路 璐

(西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

遺傳和代謝多樣性豐富的微生物在生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起著主導(dǎo)作用，也是目前微生物生態(tài)學(xué)的重要研究對象。然而，絕大多數(shù)微生物種類尚不能通過傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法進(jìn)行分離，目前估測的每升海洋水體和每噸土壤中分別含有2×106和4×106種微生物類群，而已分離出的純菌僅約4 800種[1]。因此，人們對環(huán)境中微生物的種類及其生理代謝功能的認(rèn)識還十分有限。為了盡量在原位環(huán)境下研究這些難培養(yǎng)微生物，在過去的幾十年中，以非培養(yǎng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)手段，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、高通量測序技術(shù)等的迅速發(fā)展，已經(jīng)能夠在群落水平探知微生物的多樣性及其生理代謝功能，同時也發(fā)現(xiàn)了在傳統(tǒng)研究技術(shù)手段下以往無法發(fā)現(xiàn)的微生物種類及功能[2-6]，這些分子生物學(xué)技術(shù)已成為目前研究環(huán)境微生物的主要途徑。然而，以DNA測序為基礎(chǔ)的分析方法，仍存在很大缺陷。比如， PCR及全基因組擴(kuò)增(whole gemome amplification, WGA)在擴(kuò)增過程中，對不同豐度和種屬的微生物存在一定的擴(kuò)增偏差[7-8]，會導(dǎo)致所測結(jié)果與實際環(huán)境中相差甚遠(yuǎn)。同時，即使是具有相似 16S rRNA 基因組成的類群也不一定具有相同的代謝功能[9]，豐度較高的微生物也不一定發(fā)揮更重要的生態(tài)功能[10]。更重要的是，微生物發(fā)揮功能的基本載體是細(xì)胞，脫離了單個細(xì)胞，單純的DNA/RNA和蛋白質(zhì)僅僅是不同化學(xué)物質(zhì)的簡單堆積。因此，在細(xì)胞水平研究原位條件下微生物的系統(tǒng)發(fā)育水平及生理代謝是探究大多數(shù)難培養(yǎng)微生物生態(tài)功能的最好解決方法之一。熒光原位雜交 (fluorescenceinsituhybridization, FISH )是一項利用熒光標(biāo)記的寡核苷酸或多核苷酸探針直接在染色體、細(xì)胞或組織水平定位靶序列的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了分子生物學(xué)的快速檢測鑒定和顯微技術(shù)的形態(tài)分析優(yōu)勢，能夠?qū)?fù)雜的環(huán)境樣品中難培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物進(jìn)行菌種鑒定、數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)等進(jìn)行分析。然而，F(xiàn)ISH也存在著檢測靈敏度低、探針雜交效率低等問題[11]，隨著近年來對FISH技術(shù)的不斷改進(jìn)，這些問題也逐漸得到改善。其中催化報告沉積熒光原位雜交技術(shù)(Catalyzed reporter deposition-FISH，CARD-FISH) 或者酪胺信號擴(kuò)增熒光原位雜交技術(shù)(Tyramide signal amplification-FISH，TSA-FISH)的檢測靈敏度及檢測效率要顯著高于普通的FISH[12]。有研究表明CARD-FISH的檢測靈敏度比普通的FISH要高出100倍，檢測效率也高出1～3倍[13]，且這一技術(shù)已經(jīng)在土壤、海洋和底泥等生境中微生物的研究中得到廣泛應(yīng)用[12-15]。隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，CARD-FISH與其他技術(shù)的聯(lián)用，比如同位素示蹤技術(shù)、納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)(nano-meter secondary ion mass spectrometry， NanoSIMS)、掃描電鏡及能量彌散X射線探測分析儀(secondary electron microscope/energy dispersive X-ray spectroscopy，SEM/EDX)等，使得在復(fù)雜環(huán)境樣品中研究代謝活躍的微生物系統(tǒng)分類信息及原位代謝特征成為可能，這些技術(shù)聯(lián)用方法在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中起著越來越重要的作用。本文綜述CARD-FISH技術(shù)的原理、要點及應(yīng)用，并探討該技術(shù)與相關(guān)技術(shù)相聯(lián)用在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用和進(jìn)展。

