謝名君，焦亞斌，李環(huán)，林雨珊

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060)

中 藥 研 究

丹參飲精品中藥與普通中藥四種酚性成分的比較研究

謝名君，焦亞斌*，李環(huán)，林雨珊

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060)

目的：建立高效液相色譜法測定丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B的含量，比較丹參飲精品中藥與普通中藥上述四種成分的含量變化。方法：采用Genmini 5 μm C18110A(250 mm×4.60 mm,5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液為流動相，梯度洗脫,流速0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長288 nm，進(jìn)樣量15 μL。結(jié)果：在40 min內(nèi)，丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B四種酚性成分能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離，并且濃度與峰面積在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≤0.999 8。與普通中藥相比，丹參飲精品中藥中丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛和原兒茶酸含量明顯增加。 結(jié)論：該分析方法專屬性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證可用于測定丹參飲中四種酚性成分的含量。

高效液相色譜法；丹參飲；酚性成分

隨著生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，心血管疾病已經(jīng)成為危害人類健康的一大殺手，給國家和人民帶來沉重的負(fù)擔(dān)。丹參飲出自《時(shí)方歌括》，由丹參，檀香和砂仁組成，主治心痛、胃脘諸痛。方中丹參為君藥，活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，養(yǎng)血安神。檀香善行胸膈脾胃之氣，而砂仁行氣調(diào)中，和胃醒脾。三者合用，增強(qiáng)活血化瘀、行氣止痛的功效。近年來，丹參飲廣泛應(yīng)用于心血管疾病[1]如冠心病，心力衰竭，慢性肺源性心臟病等的治療，取得了確切的療效。本課題組[2]研究丹參飲精品中藥和普通中藥對動脈粥樣硬化(AS)大鼠藥理作用，丹參飲能明顯降低AS模型大鼠血脂，且丹參飲精品中藥好于丹參飲普通中藥。鑒于精品中藥和普通中藥丹參飲藥理作用上的差異，本課題利用高效液相色譜法，研究丹參飲藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，并比較丹參飲精品中藥和丹參飲普通中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)的區(qū)別。

1 儀器與試藥

Agilent LC 1260高效液相色譜儀(在洗脫氣機(jī) G1322A ；二元泵 G1312B； 自動控溫自動進(jìn)樣器 G1329B ；二極管陣列檢測器 G4212B)。CO-1000柱溫箱(武漢恒信儀器)；XS205分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；寶來陶瓷煎藥壺(廣興系列);SB 25-12DTDW超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

精品中藥丹參藥材(C2P063601，產(chǎn)地四川，深圳市和順堂本草藥業(yè)有限公司)；精品中藥檀香藥材(C2D037901，產(chǎn)地廣東，深圳市和順堂本草藥業(yè)有限公司)；精品中藥砂仁藥材(C2P063601，產(chǎn)地廣東，深圳市和順堂本草藥業(yè)有限公司)；普通中藥丹參藥材(130301，產(chǎn)地河北，深圳市康程醫(yī)藥有限公司)；普通中藥檀香藥材(130301，產(chǎn)地印度，深圳市康程醫(yī)藥有限公司)；普通中藥砂仁藥材(130301，產(chǎn)地廣東，深圳市康程醫(yī)藥有限公司)。

丹參素(對照品 HPLC≥98.0% 批號 ZY150419)，丹酚酸B(對照品 HPLC≥98.0% 批號 ZY150420)，原兒茶酸(對照品 HPLC≥98.0% 批號 ZY150829)，原兒茶醛(對照品 HPLC≥98.0% 批號 ZY150830)均購自上海譜振生物科技(克拉瑪爾?)。乙腈(色譜純，批號130325，YiRenDa)，甲醇(色譜純，批號20150623，天津永大化學(xué)試劑)，三氟乙酸(分析純，T818778，Lot#：C10029827，麥克林)

2 方法

2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的對照品適量，加70%甲醇水溶液制成濃度分別為0.248 3 mg/mL,0.011 49 mg/mL,0.012 77 mg/mL和1.050 mg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.2 供試品溶液的制備

