郭 雷, 王 聰, 郭家才, 鄭洪偉

(1.淮海工學(xué)院 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222004；3.中國(guó)海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院 教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

自由基是具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，通常是在細(xì)胞正常新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。其反應(yīng)能力很強(qiáng)，能夠使細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害細(xì)胞膜，還能引起蛋白的損傷和DNA的變異。自由基在人體內(nèi)的積累最終可引起許多慢性疾病的發(fā)生，如心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥和阿爾茨海默病[1-3]。為了降低自由基對(duì)人體的損傷及改善食品的貯存穩(wěn)定性，合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚 (BHA)、二叔丁基對(duì)甲酚 (BHT) 和沒(méi)食子酸丙酯 (PG) 已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品加工中。但研究表明合成抗氧化劑可能引起營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失，甚至產(chǎn)生毒性效應(yīng)[4-5]。因此，開發(fā)天然的抗氧化劑引起了人們?cè)絹?lái)越多的興趣[6-8]。海洋真菌與陸生真菌的生存環(huán)境不同，使其形成了獨(dú)特的代謝和防御系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特和活性特異的代謝產(chǎn)物[9-10]。自20世紀(jì)90年代開始一直到現(xiàn)在，已從海藻、海綿、紅樹林生態(tài)系統(tǒng)、海洋沉積物、海洋軟體動(dòng)物、海鞘、珊瑚、魚類及其他海洋動(dòng)植物等來(lái)源海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1 000多個(gè)新的次生代謝產(chǎn)物，化合物類型包括生物堿、多肽、聚酮、萜類、甾類等多種結(jié)構(gòu)類型。這些代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒等生物活性[11-12]。據(jù)估計(jì)，海洋真菌有6 000種以上，但到2009年止，已鑒定的海洋真菌僅有321屬530種，其中424種屬于子囊菌門、94個(gè)種屬于變形菌門、12個(gè)種屬于擔(dān)子菌門，僅占陸地真菌總數(shù)(約5萬(wàn)種)的1%左右[13-14]。因此，海洋真菌仍處于探索和研究的階段。從海水養(yǎng)殖貝類文蛤共生微生物中分離出來(lái)的真菌LWG-42菌株，其發(fā)酵液具有顯著的DPPH自由基清除活性。本研究對(duì)LWG-42菌株進(jìn)行了鑒定，對(duì)其產(chǎn)生的抗氧化活性化合物進(jìn)行活性追蹤分離并鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株LWG-42為海水養(yǎng)殖貝類文蛤共生微生物中分離到的1株真菌，保存于淮海工學(xué)院海洋微生物天然產(chǎn)物化學(xué)研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%) 菌株保存及鑒定培養(yǎng)基均為沙氏固體培養(yǎng)基SDA：葡萄糖 4， 蛋白胨 1，瓊脂 1.5；種子培養(yǎng)基為沙氏液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 2，麥芽糖 2，谷氨酸鈉 2， 酵母膏 0.3，KH2PO40.05，MgSO4·7H2O 0.03，玉米粉 0.03。培養(yǎng)基均用陳海水配制。

1.1.3 分離試劑 柱層析用硅膠 (200～300目，青島海洋化工廠)；GF254硅膠薄層板(10～40 μm，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences，瑞典)。

1.1.4 儀器 掃描電子顯微鏡HITACHI JSM-6390LA用于菌株分生孢子的觀察；分析型高效液相色譜柱CAPCELL PAK C18 column ((4.6×250) mm，5 μm)；制備型高效液相色譜柱YMC-pack ODS-A column ((10×250)mm，5 μm)；紫外光譜 (UV) 測(cè)定采用Waters 2487紫外檢測(cè)器，甲醇為溶劑；核磁共振 (NMR) 測(cè)定JEOL JNM-ECP 600型核磁共振波譜儀，DMSO-d6為溶劑，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)；質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定采用Q-TOF GAA076 LC型質(zhì)譜儀。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征 將菌株LWG-42接種于SDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察并描述菌落形狀、質(zhì)地和顏色等形態(tài)特征；石碳酸棉蘭染色法觀察分生孢子囊特征；掃描電子顯微鏡觀察分生孢子特征[15]。

1.2.2 ITS序列分析 將菌株LWG-42接種于SDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，送至北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司進(jìn)行ITS 序列分析，PCR程序參照文獻(xiàn)[16]。ITS序列提交至GenBank (序列號(hào)KF494190)，采用BLAST軟件進(jìn)行相似序列搜索，繼而利用Clustal X (Ver. 1.83) 軟件對(duì)高同源序列進(jìn)行多序列聯(lián)配分析，最后利用MEGA (Ver. 4.0) 軟件中的N-J法 (Neighbor-Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置自展次數(shù)為1 000次。