1 CARD-FISH技術(shù)的原理及要點

CARD-FISH技術(shù)的基本原理是在探針上連接辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase, HRP)，與樣品細(xì)胞的rRNA或DNA完成雜交后，洗去游離的探針，加入熒光標(biāo)記的酪胺(tyramide)進(jìn)行熒光信號擴(kuò)增，在HRP的催化作用下，有熒光基團(tuán)標(biāo)記的酪胺會大量沉淀在有探針結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)(圖1)，起到放大熒光信號的作用，同時減少了背景干擾，增強(qiáng)了熒光的穩(wěn)定性。另外，如圖2中的熒光信號產(chǎn)生原理圖所示，二階TSA-FISH也是采用酪胺信號擴(kuò)增方法來增加熒光信號，其進(jìn)行了兩步熒光信號擴(kuò)增的過程[16]。由此看出，由于CARD-FISH和TSA-FISH在熒光信號產(chǎn)生原理的不同，使其二者比傳統(tǒng)的FISH有更多的優(yōu)勢。CARD-FISH主要包括五個步驟：①菌體細(xì)胞固定及制備；②細(xì)胞通透性處理；③內(nèi)源過氧化氫酶失活處理；④寡核苷酸探針雜交；⑤酪胺熒光信號擴(kuò)增。完成以上步驟的載有細(xì)胞的玻片或濾膜在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞熒光信號的檢測。

圖1 CARD-FISH的主要步驟Fig.1 Basic protocol for CARD-FISH

圖2 FISH、CARD-FISH和二階TSA-FISH原理示意圖Fig.2 Schematic depiction of FISH, CARD-FISH, and two-pass TSA-FISH方框內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)表示酪胺在細(xì)胞內(nèi)的沉降過程[17]The scheme in the box depicts tyramide immobilization on tyrosine inside the cells[17]

1.1 菌體細(xì)胞固定及制備

細(xì)胞內(nèi)含有的各種大分子化合物，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、酶類等，支撐著細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并保證其新陳代謝過程。為防止在實驗過程中細(xì)胞自溶或腐敗，以及細(xì)胞內(nèi)的酶對蛋白質(zhì)的分解作用，同時保持原有的細(xì)胞形態(tài)，在進(jìn)行FISH前都會對樣品細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)固定。固定液一般選取蛋白變性劑，例如乙醇、甲醛、多聚甲醛等[18]。細(xì)胞固定液的濃度、固定時間和溫度也是決定細(xì)胞固定效果的主要因素。如Pizzetti等研究發(fā)現(xiàn)，在對Planctomycetes采用2%的甲醛固定時，用FISH的檢測效率卻高于CARD-FISH所測得的檢測效率；而用1%的多聚甲醛為固定液時，卻得出相反的結(jié)論[19]。有些細(xì)菌在用乙醇固定后會導(dǎo)致熒光信號的減弱[20]。所以，在對特定微生物應(yīng)比較分析不同固定液和固定條件對檢測率和細(xì)胞形態(tài)的影響，并選擇合適的細(xì)胞固定方法，可以顯著提高數(shù)據(jù)的可信度。

1.2 細(xì)胞通透性處理

由于普通FISH的熒光標(biāo)記物的分子量大約在500～1 000 Da，可以輕易地透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)和靶序列結(jié)合，而CARD-FISH使用的探針連接的HRP大約在5～6 nm，分子量高達(dá)40 kDa，極大地限制了探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而影響雜交效率。雖然有些細(xì)菌仍然可以采用CARD-FISH 被檢測到，如海洋底泥中的浮霉菌[21]和具有S層結(jié)構(gòu)的產(chǎn)甲烷菌[20]，但大多數(shù)原核細(xì)胞需要在探針雜交前進(jìn)行細(xì)胞通透性處理。鑒于不同細(xì)菌和古菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)千差萬別，細(xì)胞的通透性處理沒有標(biāo)準(zhǔn)方法。

