曹 亮， 宋 榮， 周佳民， 朱校奇， 謝 進(jìn)， 徐 瑞， 黃艷寧

(湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源利用研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

黃秋葵(Abelmoschusesculentus(L.) Moench)又名咖啡秋葵、羊角豆、美人指 (lady′s finger) 等，是錦葵科秋葵屬一年生草本植物，在我國(guó)引種栽培已經(jīng)有較長(zhǎng)時(shí)間[1]。黃秋葵嫩莢含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸、凝集素等多種營(yíng)養(yǎng)功能成分[2]，有降血脂[3]、抗氧化[4-5]、抗疲勞[6-8]、抗菌[9]及治療糖尿病[10]等藥用保健價(jià)值。在印度、巴基斯坦等地是主要蔬菜品種，在我國(guó)逐漸成為一種新型的保健蔬菜，受到人們的青睞，在我國(guó)熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛栽培[11]，但是黃秋葵忌連作，其病害發(fā)生較普遍，國(guó)外報(bào)道的主要有黃脈花葉病毒(YVMV)[12]、束頂病[13]，以及卷葉病毒[14]等，黃秋葵在國(guó)內(nèi)也有關(guān)于煙粉虱傳雙生病毒[15]的報(bào)道；此外還有疫病[16]、立枯病等病害的報(bào)道[17]及蟲(chóng)害[18]的研究。作者也于 2011 年在湖南衡陽(yáng)和長(zhǎng)沙的黃秋葵種植大田發(fā)現(xiàn)一種黃秋葵花蕾真菌病害，此后，一直在田間能觀察到此病害的發(fā)生，特別是在 6～7 月份的高溫多雨季節(jié)發(fā)生尤為嚴(yán)重，該病害主要感染黃秋葵花蕾，表現(xiàn)為花蕾表面覆蓋一層毛茸茸的霉層，花冠腐敗，黏覆在子房的外圍，阻礙子房發(fā)育；如遇持續(xù)的陰雨天氣，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致子房腐爛，影響果實(shí)形成(圖 1)。該病在不同植株間傳播，可導(dǎo)致黃秋葵嚴(yán)重減產(chǎn)。因此，明確該病害的病原菌，對(duì)于黃秋葵的栽培生產(chǎn)尤為重要，本研究對(duì)發(fā)現(xiàn)的黃秋葵病原菌進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)田間致病力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 帶病組織材料 帶病的黃秋葵花蕾材料于2012年自衡陽(yáng)市衡南縣江口鎮(zhèn)九龍生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司基地采集(圖 1)。用牛皮紙袋包裝后放入事先裝有冰袋的保鮮盒，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離。

1.1.2 試劑與儀器 PDA培養(yǎng)基(含鏈霉素100 μg/mL，防止細(xì)菌生長(zhǎng))，查氏瓊脂(CA)培養(yǎng)基，Taq酶(東洋紡)，瓊脂糖 (biowest)，引物及測(cè)序(上海生工)；滅菌鍋(LDZH-100KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)，凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1D，江蘇蘇凈集團(tuán))，生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，PCR儀(德國(guó)Eppendorf)，EPS 300電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(UB100i， 重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 用無(wú)菌鑷子從帶病組織表面挑取真菌孢子至滅菌蒸餾水中，平板劃線法接種到裝有15 mL PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～5 d。待產(chǎn)孢子后，挑取孢子制備孢子懸浮液，劃線接種法接種到新的 PDA 平板培養(yǎng)基，采用相同接種方法，連續(xù)接種 5 次對(duì)菌株進(jìn)行純化，然后挑取菌絲接種到 PDA 試管斜面中，4 ℃ 保存。

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察及鑒定 觀察染病花蕾組織表面病原菌的生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征。并將分離的待測(cè)菌株在PDA 和 CA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d，觀察菌落形態(tài)特征，在光學(xué)顯微鏡下觀察待測(cè)菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)特征，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3 病原菌的分子鑒定 使用真菌分子鑒定的 ITS 序列通用引物 ITS 1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS 4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 對(duì)真菌核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS 1- 5.8 S- ITS 2) 的序列進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后使用 BioEdit 軟件打開(kāi)測(cè)序圖譜，去掉兩端引物信號(hào)，在 NCBI 中進(jìn)行 Blast 比對(duì)，并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，確定菌株 ITS 序列的分類(lèi)特征，進(jìn)行分子鑒定。

