陳 涵，萬守謙，張紅霞，崔治晶

（甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030）

5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及機(jī)制研究

陳 涵，萬守謙，張紅霞，崔治晶

（甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030）

目的 觀察5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）血管生成的影響，并初步探討其機(jī)制。方法 采用MTT法檢測5-Aza-CdR對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，利用Transwell小室研究5-Aza-CdR對(duì)HUVECs細(xì)胞遷移的影響，利用Matrigel膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)成分分析5-Aza-CdR對(duì)HUVECs細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成的影響，通過W estern Blot法檢測其對(duì)HUVECs細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR 2）表達(dá)的影響。結(jié)果 5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs細(xì)胞增殖，且效果呈劑量、時(shí)間依賴性，1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L 5-Aza-CdR在24 h時(shí)對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖抑制率分別為（2.5±0.2）%、（12.7±0.2）%和（29.3±0.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）；在72 h時(shí)對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖抑制率分別為（12.6±0.7）%、（67.1±0.2）%和（95.8±1.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，各濃度5-Aza-CdR均對(duì)HUVECs的遷移表現(xiàn)出顯著的抑制作用。當(dāng)濃度為1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L時(shí)，抑制率分別為12.8%、28.6%、59.4%。不同濃度的5-Aza-CdR可明顯抑制管樣結(jié)構(gòu)形成，1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR對(duì)管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制率分別為19.3%、37.2%和74.6%。用不同濃度的5-Aza-CdR處理HUVECs后，VEGFR 2表達(dá)的下調(diào)呈劑量依賴性。結(jié)論 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細(xì)胞增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成，其機(jī)制可能與下調(diào)HUVECs細(xì)胞膜表面VEGFR 2的表達(dá)有關(guān)。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；遷移；管樣結(jié)構(gòu)；血管內(nèi)皮生長因子受體

1 資料與方法

1.1 一般資料

腫瘤血管生成的過程極為復(fù)雜，從血管內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cell，ECs）活化、遷移、增殖，到形成管樣結(jié)構(gòu)，再由多個(gè)血管芽之間相互連接從而形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化、遷移和增殖過程，能夠明顯抑制腫瘤新生毛細(xì)血管生長，從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的目的。目前，已有多種抗血管生成藥物處于臨床前實(shí)驗(yàn)或臨床研究階段[2，3]，但是由于有多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與血管生成，僅抑制其中一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，腫瘤仍有其他轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，易產(chǎn)生耐藥性。因此，尋求通過多種途徑達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)的藥物有助于提高療效并減少耐藥性產(chǎn)生。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）具有抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）酶的甲基轉(zhuǎn)移活性作用，已被應(yīng)用于多種血液系統(tǒng)疾病的治療[4]。目前有研究證實(shí)[5～7]，5-Aza-CdR對(duì)實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移有抑制作用，對(duì)其機(jī)制的研究仍局限于去甲基化，其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及機(jī)制目前國內(nèi)外均無報(bào)道。我們通過觀察5-Aza-CdR對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）遷移、增殖及管樣結(jié)構(gòu)形成的影響，初步闡明5-Aza-CdR對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及可能機(jī)制，進(jìn)一步驗(yàn)證其是否同時(shí)通過去甲基化和抑制腫瘤血管新生兩條途徑達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的目的，以期為5-Aza-CdR在實(shí)體腫瘤治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.2 材料的獲取

1.2.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所，均在含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2及95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用2×105/m l的起始濃度傳代，傳代時(shí)用0.25%的胰酶（含0.02%EDTA）溶液消化，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用MTT法檢測5-Aza-CdR對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)組：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）溶液消化，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制作單細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，加入5-Aza-CdR，調(diào)整每孔終體積為200μl，并使5-Aza-CdR終濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L。對(duì)照組不加5-Aza-CdR，僅加等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，在每塊培養(yǎng)板中留一孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液，設(shè)為空白調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24 h、72 h時(shí)，取出培養(yǎng)板，在每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，倒去孔內(nèi)培養(yǎng)液，在每孔中加入150μl的DMSO，之后將培養(yǎng)板置于平板搖床上振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，以空白孔調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm波長處每孔光密度值（OD值），從而計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.2.2 細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長期人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后，稀釋細(xì)胞懸液濃度至5× 105/m l，加入Transwell小室，待細(xì)胞沉降數(shù)分鐘后，再加入不同濃度的5-Aza-CdR（1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L）懸液和藥液，共加入400μl，下室加入含20%血清的培養(yǎng)基600μl，待細(xì)胞遷移24 h后取出小室，將上室細(xì)胞以棉棒輕輕拭去，用甲醇固定30min，結(jié)晶紫染色5min，PBS洗滌3次，鏡下觀察遷移結(jié)果并照相。管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)的鋪膠：分裝Matrigel膠，于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前一天取出置于4℃冰箱中，使其充分融化。將滅菌槍頭放于-20℃冰箱中，供第二天實(shí)驗(yàn)用。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，Matrigel膠與培養(yǎng)基以1∶2稀釋，在96孔板的每個(gè)孔均加入60 μl，置于37℃孵箱中凝固30min。