細(xì)胞通透性處理主要分以下三種：①酶處理：常用于細(xì)胞通透性處理的酶主要有溶菌酶、消化肽酶、蛋白酶K和假肽聚糖肽鏈內(nèi)切酶。其中溶菌酶通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽從而增加細(xì)胞通透，尤其對處理革蘭陰性的微生物時效果最佳[22-23]。在對革蘭陽性的微生物進(jìn)行細(xì)胞膜通透性處理時，研究發(fā)現(xiàn)單純的溶菌酶處理不能完全將其通透化處理[24]。Sekar等[25]發(fā)現(xiàn)在使用溶菌酶處理革蘭陽性的微生物后，繼續(xù)采用消化肽酶再一次進(jìn)行細(xì)胞通透性處理可以使其達(dá)到較好的效果。此方法在古菌和浮霉菌細(xì)胞通透性處理中較為常用[26-27]。蛋白酶K由于在處理細(xì)胞時，其濃度及處理時間的不同常會導(dǎo)致差異顯著的結(jié)果[22,28]，但蛋白酶K能有效對古菌細(xì)胞進(jìn)行通透性處理[20,29]。假肽聚糖肽鏈內(nèi)切酶常用于處理含有假肽聚糖的產(chǎn)甲烷菌[30]。②化學(xué)處理：在探針雜交緩沖液中常加入十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)以增加探針與rRNA的結(jié)合效率[31]，也有研究在溶解酶處理細(xì)胞通透性后，再用SDS或者SDS/二硫蘇糖醇處理[32]。另外，HCl處理海洋古菌細(xì)胞，也可以增加細(xì)胞的通透性[29]。③微波處理：在不能確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其有效地通透處理劑時，可采用微波處理的方法。采用此方法進(jìn)行細(xì)胞通透性處理成功地在海洋底泥中檢測到ANME-2c-group的厭氧甲烷氧化菌[33]。Tischer等[34]對Tris-EDTA溶液中的細(xì)胞進(jìn)行微波處理，最終也能檢測到細(xì)菌和古菌。

1.3 內(nèi)源過氧化氫酶失活處理

在CARD-FISH中的熒光擴(kuò)增過程中，其起始步驟是在探針上的辣根過氧化氫酶HRP的催化作用下將過氧化氫轉(zhuǎn)化為羥基自由基，因此在開始CARD-FISH之前，必須對細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶進(jìn)行失活處理，以避免假陽性熒光信號產(chǎn)生。然而，目前此處理并沒有標(biāo)準(zhǔn)方法，針對不同環(huán)境的樣品需要優(yōu)化方案來進(jìn)行過氧化氫酶失活。有研究表明，采用含有0.15% H2O2的乙醇溶液可以有效地將胞內(nèi)的過氧化氫酶失活，而高濃度的H2O2(>3%) 將造成DAPI染色的細(xì)胞數(shù)量顯著減少[27]。但對于細(xì)胞內(nèi)含有高濃度過氧化氫酶的微生物，如海水中的厭氧氨氧化微生物可采用濃度為3% 的H2O2處理[35]。另外，采用0.01 mol/L的HCl溶液或0.1%的焦碳酸二乙酯溶液也常用于抑制細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的活性[12,35]。

1.4 寡核苷酸探針雜交

在環(huán)境微生物學(xué)中，熒光原位雜交最常用的靶序列是具有遺傳穩(wěn)定性的16S rRNA，根據(jù)已有的數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計出針對不同種屬的探針，如表1中列出常用的特異寡核苷酸探針。為了更有效地提升探針的結(jié)合率和精準(zhǔn)性，也有研究使用肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)和鎖核酸(locked nucleic acids，LNAs)作為探針進(jìn)行雜交，這兩種探針與互補序列具有比寡核苷酸探針更強(qiáng)的親和力[36]，在檢測細(xì)菌細(xì)胞的rRNA時具有較高的靈敏性，但由于其合成費用較高限制了其在微生物研究中的應(yīng)用。另外，多核苷酸探針在研究中也有使用，但其特異性較低，無法精確到種屬水平，主要初步鑒定微生物的分類級別[37]。

表1 環(huán)境微生物 FISH中應(yīng)用的特異寡核苷酸探針

注：?表示EUB338、EUB338-II和EUB338-III三種探針按等濃度混合(EUBMIX)用于檢測總細(xì)菌；表示在探針雜交過程中，需要同時加入競爭探針

在探針與目標(biāo)微生物雜交過程中，有研究者為了防止連在探針上的HRP酶失活，將雜交溫度降到35 ℃或40 ℃[16,38]。然而，最近也有研究者證明在高至55 ℃的雜交溫度條件下2 h，仍能保證HRP的活性[27]。所以，46 ℃的標(biāo)準(zhǔn)雜交溫度在實際實驗中較為常用。在CARD-FISH實驗中，為了減少背景熒光的影響，探針的濃度要求比普通FISH的濃度要低一些，一般濃度在0.1～0.5 μmol/L之間。同時，在雜交緩沖液中常加入阻斷劑來減少非特異性熒光信號的產(chǎn)生[25]。另外，雜交緩沖液中甲酰胺的濃度也需要在參考普通FISH濃度的基礎(chǔ)上，根據(jù)特定探針進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。這是由于連有HRP的探針和連有熒光素的探針的解離屬性有所差異[39]。

