隋雨桐，李澤光，朱明雪，蘭辛鍵，閆起，梁華*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

四君子湯對(duì)自然衰老小鼠干預(yù)作用的代謝組學(xué)研究

隋雨桐1，李澤光2，朱明雪1，蘭辛鍵1，閆起1，梁華1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究四君子湯干預(yù)自然衰老小鼠內(nèi)源性代謝物的變化，探索與衰老密切相關(guān)的代謝物、代謝通路及其四君子湯調(diào)節(jié)作用。方法：選取自然衰老小鼠，檢測(cè)小鼠血清SOD、MDA及NO；利用UPLC-HDMS技術(shù)，對(duì)自然衰老小鼠血清進(jìn)行模式識(shí)別分析。結(jié)果：模型組小鼠血清SOD和NO含量顯著下降，MDA含量升高；四君子湯可顯著提高血清中SOD含量，顯著降低血清中MDA含量。確定25個(gè)可能與衰老相關(guān)的生物標(biāo)記物和3條代謝通路。發(fā)現(xiàn)四君子湯對(duì)一些標(biāo)記物如亮氨酸、血栓素、花生四烯酸、谷胱甘肽等，具有明顯的回調(diào)作用。結(jié)論：通過代謝組學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)四君子湯通過調(diào)節(jié)亮氨酸、血栓素、花生四烯酸、谷胱甘肽等標(biāo)記物，對(duì)衰老起到了干預(yù)作用。

衰老；代謝組學(xué)；四君子湯

代謝組學(xué)(metabolomics)效仿組學(xué)的研究思路，以機(jī)體代謝輪廓進(jìn)行分析為基礎(chǔ)，通過對(duì)內(nèi)源性小分子定性定量分析，研究機(jī)體被外界刺激后，小分子物質(zhì)的整體擾動(dòng)，探究生物體系的代謝途徑，其研究對(duì)象是小分子物質(zhì)[1]。“方證相關(guān)”是中醫(yī)辯證論治思想，指藥方與對(duì)應(yīng)病證具有高度的相關(guān)性[2]。“證”是對(duì)疾病過程中某一階段的病理狀態(tài)，也是人體代謝內(nèi)源性物質(zhì)變化的客觀反映。儀器測(cè)定并分析中藥方劑對(duì)代謝標(biāo)記物的影響是運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)語(yǔ)言表達(dá)中醫(yī)藥特性的新思路[3]。

衰老是生物體在生命后期階段所出現(xiàn)的全方面退化的過程[4]。中醫(yī)關(guān)于衰老有多種學(xué)說(shuō)，如臟腑虛衰學(xué)說(shuō)、陰陽(yáng)失調(diào)學(xué)說(shuō)、精氣虧耗等學(xué)說(shuō)[5-7]。四君子湯是由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成的經(jīng)典補(bǔ)益方，具有益氣健脾之功效。研究表明[8-9]四君子湯具有一定的抗衰老和延緩衰老作用。本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)的研究方法，對(duì)四君子湯干預(yù)作用下自然衰老小鼠血清內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)的變化進(jìn)行研究，探索與自然衰老密切相關(guān)的生物標(biāo)記物、代謝通路及四君子湯的干預(yù)作用，為四君子湯與衰老(氣虛證)相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

亮氨酸腦啡肽(SIGMA技術(shù)有限公司，美國(guó))；色譜甲醇(賽默飛世爾公司，美國(guó))；色譜乙腈(賽默飛世爾公司，美國(guó))；甲酸(北京迪馬科技?xì)W泰科技發(fā)展中心，中國(guó))；NO試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))。

1.2 儀器

Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀；Waters LCT Premier XE TOF質(zhì)譜儀；電子分析天平AL204(上海梅特勒托利多儀器有限公司，中國(guó))；微量移液器(上海新漢計(jì)量器具技術(shù)研究所，中國(guó))；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司，中國(guó))；漩渦混合器(其林貝爾儀器制造有限公司，中國(guó))。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雄性小鼠30只，3月齡雄性小鼠10只，12月齡雄性小鼠20只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度55%±15%，自由攝食飲水，于飼養(yǎng)籠適應(yīng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.4 藥品的制備