1.2.3 細(xì)胞處理 在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，倒去原培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶0.8m l消化，用培養(yǎng)基制作成單細(xì)胞懸液，之后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞濃度降至8×105/m l（加入0.5%的血清），將其加入Matrigel膠已凝固的96孔板中，每孔90μl，細(xì)胞沉降數(shù)分鐘后，再加入不同濃度的5-Aza-CdR（1μmol/L、5μmol/L、10 μmol/L）10μl，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，鏡下觀察管樣結(jié)構(gòu)形成情況，照相并行結(jié)果分析。Western Blot法檢測5-Aza-CdR對(duì)HUVECs細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR2）表達(dá)的影響：取對(duì)數(shù)生長期HUVECs細(xì)胞，用D-Hanks液洗滌細(xì)胞3次后，分別加入已配好的不同濃度的5-Aza-CdR（1μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L）和培養(yǎng)基，24 h后棄掉原培養(yǎng)液，以移液器吸凈培養(yǎng)瓶中殘存的培養(yǎng)液，用3m l的4℃預(yù)冷PBS（0.01 M，pH 7.2～7.3）洗滌細(xì)胞。輕晃30min，倒去洗滌液，重復(fù)兩次，PBS除盡后每瓶細(xì)胞中再加入270μl裂解液，置于冰上裂解1.5 h，期間持續(xù)晃動(dòng)使細(xì)胞充分裂解，待裂解完成后，用刮棒將細(xì)胞刮下，置于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，迅速將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5m l離心管內(nèi)，4℃、13 000 r/min條件下，離心15min，取上清液分裝。將以上樣品置于沸水中煮沸5 min，使蛋白變性，之后在每加樣孔中加入20μl含有5×SDS上樣緩沖液的樣品。上樣前，用掌式離心機(jī)將樣品稍離心，用50μl微量進(jìn)樣器吸取樣品，然后將進(jìn)樣器的針頭插入加樣孔緩慢加入樣品。每次加樣品前用電泳緩沖液清洗3次進(jìn)樣器，防止各孔間交叉污染。在其中一孔加入Marker，用于蛋白分子量對(duì)照。之后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉后加入目的一抗，在4℃條件下孵育過夜，TBS/T洗滌3次后，加入二抗，于室溫孵育2 h，再次使用TBS/T洗滌3次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs細(xì)胞增殖

結(jié)果顯示，5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs細(xì)胞增殖，且效果呈劑量時(shí)間依賴性。1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L濃度5-Aza-CdR在作用24 h時(shí)，對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖抑制率分別為（2.5±0.2）%、（12.7±0.2）%和（29.3±0.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）；在72 h時(shí)，對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖抑制率分別為（12.6±0.7）%、（67.1±0.2）%和（95.8±1.2）%，差異有顯著性（P＜0.05）。

2.2 不同濃度5-Aza-CdR對(duì)HUVECs的遷移均有顯著性抑制作用

本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室來觀察5-Aza-CdR對(duì)HUVECs遷移作用的影響。將不同濃度的5-Aza-CdR和HUVECs加入Transwell小室后培養(yǎng)24 h，再用甲醇固定并以結(jié)晶紫染色。結(jié)果顯示，溶媒對(duì)照組中大量HUVECs細(xì)胞可通過Transwell膜的孔隙遷移至膜的另一側(cè)，而在加入不同濃度5-Aza-CdR后，HUVECs遷移均被抑制，濃度為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L時(shí)的抑制率分別為12.8%，28.6%，59.4%。