圖3 水體底泥中總細(xì)菌的FISH (A)和CARD-FISH(B)Fig.3 Detection of marine sediment bacteria by FISH(A) and CARD-FISH(B)FISH采用Cy3(A)標(biāo)記的探針EUB338，CARD-FISH采用HRP標(biāo)記的探針EUB338，并用Oregon Green 488(B)標(biāo)記的酪胺進(jìn)行熒光擴(kuò)增過程；FISH所得圖片的曝光時間為1.0 s，CARD-FISH為0.2 s(未發(fā)表)FISH with Cy3-labeled (A) probe EUB338,CARD-FISH with HRP-labeled EUB338 probe and Oregon Green 488-labeled (B) tyramide; Exposure times were 1.0 s for FISH and 0.2 s for CARD-FISH(unpublished data)

1.5 酪胺熒光信號擴(kuò)增

熒光信號的擴(kuò)增過程是多個連有熒光素的酪胺分子在辣根過氧化氫酶的催化作用下，形成沉淀物在細(xì)胞內(nèi)不斷累積的過程。如圖3所示，針對同一樣品，CARD-FISH的熒光信號要顯著高于FISH，且CARD-FISH熒光信號有較高的穩(wěn)定性，能顯著提高目標(biāo)微生物的檢測率，保證了細(xì)胞計數(shù)及后續(xù)實驗的可操作性。在實驗中常在擴(kuò)增緩沖液中加入10%～30%的硫酸葡聚糖和不同濃度的無機(jī)鹽[16,46]。酪胺濃度也是影響擴(kuò)增效率的重要因素，一般隨著濃度的升高，細(xì)胞熒光值也會越高。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)過高的酪胺濃度會導(dǎo)致較高的熒光背景值從而干擾目標(biāo)微生物的檢測率[12]。

2 CARD-FISH技術(shù)的應(yīng)用

近年來，隨著CARD-FISH技術(shù)的迅速發(fā)展和優(yōu)化，適用于不同樣品和研究目的的方法逐漸成熟，如mRNA-FISH、gene-FISH等技術(shù)可以鑒定環(huán)境樣品中微生物的系統(tǒng)分類及生理功能信息等。此外，CARD-FISH技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)合使用可以獲得微生物的更多信息，如CARD-FISH與同位素示蹤技術(shù)、NanoSIMS、SEM/EDX等的結(jié)合，成為耦合研究復(fù)雜環(huán)境中微生物物種組成及其生理功能的有力工具。

2.1 研究環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能

在復(fù)雜環(huán)境中同時獲得微生物的系統(tǒng)分類信息及其代謝功能是微生物學(xué)研究的難點和熱點。以rRNA為靶序列，僅能獲得其系統(tǒng)發(fā)育信息，但不能揭示其原位環(huán)境的代謝功能。mRNA-FISH是探究微生物原位生理代謝的解決辦法之一，然而mRNA在細(xì)胞內(nèi)非常不穩(wěn)定且數(shù)量較少。1998年Wagner等[47]首次以iap(invasion-associated protein)-mRNA為靶序列成功地采用CARD-FISH標(biāo)記到含有目標(biāo)基因的微生物細(xì)胞。 2002年Bakermans等[48]采用FISH和TSA的方法在被污染的地下水中檢測到轉(zhuǎn)錄萘雙加氧酶的mRNA。這些研究中都提出，在雜交前對細(xì)胞用脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)處理，以去除DNA的干擾，同時在熒光顯微鏡觀察時加大曝光時間(>10 s)來獲得更清晰的熒光信號，都能有效地提高mRNA的檢出效率。另外，有兩次熒光擴(kuò)增過程的TSA-FISH也能提高檢測mRNA的靈敏度[16]。Pernthaler等[49]將rRNA和mRNA同時作為靶序列進(jìn)行FISH，研究了甲烷氧化菌中編碼甲烷單氧化酶A亞基pmoA在環(huán)境中的表達(dá)，這是首次采用rRNA-FISH和mRNA-FISH相結(jié)合的方法將微生物的系統(tǒng)發(fā)育信息和功能活性聯(lián)系起來。依據(jù)該方法，Pratscher等[50]對土壤中的氨氧化古菌進(jìn)行研究，采用CARD-FISH將土壤中氨氧化古菌的16S rRNA及編碼其氨單氧化酶A亞基amoA基因的mRNA同時進(jìn)行定量，直接反映了原位環(huán)境中氨氧化古菌的功能活性。最近，mRNA-FISH和熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)相結(jié)合也成為研究原位環(huán)境微生物生理生態(tài)的主要方法之一，Cesar等采用CARD-FISH檢測污泥中亞硝酸鹽還原菌中編碼亞硝酸鹽還原酶nirS的mRNA基因，隨后采用流式細(xì)胞儀分選出被熒光標(biāo)記的細(xì)胞，進(jìn)一步對這些細(xì)胞采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)和測序技術(shù)明確了目標(biāo)微生物分類信息[51]，該方法對探究未知種屬微生物的功能及其活性具有重要參考價值。

