正常肺組織中的表達(dá)Figure 1Expression of WNT5A in small cell lung cancer and normal lung tissues

表1 小細(xì)胞肺癌組織中WNT5A的表達(dá)與患者的臨床特征的關(guān)系Table 1Association between the expression of WNT5A in SCLC and clinical characteristics of patients

表1 小細(xì)胞肺癌組織中WNT5A的表達(dá)與患者的臨床特征的關(guān)系（續(xù)表1）Table 1Association between the expression of WNT5A in SCLC and clinical characteristics of patients

圖2 干擾WNT5A的表達(dá)抑制SCLC細(xì)胞DMS153的遷移Figure 2Knockdown of WNT5A inhibit immigration of DMS153

圖3 WNT5A通過激活JNK促進(jìn)DMS153細(xì)胞的遷移Figure 3WNT5A modulates the DMS153 cell migration by regulating p-JNK

3 討論

SCLC高度惡性，極易早期轉(zhuǎn)移，其中局限期患者約占40%，中位生存期18～23個月，廣泛期約占60%，中位生存期7～12個月［1］。大部分患者在2年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，因此探索SCLC轉(zhuǎn)移的機制，鑒定SCLC轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子以及針對性的靶向治療對提高SCLC的治療效果具有重要意義。

WNT5A作為WNT家族成員之一，在近年的腫瘤研究中成為重點。在不同腫瘤細(xì)胞中WNT5A的表達(dá)及作用相反，在結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、導(dǎo)管型乳腺癌和白血病中，WNT5A處于低表達(dá)狀態(tài)［8-9］，下調(diào)WNT5A與腫瘤的病理分級有關(guān)，并且可以作為獨立的影響預(yù)后的因素［9］，失活的WNT5A才能有利于腫瘤進(jìn)展。但另一方面高度表達(dá)的WNT5A被檢測出在惡性黑色素瘤、乳腺細(xì)胞癌、胃癌和前列腺癌中表達(dá)［10］。WNT5A的表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)，并且可以作為黑色素瘤患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后的獨立因素［11-13］。在肺癌方面，Huang等［14］發(fā)現(xiàn)WNT5A在SCLC中處于高表達(dá)狀態(tài)，并且高表達(dá)WNT5A與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，Lu等［15］發(fā)現(xiàn)WNT5A高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良，Yao等［16］發(fā)現(xiàn)WNT5A促進(jìn)肺癌的腫瘤血管生成。本實驗中，WNT5A在SCLC組織中的表達(dá)升高，并且與腫瘤的淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。提示W(wǎng)NT5A在SCLC組織中的表達(dá)增高可能促進(jìn)腫瘤的淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

NSE和Pro-GRP是近年來常規(guī)用于SCLC檢測的標(biāo)志物，在早期診斷、療效評價、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判斷中有重要的作用。本實驗中WNT5A與NSE及Pro-GRP的表達(dá)一致，WNT5A聯(lián)合NSE或Pro-GRP可能進(jìn)一步提高SCLC的檢測敏感性。

細(xì)胞遷移是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要過程。WNT5A作為遷移促進(jìn)因子發(fā)揮重要作用，與其他成員相比，Wnt5a缺乏轉(zhuǎn)化活性，通過非經(jīng)典通路來影響腫瘤的形成與發(fā)展，并且由于基因突變少見，目前有關(guān)WNT5A在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究方向主要集中于該基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的改變。WNT5A可以通過Ror2促進(jìn)偽足形成和肌動蛋白重構(gòu)，并且刺激了黏附依賴性遷移和侵襲［17］。有報道發(fā)現(xiàn)WNT5A作為CUTL1下游分子促進(jìn)胰腺癌的侵襲和遷移，并且可以通過活化PKC激活惡性黑色素瘤的能動性［4］。而且，WNT5A可以啟動Vimentin來激活轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail，導(dǎo)致E-cadherin下調(diào)和MMP-2產(chǎn)生，并且可以通過誘導(dǎo)EMT過程促進(jìn)黑色素瘤轉(zhuǎn)移［5］。在胃癌細(xì)胞中WNT5A可以通過激活黏著斑和小GTP結(jié)合蛋白Rac的形成，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲［18］。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)WNT5A也可以通過JNK激活樁蛋白Paxillin通路介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的遷移［6］。本研究中，經(jīng)SiRNA干擾后，JNK磷酸化水平下降，DMS153遷移能力下降。抑制JNK可以阻斷WNT5A誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移過程。說明WNT5A通過磷酸化JNK促進(jìn)DMS153的遷移。

綜上所述，WNT5A在SCLC組織中高表達(dá)，并且和腫瘤的淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。WNT5A/JNK信號通路促進(jìn)SCLC細(xì)胞遷移。WNT5A可能作為SCLC檢測的標(biāo)志物，對于WNT5A的抑制可能成為治療SCLC的新靶點。

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（2016-08-12收稿）

（2016-10-18修回）

（編輯：楊紅欣校對：鄭莉）

High expression of WNT5A in small cell lung cancer and promotion of cell migration by phosphorylation of JNK

Wei WEI,Xiaoliang ZHAO,Yanjun SU,Jian YOU,Zhenfa ZHANG,Meng WANG,Liqun GONG,Zhen ZHANG,Bin ZHANG,Changli WANG

Department of Lung Cancer,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81470137),Key Program for Anti-cancer Research of Tianjin Municipal Science and Technology Commission(12ZCDSY15400)and Natural Science Foundation of Tianjin Medical University(No.2014KY209)

Changli WANG;E-mail:wangchangli@medmail.com.cn

Objective:The expression of WNT5A is associated with aggressive tumor biology and poor clinical outcomes of various types of cancer.However,its function in the cell migration of small cell lung cancer(SCLC)should be elucidated.Methods:The expression of WNT5A in SCLC and normal lung tissues was detected by immunohistochemisty.The correlation between the expression and clinical characteristics of WNT5A was analyzed.The function of WNT5A in regulating cell migration was studied in DMS153 cell line in vitro.Small interfering RNA(SiRNA)was used to knock down WNT5A.Wound healing and Transwell tests were used to determine the migration rate of DMS153.The phosphorylated JNK expression was detected by Western blot analysis.Results:The WNT5A expression was higher in SCLC tissues than that of normal lung tissues.WNT5A was correlated with clinical stages,lymph nodes,and distance metastasis in SCLC.The high expression of WNT5A was accompanied by abnormal levels of NSE and Pro-GRP.The WNT5A phosphorylation of JNK promoted cell migration in vitro.Conclusion:The expression of WNT5A in SCLC is high and correlated with tumor metastasis.The influence of WNT5A/JNK on the cell migration property of DMS153 supports the concept that WNT5A can initiate the cell migration of SCLC,which suggested that WNT5A may be a marker and can be potentially used as an effective therapeutic target for the SCLC metastasis.

small cell lung cancer,WNT5A,JNK,cell migration

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.01.275

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院肺部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項目（編號：81470137），天津市抗癌重大專項（編號：12ZCDSY15400）和天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金項目（編號：2014KY209）資助

王長利wangchangli@medmail.com.cn

魏巍專業(yè)方向為肺癌早期診斷及治療的分子病理方面的研究。

E-mail：nkmsww@163.com