四君子湯：人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，甘草6 g。藥材由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供。煎液并濃縮藥液至100 mL，藥液濃度為0.33 g/mL，給藥體積為13 mL/kg，給藥劑量為4.29 g/kg，給藥時(shí)間為每日上午8：30～9:30，給藥30 d。

1.5 樣品采集與制備

將各組小鼠于給藥的第30天禁食。次日摘取眼球取血，靜置6 h，于4℃離心，3 500 rpm，15 min，取上清液，即為待測(cè)血清。置于-80℃冰箱備用。

自然解凍小鼠血樣，取200 μL血清，加入1 000 μL甲醇，渦旋3 min，于4℃離心，12 000 rpm，15 min，取上清液再重復(fù)該條件離心1次，取上清液200 μL，供UPLC-MS分析。

1.6 分析條件

1.6.1 液相條件

色譜柱Acquity UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1×50 mm Column)(Waters公司，美國(guó))；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；樣品倉(cāng)溫4℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-超純水溶液；梯度洗脫條件：0 min，2%A，98%B；15 min，100%A，0%B。

1.6.2 質(zhì)譜條件

正電噴霧離子源(ESI)：毛細(xì)管電壓1 300 V；樣本錐孔電壓60 V；負(fù)電噴霧離子源(ESI)：毛細(xì)管電壓1 500 V；樣本錐孔電壓70 V。

脫溶劑溫度350℃；離子源溫度110℃；脫溶劑氣體流速750 L/h；錐孔氣體流速20 L/h。準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用亮氨酸-腦啡肽溶液(Leucine-Enkephalin，[M+H]+556.2771)為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍為m/z：100～1 500。

1.7 數(shù)據(jù)處理

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerlynx V4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用Progenesis QI 2.1軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別及峰匹配，進(jìn)一步利用EZnifo軟件模塊對(duì)各組小鼠血液代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析、OPLS-DA分析等。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)研究

檢測(cè)小鼠血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)。模型組與空白組相比，模型組小鼠SOD含量降低，且具有極顯著差異(P<0.01)，NO含量降低，且具有顯著差異(P<0.05)，MDA含量升高，且具有極顯著差異(P<0.01)；治療組與模型組相比，小鼠血清中SOD含量升高，且具有極顯著差異(P<0.01)；MDA含量降低，且具有顯著差異(P<0.05)；NO含量升高，但差異不具有顯著性(見表1)。

表1 小鼠血清SOD、MDA及NO的測(cè)定結(jié)果

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 代謝組學(xué)研究

2.2.1 衰老小鼠血液生物標(biāo)記物的鑒定

將空白組和模型組血液樣本進(jìn)行正負(fù)離子模式全掃描，并對(duì)空白組和模型組小鼠血液代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，得到Score Plot 、VIP-Plot、S-Plot圖(圖1，2，3)，從而找到對(duì)代謝輪廓變化起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性代謝物?；赑值小于0.05作為篩查條件，對(duì)VIP貢獻(xiàn)值大于2的潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行分析，確定內(nèi)源性生物標(biāo)記物。采用UPLC-HDMS的方法檢測(cè)標(biāo)記物，在HMDB及KEGG等檢索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索并結(jié)合Progenesis QI 2.1軟件進(jìn)行化合物鑒定。共得出衰老相關(guān)的25個(gè)可能的潛在生物標(biāo)記物(見表2)。