近些年，在染色體或者微生物DNA上檢測基因序列逐漸發(fā)展起來，這類熒光原位雜交稱為Gene-FISH[52-54]。DNA相較于RNA有更好的穩(wěn)定性，且在DNA上檢測基因序列對推測微生物的潛在功能有重要意義，但是其拷貝數(shù)通常非常低。Kawakami等[52]首次采用兩步TSA-FISH擴(kuò)增熒光信號，成功標(biāo)記到產(chǎn)甲烷菌的甲基輔酶還原酶 (Methyl coenzyme M reductase,mcrA)基因，其采用的鎖核酸探針也同時提高了雜交的效率和特異性，但該方法的檢測效率仍然僅在15%。隨后，采用兩步TSA-FISH結(jié)合雙鏈DNA多核苷酸探針進(jìn)行步驟優(yōu)化，將檢測效率顯著提高到約98%[53]，該研究在底泥中檢測到腺苷-5′-磷酸硫酸激酶α亞基基因和mcrA基因。此外，Moraru等[54]首次采用CARD-FISH在海水中同時檢測到氨氧化古菌的16S rRNA基因和amoA基因，該研究的檢測效率大約為40%。為提高此技術(shù)的檢測效率，Petersen等[57]提出采用四個雙鏈DNA多核苷酸探針對目標(biāo)基因的不同位置進(jìn)行同時雜交，有效提高了Gene-FISH的靈敏度?？傊?，以rRNA和DNA為基礎(chǔ)的CARD-FISH的發(fā)展為原位研究復(fù)雜環(huán)境微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能提供了很好的技術(shù)支撐。