1.2.3 菌株LWG-42的發(fā)酵及活性浸膏的制備 將菌株LWG-42 的斜面孢子接種到裝有200 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶?jī)?nèi)，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。隨后將收獲的種子培養(yǎng)液按1%的接種量接種于裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶?jī)?nèi)，共接種50 瓶，28 ℃靜置培養(yǎng)30 d。用8層紗布過(guò)濾發(fā)酵產(chǎn)物，將獲得的發(fā)酵濾液用等量乙酸乙酯萃取3次，合并濾液，將濾液濃縮蒸發(fā)至干燥，獲得活性浸膏7.8 g。

1.2.4 活性化合物的分離純化及鑒定 將乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠減壓柱層析，依次用石油醚-二氯甲烷 (1∶0 ～0∶1，體積比) 和二氯甲烷-甲醇 (1∶1 ～0∶1，體積比) 梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫1 L。將各梯度下的洗脫液分別濃縮蒸發(fā)，共獲得7個(gè)組分，測(cè)定7個(gè)組分的抗氧化活性，其中二氯甲烷-甲醇 (25∶1，體積比) 洗脫的組分4 具有抗氧化活性。將活性組分4 (0.30 g) 進(jìn)行Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫，收集洗脫液，10 mL為一個(gè)餾分。將收集的洗脫液依據(jù)其TLC圖譜，合并為4個(gè)亞組分(4-1、 4-2、 4-3和4-4)。分別對(duì)上述4個(gè)亞組分進(jìn)行HPLC分析，顯示亞組分4-2 可以在甲醇-水 (70∶30，體積比) 濃度梯度下制備。用半制備HPLC對(duì)亞組分4-2 (0.11 g) 進(jìn)行分離，得到化合物1 (4.5 mg, tR14.0 min) 和 2 (7.0 mg, tR8.0 min)，基于化合物的波譜特征 (UV,1H-NMR,13C-NMR, DEPT和ESI-MS) 鑒定其結(jié)構(gòu)。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定 抗氧化活性測(cè)定采用DPPH自由基清除試驗(yàn)[6]?；衔锓謩e用甲醇溶解后，按二倍稀釋法配成不同濃度的溶液，分別取100 μL 加至96 孔板孔內(nèi)，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)平行。然后將100 μL 0.2 mmol/L的DPPH 乙醇溶液加入孔內(nèi)，混合均勻，室溫下放置20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定517 nm處的吸光度。3 個(gè)平行的吸光度平均值記為Ai，同時(shí)以甲醇代替樣品測(cè)定Ac，以乙醇代替DPPH溶液測(cè)定Aj，按下列公式計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LWG-42的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征 菌株LWG-42在沙氏瓊脂上生

長(zhǎng)迅速，28 ℃培養(yǎng)7 d，直徑可達(dá)65～70 mm，平坦，質(zhì)地絲絨狀；菌絲初生時(shí)為白色，漸變?yōu)樽?、黑色，無(wú)滲出液，菌落背面黃褐色；在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下，分生孢子頭呈球形，褐黑色；頂囊膨大，頂囊上放射狀密生著兩輪小柄；分生孢子呈球形，直徑約3～4 μm，表面不光滑，有小刺，常串生(圖1)。參考文獻(xiàn)[17]，初步鑒定菌株LWG-42為曲霉屬黑色組曲霉。

圖1 菌株LWG-42的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain LWG-42a:菌落;b:分生孢子梗;c:分生孢子(Bar=5 μm)a:Colony;b:Conidiphore;c:Conidium (Bar=5 μm)

2.1.2 ITS序列分析 經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，獲得的菌株LWG-42的ITS序列全長(zhǎng)為573 bp, 將其序列提交至GenBank (序列號(hào)為KF494190)。BLASTn分析結(jié)果顯示該序列與曲霉屬真菌 (Aspergillussp.)的ITS序列具有很高的同源性，其中與菌株AspergillustubingensisCs/9/7 (JN585944.1)、AspergillustubingensisA1KA (AM745112) 的ITS序列同源性為99%，在以N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一簇群(圖2)。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，該菌株被鑒定為塔賓曲霉Aspergillustubingensis，菌株命名為Aspergillustubingensisstrain LWG-42。

圖2 基于ITS序列的菌株LWG-42系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Polymeric analysis of strain LWG-42 based on the ITS sequences

2.2 活性化合物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

從菌株LWG-42發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏中，采用活性追蹤的分離方法，共分離得到2個(gè)次生代謝產(chǎn)物。