圖1 空白組、模型組小鼠血清樣品OPLS-DA模式識(shí)別分析后Score Plot圖A.正離子模式；B.負(fù)離子模式

2.2.2 四君子湯體內(nèi)成分組方對(duì)衰老的調(diào)節(jié)作用

利用UPLC-HDMS得到空白組、模型組、治療組質(zhì)譜代謝輪廓圖，進(jìn)一步利用Progenesis QI 2.1軟件進(jìn)行質(zhì)譜離子信息獲取，將代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析 (圖4)，結(jié)果顯示組間區(qū)分良好，四君子湯干預(yù)組接近空白組并遠(yuǎn)離自然衰老模型組。在衰老模型小鼠血液25個(gè)生物標(biāo)記物中，治療組對(duì)其中7個(gè)具有調(diào)整作用，其中1個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別是L-Leucine、3L,7D,11D-Phytanic acid、Galactosylceramide (d18:1/14:0)、S-(PGA2)-glutathione、1,25-Dihydroxyvitamin D3-26,23-lactone、Ercalcitriol、3b,7a,12a-Trihydroxy-5a-Cholanoic acid(圖5)。將鑒定得到的血液7個(gè)具有調(diào)整作用的生物標(biāo)志物進(jìn)行MetPA分析，得到3個(gè)代謝通路，分別是Valine, leucine and isoleucine biosynthesis、Valine, leucine and isoleucine degradation、Aminoacyl-tRNA biosynthesis。以上結(jié)果說(shuō)明四君子湯對(duì)自然衰老相關(guān)代謝通路具有調(diào)節(jié)作用(圖6)。

圖2 空白組、模型組小鼠血液樣品OPLS-DA模式識(shí)別分析后VIP散點(diǎn)圖A.正離子模式；B.負(fù)離子模式

圖3 空白組、模型組小鼠血液樣品OPLS-DA模式識(shí)別分析后S-Plot圖A.正離子模式；B.負(fù)離子模式

Nom/zRtAdductsCompoundIDFormulaDescriptionTrendVIP1132.10191.36M+H,2M+HHMDB00687C6H13NO2L-Leucine↓2.282952330.336810.59M+NH4HMDB00553C20H40O23L,7D,11D-Phytanicacid↓3.794333400.343911.15M+NH4HMDB11544C23H42O4MG(0:0/20:2(11Z,14Z)/0:0)↓2.489854152.045912.52M+NaHMDB11664C9H7N3-Methylene-indolenine↓9.224715689.56213.65M+NH4HMDB12321C38H73NO8Galactosylceramide(d18:1/14:0)↑2.716666315.302514.2M+H,M+NH4,2M+HHMDB13648C18H35NO2PalmitoleoylEthanolamide↑2.691667319.287914.21M+NaHMDB03208C20H40OThromboxane↑2.619118635.445914.21M+NaHMDB07335C39H64O5DG(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)↑2.512079661.466514.36M+NaHMDB56176C41H66O5DG(16:1n7/0:0/22:6n3)↑2.1359910439.26946.12M+FA-H,2M-H,2M+FA-H,M-HHMDB12530C23H38O511-Hydroxyeicosatetraenoateglycerylester↑3.4773311453.28597.71M+FA-H,2M-H,M-HHMDB00505C24H40O5Allocholicacid↑3.6402312602.301510.19M-HHMDB60144C29H41N5O9Neocasomorphin(1-5)↓4.7523113629.321710.19M+FA-HHMDB02577C30H48O11Cholicacidglucuronide↓3.6807214295.227510.34M-H,M+FA-HHMDB04670C18H32O3Alpha-dimorphecolicacid↓2.7076715571.289710.5M+FA-HHMDB00739C24H40N5O8+Isodesmosine↓2.0896316343.229610.71M-H,M+FA-H,2M-HHMDB60049C22H32O34-HDoHE↓6.9117317319.228810.82M-H,M+FA-HHMDB02232C20H32O38,9-Epoxyeicosatrienocacid↓5.4494518819.549712.12M+FA-HHMDB10647C42H79O10PPG(18:2(9Z,12Z)/18:0)↓2.0395819640.291812.24M-HHMDB13062C30H47N3O10SS-(PGA2)-glutathione↑2.6716220887.552312.512M-HHMDB00969C27H40O51,25-DihydroxyvitaminD3-26,23-lactone↑2.5213321349.238313.25M+FA-H,2M-H,M-HHMDB01043C20H32O2Arachidonicacid↓2.6837322403.157113.252M+FA-HHMDB02030C6H13NO5Fructosamine↓2.4863423855.632414.062M-HHMDB06225C28H44O3Ercalcitriol↑2.4837224815.551814.192M-HHMDB00376C24H40O53b,7a,12a-Trihydroxy-5a-Cholanoicacid↑3.427125505.336614.35M+FA-HHMDB12555C29H48O413'-Carboxy-alpha-tocopherol↓2.9915