1.2.4 致病性測(cè)定 ① 花蕾回接測(cè)試：將分離得到的菌株在 PDA平板培養(yǎng) 3 d，獲得活化的病原菌。剪取健康花蕾，整齊放入滅菌保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室作為供試材料。將花蕾用酒精表面消毒，放入裝有 20 mL PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中；使用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面，獲得孢子懸浮液，在無(wú)菌條件下過(guò)濾，稀釋并用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，使用濃度約為 1×106個(gè)/mL 的孢子懸浮液 10 μL 接種，用移液槍吸取孢子懸浮液滴加到花冠上，對(duì)照組用無(wú)菌水 10 μL 接種，每組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。在生化培養(yǎng)箱中 28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察花蕾變化并記錄，花蕾發(fā)病后從帶病組織再次分離培養(yǎng)病原菌，并與原接種菌株進(jìn)行比較。② 田間致病性測(cè)試：選擇晴天上午 10 點(diǎn)至 12 點(diǎn)之間進(jìn)行，利用上述分離病原菌進(jìn)行大田致病性測(cè)定。選取沒(méi)有病害發(fā)生的栽培地塊，接種 100 μL 濃度約為 1×106個(gè)/mL 的孢子懸浮液到健康花蕾上，空白對(duì)照接種 100 μL 滅菌蒸餾水，每個(gè)處理設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取 5 朵花蕾，接種后用透明袋套住花蕾。每天觀察發(fā)病情況及發(fā)病特征并做記錄，持續(xù) 1 周。該實(shí)驗(yàn)重復(fù) 1 次。對(duì)染病花蕾進(jìn)行病原菌分離，并與原接種菌株進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌形態(tài)觀察及分離純化

病菌在花蕾組織表面生長(zhǎng)旺盛，肉眼可見(jiàn)白色，長(zhǎng)度為 3～5 mm 分生孢子梗及暗褐色微小的分生孢子頭密集分布于花蕾表面，使整個(gè)花蕾呈毛茸茸狀(圖 1)。通過(guò)分離純化方法獲得了 1 株真菌的純化菌株。該菌株在 PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，28 ℃培養(yǎng) 3 d 菌落直徑達(dá) 4～5 cm，中心呈暗褐色，菌落背面平坦呈放射狀。

圖1 染病的黃秋葵花蕾及子房Fig.1 infected bud and ovary of A. esculentus A：染病花蕾；B：染病子房A: infected bud； B: infected ovary

2.2 病原菌致病性測(cè)定

2.2.1 花蕾回接測(cè)試 利用上述菌株進(jìn)行室內(nèi)回接致病性測(cè)定，結(jié)果顯示在 28 ℃培養(yǎng) 2 d 后，接種孢子的花蕾染病，癥狀與染病花蕾相同，而空白沒(méi)有染病。從接種發(fā)病的花蕾上，重新分離純化獲得的真菌株，其培養(yǎng)性狀與前期接種菌株的性狀相同，見(jiàn)圖 2。

圖2 黃秋葵花蕾回接試驗(yàn)Fig.2 Pathogenicity test on flower of A. esculentus A：接種前；B：接種后；圖3同A: before inoculation；B: after inoculation

2.2.2 病原菌田間致病性測(cè)定 田間試驗(yàn)表明黃秋葵的花蕾在接種孢子后 2 d 左右表現(xiàn)出病害，見(jiàn)圖3。接種孢子致病率為 80%，空白對(duì)照的致病率為零。花蕾染病后，整個(gè)花蕾外觀為毛茸茸的球狀，后期枯死變黑，發(fā)病特征與田間取樣的病害特征一致。染病花蕾經(jīng)再分離試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離菌株與接種菌株一致。根據(jù)柯赫氏法則 (Koch′s postulate)，該菌株為黃秋葵花蕾的致病菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定 菌株在 CA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，28 ℃ 培養(yǎng) 7 d 菌落直徑為 2.5～4.0 cm，菌落中心下凹、四周突起、邊緣呈放射狀，質(zhì)地疏松，生長(zhǎng)初期呈白色，后期表面產(chǎn)生褐色干粉，菌落呈圓形；在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，28 ℃培養(yǎng) 7 d 菌落布滿整個(gè)平板，質(zhì)地緊密，呈絲絨狀，氣生菌絲較多，中心下凹、四周突起，背面平坦放射狀，呈褐色，菌落表面有干粉，無(wú)滲出液。鏡檢可見(jiàn)足細(xì)胞，分生孢梗莖不分枝也不具分隔，表面光滑，無(wú)色或淡褐色，頂囊明顯，初生時(shí)呈橢圓形，后呈球形，直徑 50～65 μm，頂囊和孢梗莖接連處無(wú)縊縮現(xiàn)象，表面可育，呈褐色，可見(jiàn)瓶梗細(xì)胞，分生孢子球形，表面粗糙具小刺、疣，直徑約 5 μm，可見(jiàn)不分枝的分生孢子鏈，分生孢子頭呈球形(圖 4)。參照傳統(tǒng)的真菌分類(lèi)方法[19]，初步鑒定此病原菌屬于曲霉屬 (Aspergillus) 真菌。

