李安琪,王艷宏,筆雪艷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，黑龍江 哈爾濱 150010)

常用松香酸檢查方法的對(duì)比分析及在三種中成藥中的應(yīng)用

李安琪1,王艷宏1,筆雪艷2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，黑龍江 哈爾濱 150010)

目的：通過(guò)對(duì)松香酸分析和比較，建立可同時(shí)檢驗(yàn)乳香、沒(méi)藥、沉香、血竭中是否含有松香酸的統(tǒng)一方法，并應(yīng)用三種中成藥對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。方法：采用兩種TLC法和三種HPLC法檢測(cè)以上四味藥材中松香酸。結(jié)果：TLC法可同時(shí)檢測(cè)沉香、沒(méi)藥中松香酸。HPLC法以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)為流動(dòng)相，對(duì)四味藥材中松香酸可同時(shí)檢測(cè)。結(jié)論：同時(shí)檢測(cè)乳香、沉香、沒(méi)藥、血竭四味藥材中松香酸，TLC法干擾較多，首選HPLC法。

松香酸；薄層色譜法；高效液相法；乳香；沒(méi)藥；沉香；血竭

松香酸為松香的主要成分[1]，據(jù)市場(chǎng)調(diào)查，乳香、沒(méi)藥、血竭、沉香等藥材價(jià)格較為昂貴，松香與上述四味藥材外觀或氣味極其相似，近期發(fā)現(xiàn)成藥中有混入松香代替上述藥材的現(xiàn)象，松香酸對(duì)人體危害較大，人體服用并吸收松香酸后，會(huì)出現(xiàn)先興奮后麻痹的癥狀[2]。目前國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法中對(duì)松香酸的檢查方法較多，本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)采用TCL和HPLC等方法[3-6]，對(duì)不同的檢查方法進(jìn)行討論及歸納總結(jié)，并制定松香酸統(tǒng)一檢查方法，以期達(dá)到同一方法檢驗(yàn)不同品種中松香酸的目的。

1 材料

1.1 儀器

Linomat 5型半自動(dòng)點(diǎn)樣器(瑞士CAMAG公司)；UltiMate 3000型高效液相色譜儀，配有DAD-3000(RS)檢測(cè)器、Chromeleon7色譜工作站(美國(guó)Thermo公司)；AE240型電子天平(瑞士METTLER公司)。SK2510LHC型數(shù)控超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

乙腈為色譜純(美國(guó)Honeywell公司)；四氫呋喃、甲酸為分析純；水為自制純化水 ；松香酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：(111938-201201)。

1.3 藥品

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片(長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)，批號(hào)：20150103071)； 跌打丸(華佗國(guó)藥股份有限公司，批號(hào)：20140101)；小兒化毒散(2014年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品)。乳香由亳州藥材總公司提供，沒(méi)藥由毫州市中藥飲片廠提供，沉香、血竭由哈爾濱集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 松香酸檢出限

2.1.1.1 對(duì)照品溶液制備

取松香酸10.24 mg，分別制成1.024 mg/mL，0.512 mg/mL，0.204 8 mg/mL，0.061 44 mg/mL，0.030 72 mg/mL的乙醇溶液。

2.1.1.2 結(jié)果

方法1吸取上述對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。松香酸在紫外光燈(254 nm)下顯相應(yīng)的熒光淬滅斑點(diǎn)。結(jié)果表明，當(dāng)點(diǎn)樣量為5 μL時(shí)，檢出濃度為0.204 8 mg/mL，檢出量為1.024 mg。

方法2吸取上述對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。松香酸在日光下顯相應(yīng)棕黃色斑點(diǎn)。紫外光燈(365 nm)下檢識(shí)顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。結(jié)果表明，當(dāng)點(diǎn)樣量為5 μL時(shí)，檢出濃度為0.204 8 mg/mL，檢出量均為1.024 mg。

2.1.2 供試品中松香酸檢查

2.1.2.1 供試品溶液的制備

取2.015 7 g沉香，1.069 7 g乳香，1.047 3 g沒(méi)藥，0.218 1 g血竭置錐形瓶中，分別加25 mL乙醇超聲20 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.1.2.2 加樣回收樣品的制備