化合物1： 黃色粉末 (甲醇)；HPLC-UV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紫外吸收在226、281、325、405 nm處分別有中、強(qiáng)，弱、弱的吸收，提示為一萘并吡喃酮類化合物；陽(yáng)離子ESI-MS在m/z571處給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，提示分子量為570，結(jié)合其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù) (表1)，確定該化合物的分子式為C32H26O10；該化合物的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的aurasperone A一致[18]，故將化合物1鑒定為aurasperone A (圖3)。

化合物2： 黃色粉末 (甲醇)； HPLC-UV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紫外吸收在234、282、334、408 nm處分別有中、強(qiáng)、弱、弱的吸收，提示也為一萘并吡喃酮類

化合物；陽(yáng)離子ESI-MS分別在m/z607、608處給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+和[M+2H]+，提示分子量為606，結(jié)合其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù) (表1)，確定該化合物的分子式為C32H30O12；該化合物的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的aurasperone B一致[19-20]，故將化合物2鑒定為aurasperone B (圖3)。

圖3 化合物1、2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of Compound 1，2

位置aurasperoneAaurasperoneB13C-NMR1H-NMR13C-NMR1H-NMR2169.0101.73107.26.19(1H,s)48.63.22(2H,m)4182.8198.74a103.8103.85162.3164.25a110.5108.96157.4159.67115.9117.58159.6161.29101.87.24(1H,s)106.67.08(1H,s)9a142.8142.410101.87.30(1H,s)101.76.86(1H,s)10a153.9153.6CH3-220.62.47(3H,s)28.11.65(3H,s)OH-515.08(1H,s)14.27(1H,s)OCH3-856.63.60(3H,s)61.63.90(3H,s)OCH3-661.83.34(3H,s)61.83.35(3H,s)2'169.0100.63'107.26.22(1H,s)48.32.79(2H,m)4'184.5184.54a'103.4103.35'163.5163.65a'108.1108.1

續(xù)表1

2.3 化合物對(duì)DPPH自由基的清除活性

DPPH自由基清除試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)化合物的自由基清除活性的測(cè)定中[6]。Aurasperone A、aurasperone B和陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著化合物濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除活性也逐漸提高。當(dāng)試驗(yàn)化合物的濃度從0.062 5 mg/mL增加到1.0 mg/mL, 抗壞血酸，aurasperone A和aurasperone B對(duì)DPPH自由基的清除活性分別從(63.37±3.86)%、(34.93±1.17)%和(38.33±1.29)% 提高到(95.05±1.49)%、(71.02±2.35)% 和(76.74±1.82)%，EC50值分別為0.035、0.18和0.11 mg/mL。結(jié)果顯示aurasperone A和aurasperone B具有一定的DPPH自由基清除活性，但低于對(duì)照抗壞血酸的活性。

圖4 Aurasperone A、B對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.4 The scavenging activities of aurasperone A and B on DPPH free radical

3 討 論

塔賓曲霉是屬于曲霉屬的一種真菌，已有報(bào)道顯示塔賓曲霉能夠產(chǎn)生吲哚二萜dihydrotubingensin A、B[21]，環(huán)五肽malformin A1[22]，萘并吡喃酮類化合物如asperpyrone A、D, aurasperone A-E， rubasperone A-C及rubrofusarin、 rubrofusarin B等次生代謝產(chǎn)物[23-24]。這些化合物具有一定的抗煙草花葉病毒、細(xì)胞毒，抑制酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶的活性。本研究從塔賓曲霉LWG-42菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到2個(gè)具有一定程度的清除DPPH自由基活性的化合物aurasperone A 和aurasperone B。Aurasperone A可以從植物共生塔賓曲霉菌株[24]、鏈格孢霉D2006[25]、黑曲霉IFB-E003[19]和JV-33-48[26]以及木蘋果內(nèi)生曲霉[18]中分離得到，具有一定的黃嘌呤氧化酶抑制活性 (IC50: 10.9 μmol/L)，中等程度的鹵蟲毒性和TaqDNA聚合酶抑制活性。Aurasperone B 能夠從鏈格孢霉D2006、木蘋果內(nèi)生曲霉[18]和黑曲霉C-433[27]的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，顯示出弱的鹵蟲毒性。據(jù)文獻(xiàn)所知，本文是第一次報(bào)道aurasperone A和aurasperone B具有DPPH自由基清除活性。

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，將1株具有DPPH自由基清除活性的海洋來(lái)源真菌LWG-42菌株鑒定為塔賓曲霉 (A.tubingensis)；利用抗氧化活性追蹤分離的方法，通過(guò)溶劑萃取和柱層析技術(shù)，從LWG-42菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到2個(gè)化合物；基于化合物的波譜特征，將其鑒定為aurasperone A 和 aurasperone B，aurasperone A、B具有一定的清除DPPH自由基的活性，為進(jìn)一步開發(fā)這兩個(gè)化合物在藥品、化妝品和食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

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