圖3 田間測(cè)試棘孢曲霉對(duì)黃秋葵花蕾的致病性Fig.3 Pathogenicity of A. aculeatus to the buds of A. esculentus in culture field

圖4 病原真菌培養(yǎng)特征和產(chǎn)孢形態(tài)Fig.4 Cultural features and sporulation structure of the pathogen A. aculeatus A：PDA培養(yǎng)基上菌落；B：分生孢子梗及分生孢子頭；C：孢子A:Colony features on PDA；B:conidiophone and conidial head；C:Conidium

2.3.2 分子鑒定 通過(guò) ITS 通用引物擴(kuò)增，測(cè)序后進(jìn)行序列分析，獲得 537 bp 的 DNA 片段。該菌株ITS 序列在 GenBank 登錄序列號(hào)為 KM014690.1。通過(guò) Blast 分析，獲得該序列與 GenBank 中序列的比對(duì)結(jié)果，下載與該序列比對(duì)結(jié)果最相近的前 20 條序列，它們的 E 值都為零，相似度(Ident)都在 99%以上，使用 bioedit 和 mega 5.05 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，使用 UPGMA、鄰接(neighbour joining)及最大相似度(maximum likelihood)算法構(gòu)建樹(shù)形圖(圖 5)。發(fā)現(xiàn)以上三種樹(shù)形圖中該序列都與已登錄的棘孢曲霉Aspergillusaculeatus序列聚集為一類(lèi)，因此鑒定該病原真菌為棘孢曲霉。

圖5 原菌序列 (KM014690.1) 與比對(duì)序列的聚類(lèi)(鄰接法 )Fig.5 Cluster tree of pathogenic sequence(KM014690.1)and the significant alignments (neighbour joining)

3 討 論

目前報(bào)道的棘孢曲霉主要分離自谷物及土壤等，能產(chǎn)生豐富的酶類(lèi)，具有良好的降解活性，如產(chǎn)生多糖降解酶[20]，可用于農(nóng)業(yè)廢棄物的降解，產(chǎn)生甜菊糖降解酶能將甜菊糖轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物[21]，能與蠶砂發(fā)酵產(chǎn)生果膠酶[22]，可產(chǎn)生果糖寡聚體酶[23]，此外棘孢曲霉產(chǎn)生柚苷酶的發(fā)酵條件及柚苷酶在柑橘果汁脫苦中的應(yīng)用也有較多報(bào)道[24]。而黃秋葵花蕾富含多糖和果膠等營(yíng)養(yǎng)成分，這可能為棘孢曲霉的繁殖提供了良好的碳源，從而使該真菌迅速繁殖，導(dǎo)致了花蕾的快速腐敗并影響子房發(fā)育，這可能是該菌成為黃秋葵花蕾致病菌的原因之一。

黃秋葵的主要食用部位為嫩果，花期后5～7 d即可采收黃秋葵嫩果食用[25]，在此期間營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)最高[26]。由于采收期較短，因此對(duì)該病害的防治不宜噴灑農(nóng)藥及抗菌劑。從病害發(fā)生的環(huán)境條件及發(fā)病規(guī)律來(lái)看，該病主要發(fā)生在高溫多雨季節(jié)，因此，可能是一種條件致病菌。如何降低病害的發(fā)生，減少病害的影響，是保障黃秋葵產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，因此本課題組下一步將對(duì)該病原菌的綜合防治進(jìn)行研究。

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