注：↑表示12月與3月比較，12月組表達(dá)水平較3月組上升，↓表示12月與3月比較，12月組表達(dá)水平較3月組下降

圖4 空白組、對(duì)照組及治療組小鼠血液樣品PCA模式識(shí)別分析后Score Plot圖A.正離子模式；B.負(fù)離子模式

圖5 空白組、模型組及治療組小鼠的血液生物學(xué)標(biāo)記物變化與3月空白組比較，*P<0.05，**P<0.01;與12月模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖6 基于MetPA對(duì)治療組小鼠具有調(diào)整作用的生物標(biāo)志物分析1.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成；2.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解;3.氨酰tRNA生物合成

3 討論

本研究選取自然衰老小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)MDA反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，能夠反映細(xì)胞損傷的程度。故MDA是評(píng)價(jià)衰老的臨床化學(xué)指標(biāo)之一。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，其作用是氧自由基清除劑，是機(jī)體老化狀態(tài)的客觀指標(biāo)，常用作于評(píng)價(jià)衰老的生化指標(biāo)[10]。NO是一種強(qiáng)氧化劑，在衰老過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]?；谒ダ涎趸瘬p傷學(xué)說(shuō)，將SOD與MDA作為衰老的臨床化學(xué)指標(biāo)。故進(jìn)一步測(cè)定小鼠血清中MDA、SOD、NO的含量，研究發(fā)現(xiàn)模型組與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠SOD、NO含量降低，MDA含量升高，說(shuō)明自然老化的模型小鼠可作為理想的測(cè)定衰老相關(guān)的臨床化學(xué)指標(biāo)動(dòng)物模型。在給予四君子湯進(jìn)行干預(yù)的小鼠血清中，干預(yù)組與模型組相比SOD、NO含量升高，MDA含量降低，說(shuō)明四君子湯能有效調(diào)節(jié)自然衰老造成的自由基紊亂和組織氧化程度，具有一定的干預(yù)衰老作用。

利用代謝組學(xué)的研究方法結(jié)合UPLC-HDMS技術(shù)對(duì)相關(guān)代謝生物標(biāo)記物進(jìn)行分析，通過四君子湯對(duì)自然衰老小鼠的內(nèi)源性代謝物的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與自然衰老相關(guān)的主要代謝生物標(biāo)記物。

亮氨酸是最有效的一種支鏈氨基酸，其主要作用是修復(fù)肌肉和控制血糖，同時(shí)為給機(jī)體提供能量。亮氨酸能夠有效保持肌肉功能、防止肌肉流失。研究表明老年人血漿中的氨基酸含量明顯降低，支鏈氨基酸含量降低尤為顯著。本研究中模型組亮氨酸較空白組含量極顯著性降低，推測(cè)在衰老模型中給身體組織提供能量作用減弱。