取松香酸10.70 mg，加乙醇定容至10 mL，分別取1 mL溶液至四個(gè)錐形瓶中，回收溶液至干，分別取0.405 8 g沉香，0.238 4 g乳香，0.203 0 g沒(méi)藥，0.041 1 g血竭置錐形瓶中，各加5 mL乙醇超聲20 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

取松香酸10.70 mg，加適量乙醇溶液制成1.070 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2.4 結(jié)果

(1)吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液和加樣回收樣品溶液按照“方法1”項(xiàng)下條件實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，供試品色譜沉香、沒(méi)藥在與松香酸對(duì)照品色譜相應(yīng)位置，不顯相應(yīng)的熒光淬滅斑點(diǎn)。加樣回收樣品中，在與松香酸對(duì)照品色譜相應(yīng)位置，顯相應(yīng)的熒光淬滅斑點(diǎn)。乳香、血竭存在背景干擾，不易區(qū)分。見(jiàn)圖1。

圖1 供試品TLC圖(254 nm紫外光燈下)1.沉香供試品；2.沉香加樣回收樣品；3.乳香供試品；4.乳香加樣回收樣品；5.松香酸對(duì)照品；6.沒(méi)藥供試品；7.沒(méi)藥加樣回收樣品；8.血竭供試品；9.血竭加樣回收樣品

(2)吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照試劑溶液和加樣回收樣品溶液按照“方法2”項(xiàng)下條件實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，日光、紫外燈光下乳香、沒(méi)藥、血竭，在與對(duì)照品相應(yīng)位置，斑點(diǎn)均較多，不易區(qū)分，存在干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 供試品TLC圖A.日光下；B.365 nm紫外光燈下；1.沉香供試品；2.沉香加樣回收樣品；3.乳香供試品；4.乳香加樣回收樣品；5.松香酸對(duì)照品；6.沒(méi)藥供試品；7.沒(méi)藥加樣回收樣品；8.血竭供試品；9.血竭加樣回收樣品

2.2 HPLC方法檢查

2.2.1 色譜條件

色譜柱： Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：241 nm。流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。分別以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)、乙腈-0.1%甲酸(82∶18)、乙腈-0.1%甲酸(75∶25)為流動(dòng)相。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取松香酸10.70 mg，加適量乙醇制成每1 mL含10.70 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備

乳香、沒(méi)藥分別取薄層鑒別項(xiàng)下的供試品溶液1 mL，加乙醇稀釋至20 mL；血竭取薄層鑒別項(xiàng)下的供試品1 mL，加乙醇稀釋至10 mL；沉香取薄層鑒別項(xiàng)下的供試品；分別取上述溶液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取跌打丸3.158 2 g，加相當(dāng)于1/2的硅藻土，研勻，取0.308 6 g；取風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片除去包衣，研細(xì)，取0.212 7 g；取小兒化毒散研細(xì)，取0.214 1 g，分別加乙醇20 mL，超聲處理20 min，放至室溫，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.2.3 陰性溶液的制備

取跌打丸原料藥材，按處方制得缺沉香、沒(méi)藥、血竭的陰性樣品，照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，即得。取風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片原料藥材，按處方制得缺乳香、沒(méi)藥的陰性樣品，照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，即得。取小兒化毒散原料藥材，按處方制得缺乳香、沒(méi)藥的陰性樣品，照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.2.2.4 陽(yáng)性溶液的制備

取跌打丸3.160 3 g，加相當(dāng)于1/2的硅藻土，研勻，取0.305 2 g；取風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片除去包衣，研細(xì)，取0.214 8 g，分別加“2.2.2.1”項(xiàng)下松香酸溶液2 mL，再加乙醇18 mL，超聲處理20 min，放至室溫；乳香、沒(méi)藥分別取薄層鑒別項(xiàng)下的加樣回收樣品溶液1 mL，加乙醇稀釋至20 mL；血竭取薄層鑒別項(xiàng)下的加樣回收樣品1 mL，加乙醇稀釋至10 mL；沉香取薄層鑒別項(xiàng)下的加樣回收樣品，以上溶液均取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液為陽(yáng)性對(duì)照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性溶液和陽(yáng)性溶液各10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)為流動(dòng)相，見(jiàn)圖3。

2.2.4 耐用性的考察

分別采用Aglient-TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、TechMate C18-ST(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35：25：40)為流動(dòng)相，取供試品溶液10 μL，對(duì)照試劑溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明色譜圖峰形較好且分離度較高，以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)為流動(dòng)相，采用不同色譜柱效果均較好。