取丹參藥材約90 g，砂仁約27 g，檀香約27 g，精密稱定。先將丹參藥材置于煎藥壺中，加入750 mL蒸餾水浸泡1 h，煎煮45 min后，加入約13.5 g砂仁和13.5 g檀香繼續(xù)煎煮15 min。將藥液用四層紗布過濾。然后補(bǔ)加600 mL蒸餾水煎煮45 min，將余下的砂仁和檀香加入煎藥壺中，補(bǔ)加150 mL蒸餾水繼續(xù)煎煮15 min，將藥液用紗布過濾，合并兩次藥液，得到丹參飲(3付藥的劑量)。然后取5 mL藥液至25 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，作為供試品溶液。置于4 ℃冰箱避光保存。

2.3 陰性對照溶液的制備

取處方量的砂仁和檀香，精密稱定，照上述供試品溶液的制備方法，得到不含丹參的陰性對照溶液。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Genmini 5 μm C18110A(250 mm×4.60 mm,5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液為流動相，梯度洗脫(0～7 min，2%A→10%A;7～20 min,10%A→23%A;20～35 min,23%A→27%A;35～38 min,27%A→38%A),流速0.8 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長288 nm，進(jìn)樣量15 μL。在上述色譜條件下[3]，理論塔板數(shù)均不低于2 000，相鄰峰之間分離度均大于1.5?；旌蠈φ掌罚幮詫φ?，精品中藥丹參飲和普通中藥丹參飲色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、陰性對照品(B)、精品中藥丹參飲樣品(C)和普通中藥丹參飲(D)的高效液相色譜圖1.丹參素(danshensu);2.原兒茶酸(protocatechuic acid);3.原兒茶醛(protocatechualdehyde);4.丹酚酸B(salvianolic acid B)

2.5 線性范圍

精密吸取混合對照品溶液2、6、8、10、12、16、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積X對進(jìn)樣質(zhì)量Y(μg)作圖，各對照品物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、線性范圍見表1。

表1 線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取丹參飲供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.18%、1.35%、1.48%、0.24%。

2.7 專屬性試驗(yàn)

精密吸取陰性對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，得到色譜圖C，說明處方中的砂仁和檀香不會影響丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的含量測定。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將丹參飲溶液于0、4、8、12、24、48 h過0.45 μm微孔濾膜(棄初濾液)置于進(jìn)樣小瓶中，精密吸取丹參飲供試品溶液10 μL注入液相色譜儀中，測得48 h內(nèi)丹參飲樣品中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.39%、2.33%、3.25%、0.13%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密移取已知濃度的丹參飲樣品9份，每份2 mL，分別置于5 mL的容量瓶中，再精密移取含丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B 分別為0.248 3 mg/mL,0.011 49 mg/mL，0.012 77 mg/mL和1.050 mg/mL的混合對照品溶液1.6 mL(3份)，2.0 mL(3份)和2.4 mL(3份)，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜。精密吸取20 μL注入液相色譜儀中，各成分平均回收率分別為：100.5%、98.3%、95.7%和89.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.57%、1.31%、0.17%、2.12%。

3 結(jié)果

取丹參飲精品中藥和普通中藥，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，各3份，按“3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量15 μL，記錄各化合物的峰面積，根據(jù)各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各化合物的濃度，含量=濃度×稀釋倍數(shù)/樣品量。與丹參飲普通中藥相比，丹參飲精品中藥中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的含量均增加，結(jié)果具有非常顯著差異。測定結(jié)果見表2和圖2。

表2 丹參飲中4中酚酸性成分含量測定結(jié)果(mg/mL)

注：與普通中藥相比，*P<0.05，**P<0.01

圖2 丹參飲精品中藥與普通中藥的含量比較注：與普通中藥相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

4.1 復(fù)方制劑成呈多樣性和復(fù)雜性

對于中藥復(fù)方制劑，在定量指標(biāo)上選擇多指標(biāo)控制其質(zhì)量[4]。本研究在相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法同時(shí)測定丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的含量。方法簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，為建立丹參飲制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。同時(shí)也可以作為丹參藥材、飲片及其復(fù)方制劑的質(zhì)量評價(jià)提供標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[2]，結(jié)合試驗(yàn)，以三氟乙酸溶為水相，乙腈為有機(jī)相，考察兩者梯度洗脫的時(shí)間和比例對色譜分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35～38 min內(nèi)，乙腈比例從27%→38%，對色譜分離效果最佳。色譜峰對稱性良好。

4.3 專屬性試驗(yàn)