血栓素是一種類花生酸類物質(zhì)，能夠拮抗前列環(huán)素，具有血小板凝聚和血管收縮作用的主要血管活性物質(zhì)。研究顯示[14]隨著年齡的增加老化血管TP受體對(duì)血栓素的敏感性增強(qiáng)，血栓素發(fā)生相應(yīng)改變。在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組血栓素含量值較空白組極顯著性升高，表明小鼠體內(nèi)花生四烯酸代謝發(fā)生混亂，推測(cè)隨著小鼠的自然衰老，從而逐漸產(chǎn)生衰老性內(nèi)皮功能障礙，而四君子湯能夠調(diào)節(jié)血栓素含量，從而對(duì)衰老性內(nèi)皮功能障礙具有調(diào)節(jié)作用。

花生四烯酸是人體重要的不飽和脂肪酸，在機(jī)體血液、肝臟、肌肉等系統(tǒng)中起重要作用?；ㄉ南┧釋?duì)人體大腦智力發(fā)育和視敏度有著重要的作用，還能夠調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能，對(duì)人體心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有十分重要的作用。多不飽和脂肪酸在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持大腦正常功能方面都起著十分關(guān)鍵的作用，是衰老過程的重要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)[15]老年癡呆病患者機(jī)體內(nèi)花生四烯酸的含量降低。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)模型組小鼠的血液進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)花生四烯酸的含量降低，表明其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育合免疫系統(tǒng)受到抑制。

谷胱甘肽是人體必不可少的抗氧化劑，具有抗氧化和整合解毒作用。人體肝臟的谷胱甘肽能將機(jī)體的有害物質(zhì)排泄出體外，能幫助人體保持正常的免疫功能。谷胱甘肽在人體內(nèi)的生化防御作用是清除人體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的自由基，保護(hù)過多自由基會(huì)損傷的生物膜以及蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基。

將得到的7個(gè)具有調(diào)整作用的生物標(biāo)志物進(jìn)行MetPA分析，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這7個(gè)標(biāo)志物主要參與3條代謝通路，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解和氨酰tRNA生物合成。這些代謝通路在自然衰老小鼠體內(nèi)發(fā)生紊亂，而給予四君子湯后可使之逆轉(zhuǎn)并向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸，從代謝組學(xué)視角揭示了四君子湯對(duì)衰老的調(diào)節(jié)的整體性過程。該研究表明氨基酸代謝在衰老過程中扮演了重要角色，并且過氧化損傷及自由基代謝失衡是衰老的重要表征，四君子湯作為經(jīng)典補(bǔ)益方劑[16-17]，經(jīng)代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)四君子湯能夠改善衰老造成的氨基酸代謝紊亂，同時(shí)對(duì)自然衰老所造成的自由基代謝紊亂具有回調(diào)作用。

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Metabolism of Intervening Effect of Sijunzi Decoction on the Natural Aging Mice

SUI Yu-tong1，LI Ze-guang2,ZHU Ming-xue1，LAN Xin-jian1，YAN Qi1，LIANG Hua1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To study the changes of endogenous metabolites in natural aging mice by Sijunzi decoction, and to explore the metabolism, metabolic pathway and the regulative effect of Sijunzi decoction. Methods: Select natural aging mice and detect their serum SOD, MDA and NO; the serums of natural aging mice were identified by UPLC-HDMS technology. Results: The contents of SOD and NO in the model group were significantly decreased and MDA was increased; the contents of SOD in serums were significantly increased and MDA was significantly decreased by Sijunzi decoction. Identify 25 biomarkers and 3 metabolic pathways that might be associated with aging. Sijunzi decoction on some markers such as leucine, thromboxane, arachidonic acid and glutathione had an obviously callback effect. Conclusion: Through the research methods of metabolomics,Sijunzi decoction by regulating the leucine, thromboxane, arachidonic acid, glutathione and other markers of senescence has an interveningeffect.

Aging; Metabolomics; Sijunzi decoction

2016-07-08

2016-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473563)

隋雨桐(1988-)，男，博士研究生，研究方向:衰老及代謝相關(guān)疾病的方劑配伍規(guī)律。

*通訊作者：梁華(1962-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:衰老及營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)病癥的方劑配伍規(guī)律。

R289;R285.5

A

1002-2392(2017)01-0016-05