2.2.5 結(jié)論

以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)為流動(dòng)相峰形較好、分離度較高、耐用性較好。在跌打丸、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片、小兒化毒散三種中成藥中進(jìn)行驗(yàn)證，分離度較高，專屬性較好。故沉香、沒(méi)藥、乳香、血竭中松香酸可用此方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。以乙腈-0.1%甲酸(75∶25)為流動(dòng)相，乳香、血竭峰形較好，分離度較高，但其他兩味藥材分離度較低，可用于乳香、血竭中松香酸的檢測(cè)。以乙腈-0.1%甲酸(82∶18)為流動(dòng)相沉香、沒(méi)藥分離度較好，可用于沉香、沒(méi)藥中松香酸的檢測(cè)。

3 討論

本文比較了乙醇、石油醚(60～90℃)兩種溶劑為提取溶劑，進(jìn)行超聲提取，結(jié)果以乙醇超聲20 min提取效率最高。

TLC法同時(shí)檢查乳香、沉香、沒(méi)藥、血竭中松香酸，乳香、血竭存在干擾，故不推薦使用。HPLC法峰形較好，分離度較高，靈敏度較好，故為首選方法。

以乙腈-四氫呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)為流動(dòng)相的方法，雖然分離度較高，但出峰時(shí)間較長(zhǎng)，且四氫呋喃毒性較大，對(duì)機(jī)器及檢測(cè)人員傷害較大?？蓽p小四氫呋喃在流動(dòng)相中的比例，對(duì)松香酸的檢測(cè)進(jìn)行更多的探索。

本文所用高效液相系統(tǒng)不同，溫度、流速的改變，可能對(duì)松香酸檢測(cè)靈敏度、分離度、峰形有影響，故可對(duì)實(shí)驗(yàn)條件不同對(duì)松香酸檢測(cè)的影響做更深入研究。

[1] 陳安珍，沙啟營(yíng)，單秀明，等.跌打片中松香酸的 HPLC 和 HPLC-MS/MS 檢測(cè)方法研究[J].中成藥，2013,35(9):1940-1942.

[2] 楊芳.麝香接骨膠囊中非法添加松香酸檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2014,12(19):108-110.

[3] 汪楊麗，蘇晶，張毅.舒筋活血丸中非法添加物松香酸的檢測(cè)方法[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2015,17(3):244-246.

[4] 孫磊，劉燕，逄瑜,等.西黃丸和活血止痛散中乳香及非法添加松香的薄層色譜鑒別[J].中國(guó)藥事，2013,27(7):722-724,744.

[5] 張亞雙，閔春艷.小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的檢查方法研究[J].中成藥，2013,35(4):867-869.

[6] 肖聰，饒偉文，鐘名誠(chéng)．沒(méi)藥摻偽品中松香酸的檢測(cè)方法研究[J].中藥材，2012,35 (8):1237-1241.

Comparative Analysis of Commonly used Abietic Acid Inspection Method and the Application of Three Kinds of Traditional Chinese Medicine

LI An-qi1, WANG Yan-hong1, BI Xue-yan2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangDetectionInstituteforFoodandDrugControl,Harbin150010,China)

Objective: To develop one method for abietic acid test in frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis by comparing and analyzing different detection methods of abietic acid. Apply three kinds of traditionnal Chinese medicine to validate the method.Methods: Two TLC methods and three HPLC methods were tested in frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis. Results: One TLC method of abietic acid test could be only used for both aloes and myrrh. But one HPLC method of abietic acid test could be used for frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis. The mobile phase was acetonitrile-tetrahydrofuran-water(containing 0.1% formic acid)(35:25:40). Conclusion: HPLC method is suitable for abietic acid test in frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis.

Abietic acid; TLC; HPLC; Frankincense; Myrrha; Aloes; Sanguis draconis

2016-05-31

2016-09-18

2014年國(guó)家藥品計(jì)劃抽驗(yàn)(中央補(bǔ)助地方經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目)；2014年中成藥國(guó)家抽驗(yàn)品種摻偽染色物專項(xiàng)課題

李安琪(1992-)，女，碩士，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。

*通訊作者：筆雪艷(1973-)，女，博士，主任藥師，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。

R284.1

A

1002-2392(2017)01-0047-04