2.3 各濃度5-Aza-CdR對(duì)管樣結(jié)構(gòu)形成有明顯抑制作用

本實(shí)驗(yàn)采用Matrigel膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)成分，觀察5-Aza-CdR對(duì)HUVECs管樣結(jié)構(gòu)形成的影響。結(jié)果顯示，HUVECs細(xì)胞在Matrigel膠中能自主形成管樣結(jié)構(gòu)，而不同濃度的5-Aza-CdR對(duì)管樣結(jié)構(gòu)的形成均有明顯抑制作用。1μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR對(duì)管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制率分別為19.3%、37.2%和74.6%。

2.4 5-Aza-CdR對(duì)VEGFR2表達(dá)的下調(diào)呈劑量依賴性

研究發(fā)現(xiàn)，以不同濃度的5-Aza-CdR處理HUVECs后，其對(duì)VEGFR2表達(dá)的下調(diào)呈劑量依賴性。

3 討論

3.1 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細(xì)胞增殖

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞增殖和血管新生密切相關(guān)，血管生成首先是內(nèi)皮細(xì)胞活化和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR對(duì) HUVECs的體外增殖具有明顯抑制作用，1 μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR在24 h時(shí)對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖抑制率分別為（2.5±0.2）%、（12.7±0.2）%和（29.3±0.2）%；在72 h時(shí)對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖抑制率分別為（12.6±0.7）%、（67.1±0.2）%和（95.8±1.2）%，呈明顯的時(shí)間、劑量依賴性。說明5-Aza-CdR可能通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制來阻礙血管生成，遏制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

3.2 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細(xì)胞遷移

腫瘤新生毛細(xì)血管是在原有血管基礎(chǔ)上延伸擴(kuò)展形成的，大量研究證實(shí)[8]，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，能顯著抑制腫瘤新生毛細(xì)血管生長，從而抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。本研究利用Transwell小室觀察不同濃度5-Aza-CdR對(duì)HUVECs體外遷移的影響。結(jié)果顯示，1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR在24 h時(shí)，對(duì)HUVECs遷移的抑制率分別為12.8%、28.6%和59.4%，提示5-Aza-CdR對(duì)血管生成過程中的HUVECs遷移可能也起著明顯抑制作用。

3.3 5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成

內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及形成微血管管腔是血管生成的晚期事件[9]。5-Aza-CdR在體外對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移均有明顯的抑制作用，為進(jìn)一步探討其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)形成的作用，本研究觀察不同濃度5-Aza-CdR對(duì)HUVECs體外管腔形成的影響。結(jié)果顯示，HUVECs自8 h開始形成較多的管腔結(jié)構(gòu)，24 h形成較為明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而加入5-Aza-CdR后網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被顯著破壞。1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-Aza-CdR對(duì)管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制率分別為19.3%，37.2%和74.6%。提示5-Aza-CdR對(duì)管腔形成可能發(fā)揮較為顯著的抑制作用，從而抑制血管生成，使腫瘤細(xì)胞缺少營養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而抑制其生長。

VEGF是目前已知的血管生成過程中最重要的血管生長因子之一，其通過與相應(yīng)的3種受體結(jié)合，發(fā)揮各種生物學(xué)活性作用，對(duì)于3種受體研究最為廣泛的是特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。VEGF通過與RTK受體VEGFR2相結(jié)合，使其二聚體化，并使受體自身發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致下游蛋白（如ERK1/2、蛋白激酶C、AKT等）活化[10]，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及管樣結(jié)構(gòu)形成，進(jìn)而使新血管生成[11]。因此，靶向抑制VEGF信號(hào)途徑是一個(gè)通過抑制腫瘤血管生成進(jìn)而抑制腫瘤生長的可靠策略。本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot法檢測分析5-Aza-CdR對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2表達(dá)的影響。結(jié)果表明，VEGFR2總蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。這可能是5-Aza-CdR抑制HUVECs增殖、遷移及管樣結(jié)構(gòu)形成的機(jī)制之一。

綜上所述，5-Aza-CdR可顯著抑制HUVECs增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成，其機(jī)制可能與下調(diào)HUVECs細(xì)胞膜表面VEGFR2表達(dá)有關(guān)。提示可以通過5-Aza-CdR抑制腫瘤血管新生的途徑達(dá)到治療腫瘤的目的，為5-Aza-CdR在實(shí)體腫瘤治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。但基于體外實(shí)驗(yàn)的局限性，仍需進(jìn)一步行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)以上結(jié)論。

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