對陰性對照溶液進(jìn)樣分析，在0～40 min內(nèi)，檀香和砂仁未出現(xiàn)干擾峰。

4.4 加樣回收率試驗(yàn)的驗(yàn)證

用混合對照品作為加樣的對照品，丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛加樣量與樣品中的含量接近，測得回收率在95%～105%之間，而丹酚酸B加樣量(1.05 mg)與樣品量(2.654 mg)相差較大，回收率為89.2%。配制丹參素和丹酚酸B混合對照品，按樣品中丹參素和丹酚酸B的80%、100%和120%的加對照品量，測得丹參素和丹酚酸B的平均加樣回收率分別為103.6%和97.9%。相對應(yīng)的RSD(n=9)分別0.96%和0.92%。說明在該方法可行，可靠、可信。

4.5 精品中藥的特點(diǎn)

第一安全，第二優(yōu)質(zhì)。很多消費(fèi)者或患者是長期服用中藥的，農(nóng)化殘留物無疑會對他們造成健康問題。精品中藥在整個(gè)供應(yīng)鏈上嚴(yán)格把關(guān)，產(chǎn)品在種植前要先檢驗(yàn)土壤，在收成后也要檢驗(yàn)。在工廠加工前要檢驗(yàn)，在生產(chǎn)后也要檢驗(yàn)。確保在整個(gè)過程中沒有被污染，有效成分沒有喪失。采用科學(xué)的管理手段和現(xiàn)代化的檢測方法，嚴(yán)格控制精品飲片的有效成分、安全指標(biāo)，保證精品中藥飲片“道地、安全、有效、均一、穩(wěn)定”，能夠“還中醫(yī)藥本色，還中醫(yī)藥尊嚴(yán)”。

4.6 精品中藥是現(xiàn)代中醫(yī)的強(qiáng)大后盾和基礎(chǔ)

它不僅將大量的現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)應(yīng)用在中藥材的質(zhì)量管理上，而且令中藥中醫(yī)的真實(shí)價(jià)值得到體現(xiàn)。精品中藥解除了消費(fèi)者和患者對藥材安全問題的顧慮，放心地長期使用，另一方面保證了療效，加強(qiáng)了患者對醫(yī)生的信心。整體而言，確立了中醫(yī)的權(quán)威性和科學(xué)性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明與丹參飲普通中藥相比，丹參飲精品中藥中四種酚性的含量均明顯增加。這有助于闡明本課題組之前的研究——丹參飲精品中藥對動脈粥樣硬化大鼠降血脂作用好于丹參飲普通中藥的原因。

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[2] 李環(huán)，焦亞斌.丹參飲精品中藥與普通中藥對動脈粥樣硬化模型大鼠藥理作用的比較[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30(6):980.

[3] 李安平，楊錫，丁永輝.HPLC法同時(shí)測定丹參注射液中8種成分[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，38(3):34-37.

[4] 姜鴻，王光函，張穎，等. HPLC 法測定火絨草中原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和咖啡酸[J].中成藥，2011，33(11):2023-2025.

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Determination of Four Phenolic Constituents between Boutique Salvia Decoction and Common Salvia Decoction by High Performance Liquid Chromatograph

XIE Ming-jun, JIAO Ya-bin, LI Huan, LIN Yu-shan

(SchoolofMedicine,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Objective: To establish an high performance liquid charomatography(HPLC) method for simultaneous determination of Danshensu, protocatechuic acid, protocatechualdehyde and salvianolic acid B in Salvia miltiorrhiza decoction, and to study the discrepancy of four phenolic constituents between Boutique salvia decoction and common salvia decoction.Methods:Analysis was performed on a Waters Symmetry C18(4.60 mm×250 mm,5 μm)column with gradient elution of acetonitrile (A)and 0.05% trifluoroacetic acid (B)at the flow rate of 0.8 ml/min.Detection wavelength was 288 nm and column temperature was set at 25℃.Results: Danshensu, protocatechuic acid, protocatechualdehyde and salvianolic acid B had a good linearity in certain ranges,with correlation eoefficientr≤0.999 8.Compared with the common salvia decoction,the contents of Danshensu,salviandic acid B,protocatechualdehyde and protocatechuic acid were increased obviously.Conclusion:This method is simple, accurate with high stability and good repeatability,which is helpful to control the quality of salvia miltiorrhiza decoction.

HPLC; Salvia decoction; Phenolic constituents

2016-09-09

2016-10-27

深圳市未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(JCYJ20150324141711654)；深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(JC201005250070A)

謝名君(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)及其藥物防治。

*通訊作者：焦亞斌(1970-),女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)及其藥物防治。

R284.1

A

1002-2392(2017)01-0044-03