王曉韓 黃春華

(重慶市石柱縣畜牧獸醫(yī)局疫控中心，重慶 409100)

O型口蹄疫液相阻斷ELISA40份樣品布局檢測方法的探討

王曉韓 黃春華

(重慶市石柱縣畜牧獸醫(yī)局疫控中心，重慶 409100)

近來，石柱縣實施“以監(jiān)定免、以檢計酬”等三項制度的實施，免疫抗體質量受到廣泛關注，對于血清抗體檢測水平要求不斷提高，作為口蹄疫液相阻斷ELISA精確性、穩(wěn)定性遠遠高于正向間接血凝試驗，液相阻斷ELISA廣泛用于檢測牛、羊、和豬偶蹄動物血清中口蹄疫O型病毒抗體，動物疫苗免疫抗體定量檢測尤為廣泛。但液相阻斷ELISA試驗操作時間長、試驗過程比較煩瑣容易出現(xiàn)試驗結果偏差、不成梯度、試驗失敗等，因此只有熟練掌握操作步驟及注意事項，才能確保實驗的成立以及最小化的誤差。

O型口蹄疫 液相阻斷 檢測事項

1 40份樣品布局

血清樣品稀釋后，各孔加80ul抗原，混勻。

2 40份樣品布局的檢測方法

（1）用包被緩沖液稀釋O 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度（1：1000），在 ELISA 板上每孔加 50μl，振蕩，封板或置濕盒內，室溫過夜。

（2）抗原抗體（陰陽性對照血清及待檢血清）反應在U型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 將待檢 血清從1：4開始做2倍連續(xù)稀釋至 1：512。同時，按圖示稀釋陰陽性對照血清，然后每孔加入50 μl用 PBST 稀釋到使用濃度的O型口蹄疫病毒抗原（1：4，即1份病毒抗原、加3份PBST），病毒抗原對照孔加100μl。振蕩混勻，封板，4℃過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變?yōu)閺?：8開始的2倍稀釋。

（3）用洗滌液（1×PBST）洗 ELISA板5 次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應板上按次序轉移至ELISA板上的相對應孔，每孔50μl封板，37℃溫育1h。

（4）同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度（1：1000），每孔加50μl，封板，37℃溫育1h。

（5）同上洗板 5 次，甩干。用 l×PBST 稀釋兔抗豚鼠酶結合物至工作濃度（1：500），每孔加 50 μl封板，37 ℃溫育 1 小時。

（6）同上洗板5次，每孔加50μl底物溶液（務必加過氧化氫），37℃溫育15min。每孔再加50μl終止液終止反應，立即在492nm波長下讀取光吸收值（OD492nm值）。

3 40份樣品布局的注意事項

（1）在試驗前應仔細閱讀使用說明書，試劑盒使用前恢復室溫10～30min，尤其是冬天應讓試劑盒充分回溫，避免在通風口操作。

（2）應注意陰陽性和樣品加的量不一致，陰陽性為80μl，樣品為5μl，病毒抗原對照控加160μl。

（3）應注意口蹄疫O型病毒抗原的工作濃度，不同批次的抗原不能混用。

（4）封膜盡量一次使用，重復利用會應影響抗體滴度，包被板在反應時嚴禁重疊堆放，應平鋪板與板之間應有一定的間隙且不能離孵育箱太近。

（5）底物溶液使用前避光溶化，臨用時每1ml底物溶液加10μl本試劑盒配的3%的過氧化氫（H2O2），底物溶液加過氧化氫前為無色透明液體且避光保存，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，如出現(xiàn)變色，棄之不用。

（6）O型、亞洲I型和A型口蹄液相阻斷試劑盒的陽性血清起始濃度不一樣。

（7）每批次試劑顯色反應時間不一致，基本在5～15min之間，采用492nm讀取結果，過短或過長都會導致OD值超過或小于抗原平均值，所以應根據(jù)底物顯色情況，可以適當提前終止或延長終止時間，建議每批次試劑盒做比對試驗，以便更好掌握好反應時間。

陽性對照 陰性對照1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12樣品孔A(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80P+80S 80P+80S B(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 80 C(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80 D(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 E(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80 抗原孔F(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 抗原孔G(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80 抗原孔H(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 抗原孔