2.2 以CARD-FISH為基礎(chǔ)的儀器聯(lián)用

2.2.1 CARD-FISH與NanoSIMS聯(lián)用在微生物生態(tài)上的應(yīng)用 不同的科研儀器在分析對象、精確度、樣品要求等方面各有差異，在微生物研究中常常需要同時獲得微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育信息及生理功能等信息，這就要求不同的科研儀器聯(lián)用來達(dá)到研究目的。如圖4所示，CARD-FISH與不同的技術(shù)聯(lián)用，使得耦合分析微生物的多種生物學(xué)信息，極大地擴(kuò)展了其在微生物研究中的應(yīng)用價值。目前，CARD-FISH技術(shù)與NanoSIMS的聯(lián)合使用在微生物學(xué)研究中已有較為成熟的應(yīng)用。 兩者的首次聯(lián)用是在2001年Orphan等利用FISH與SIMS結(jié)合的方法，證實了海洋沉積物中存在的厭氧甲烷氧化古菌能夠代謝13C-CH4[58]，該技術(shù)聯(lián)用能同時獲得微生物單細(xì)胞水平的分類信息和代謝功能。但NanoSIMS只能對樣品的同位素進(jìn)行分析，無法獲得其熒光信息，且NanoSIMS的測定精度在納米到微米級別，在數(shù)以萬計的細(xì)胞中找到目標(biāo)微生物成為難題。為解決這一問題，有研究采用激光顯微切割儀(Laser microdissection microscope，LMD), 將其激發(fā)光調(diào)至CARD-FISH的熒光激發(fā)波長，找到目標(biāo)微生物對其周圍進(jìn)行激光標(biāo)記[59-60]，該標(biāo)記使得在NanoSIMS儀器上通過識別標(biāo)記的區(qū)域，快速精準(zhǔn)地找到目標(biāo)微生物進(jìn)行測定。如Milucka等[61]采用此方法針對湖泊水體中活性甲烷氧化微生物進(jìn)行研究，水體首先進(jìn)行13C-CH4的同位素標(biāo)記短期培養(yǎng)，通過CARD-FISH分別識別培養(yǎng)的水體中的隸屬于變形菌Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria種屬的甲烷氧化細(xì)菌，并對這些細(xì)胞周圍進(jìn)行LMD標(biāo)記，隨后NanoSIMS對目標(biāo)微生物進(jìn)行13C的分布及含量測定，結(jié)果表明Gamma種屬的甲烷氧化菌主導(dǎo)了所研究水體的隸屬于變形菌甲烷氧化過程。 此外，CARD-FISH/FISH結(jié)合NanoSIMS也應(yīng)用于研究參與氮、硫等生物地球化學(xué)循環(huán)的微生物。如Fike等[62]采用此方法首次在單細(xì)胞水平，通過測定34S的豐度研究了高鹽環(huán)境下微生物墊中的活性硫酸鹽還原菌群，揭示了硫酸鹽還原菌與硫化物空間分布的關(guān)系以及菌群內(nèi)部的代謝異質(zhì)性。Halm等[63]運用此技術(shù)聯(lián)用方法，針對復(fù)雜的水體環(huán)境樣品鑒定出厭氧層中發(fā)揮固氮作用的微生物主要是占總微生物數(shù)量比例很小的綠硫細(xì)菌Chlorobiumtepidum/Cphaeobacteroidesy。Dekas等[64-65]采用此方法,發(fā)現(xiàn)甲烷厭氧古菌ANME-2和細(xì)菌Desulfosarcina/Desulfococcus(DSS)的聚合體間存在元素遷移，ANME-2將固定的N元素轉(zhuǎn)運給DSS細(xì)菌。最近，Musat等[66]對CARD-FISH對后續(xù)同位素測定的影響進(jìn)行了評估，研究表明CARD-FISH實驗過程對細(xì)胞不同元素的同位素含量的影響有差異，且所測同位素誤差與細(xì)胞所在的生長發(fā)育階段有關(guān)。

圖4 熒光原位雜交技術(shù)與相關(guān)技術(shù)聯(lián)合使用應(yīng)用于環(huán)境微生物的技術(shù)路線圖Fig.4 Diagram of the major steps in combining using FISH with other techniques in environmental microbiology studies

近幾年發(fā)展起來的鹵素原位雜交(Halogeninsituhybridization，HISH)與NanoSIMS聯(lián)用也常用于研究微生物單細(xì)胞水平的生理生態(tài)功能。HISH-FISH是采用HRP標(biāo)記的探針和連有鹵素元素(如氟、氯)的酪胺進(jìn)行雜交和熒光擴(kuò)增，在目標(biāo)微生物中沉積了大量鹵素元素，這樣使得NanoSIMS可以通過測定鹵素元素的分布從而確定目標(biāo)微生物的位置[59]。Musat等[59]采用此技術(shù)對湖泊水體中三種厭氧光合細(xì)菌Chromatiumokenii、Lamprocystispurpurea和Chlorobiumclathratiforme的碳氮利用效率進(jìn)行了研究，向水體中加入13CO2和15NH4+作為以上三種細(xì)菌的碳源和氮源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同種菌群不同細(xì)胞的碳氮代謝速率有很大差異，不同菌群間的差異顯著。NanoSIMS同位素測定結(jié)合CARD-FISH計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞總量僅占總微生物群落0.03% 的C.okenii，卻同化了70%的總碳和40%的總氮，研究指出代謝活性最強(qiáng)的微生物不一定在數(shù)量上占優(yōu)勢[59]。綜上所述，以上這些CARD-FISH與NanoSIMS的聯(lián)用為在單細(xì)胞水平，探索參與元素生物地球化學(xué)循環(huán)的微生物生態(tài)功能提供了強(qiáng)有力的研究方法。

2.2.2 CARD-FISH與其他儀器的聯(lián)用 CARD-FISH與其他光學(xué)、電子學(xué)儀器，如顯微放射自顯影術(shù)(microauutoradiography, MAR)、SEM/EDX、流式細(xì)胞儀等儀器的聯(lián)用也成功應(yīng)用于微生物的研究中(圖4)。CARD-FISH-MAR的技術(shù)路線是首先采用放射性同位素標(biāo)記的底物培養(yǎng)微生物底物，在對細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交后，通過微量自動照相集成技術(shù)對微生物進(jìn)行分類鑒定和底物代謝特性研究[68-69]。例如Teira等[70]采用CARD-FISH-MAR用3H-天冬氨酸對深海水體進(jìn)行短期培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)深海古菌數(shù)量遠(yuǎn)高于細(xì)菌數(shù)量，且古菌代謝天冬氨酸的速率比細(xì)菌高。Schmidt等[71]聯(lián)用CARD-FISH和SEM-EDX等技術(shù)，使得在鑒定微生物分類水平的同時，也獲得更高分辨率的細(xì)胞形態(tài)信息，該方法被稱為“Gold-FISH”，其原理是通過在酪胺上同時結(jié)合了熒光素、納米金粒子和鏈酶親和素，經(jīng)過熒光擴(kuò)增后，目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)沉積了大量熒光素的同時，也有納米金粒子的沉積，這使得不僅可以在熒光顯微鏡下檢測目標(biāo)微生物的數(shù)量，且可以通過SEM-EDX檢測金元素的分布而獲得目標(biāo)微生物的高分辨率形態(tài)結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀是對微生物細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)的常用方法之一，CARD-FISH與流式細(xì)胞儀的結(jié)合可以針對復(fù)雜環(huán)境樣品進(jìn)行特定微生物的計數(shù)和分離。該聯(lián)用方法要求CARD-FISH的全部過程在懸浮液中進(jìn)行，每一步完成后通過離心收集細(xì)胞，然后使用熒光激活流式細(xì)胞儀對有熒光的目標(biāo)微生物進(jìn)行計數(shù)[72]。此外，Sekar等[73]采用此方法對海洋水體中細(xì)菌進(jìn)行分離，并對流式細(xì)胞儀分離出的細(xì)胞進(jìn)行16S rRNA測序獲知細(xì)菌群落組成信息，這一方法為研究水體環(huán)境中微生物多樣性和單細(xì)胞基因組學(xué)為基礎(chǔ)的生理代謝分析提供新的思路。此外，Huang等首次結(jié)合FISH和拉曼(Raman)光譜儀研究了細(xì)菌Pseudomonas單細(xì)胞水平降解13C-萘的活性[74]，也為CARD-FISH與拉曼光譜儀的聯(lián)用提供堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。

3 小 結(jié)

CARD-FISH技術(shù)的發(fā)展顯著地提高了其在環(huán)境微生物研究中的科學(xué)研究價值和應(yīng)用開發(fā)意義，并且已經(jīng)在單細(xì)胞水平研究環(huán)境微生物的原位生理生態(tài)功能方面顯示出很大的優(yōu)勢和重要的應(yīng)用前景。CARD-FISH克服了FISH的熒光不穩(wěn)定性、信號弱等內(nèi)在技術(shù)瓶頸，極大地促進(jìn)了FISH技術(shù)在探究環(huán)境中豐度較低或極低微生物的應(yīng)用。同時，CARD-FISH的高度靈敏性使其不僅能夠針對微生物細(xì)胞的16S rRNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育信息鑒定，更能對mRNA和DNA上的功能基因進(jìn)行檢測，來探究環(huán)境樣品中代謝活躍的微生物生理過程和潛在生態(tài)功能[17]。隨著各種光學(xué)、電子學(xué)等儀器在微生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如本文重點討論的NanoSIMS、SEM/EDX、流式細(xì)胞儀等，CARD-FISH與這些技術(shù)的聯(lián)用將為環(huán)境微生物學(xué)研究提供更多關(guān)于微生物類群和功能的信息，解決單一研究方法無法確定并準(zhǔn)確回答的科學(xué)難題。尤其是CARD-FISH、同位素示蹤技術(shù)與NanoSIMS的聯(lián)用突破了以往在群落水平研究環(huán)境微生物的生理代謝功能，進(jìn)一步精準(zhǔn)地在單細(xì)胞水平識別不同微生物在物質(zhì)代謝中的活性和貢獻(xiàn)率，對定向發(fā)掘自然環(huán)境中的微生物資源有重要意義[75]。未來開發(fā)CARD-FISH與相關(guān)微生物技術(shù)的聯(lián)用，應(yīng)用于研究參與生物地球化學(xué)循環(huán)的關(guān)鍵功能微生物、微生物物質(zhì)代謝機(jī)制、篩選高效污染物降解菌等方面，將具有良好的發(fā)展前景。

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