陶永佳， 李 根， 薛永常

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034)

脂肪酸代謝途徑是生物體內(nèi)主要的代謝途徑[1]，其產(chǎn)物主要被利用作為細胞膜的合成，而一些產(chǎn)物用作群體感應和蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾[2]。酰基載體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)作為脂肪酸合酶(Fatty acid synthases，F(xiàn)AS)的中心組件，能夠結(jié)合脂肪酸代謝途徑中各種脂肪酰基中間體，是不可或缺的輔因子[3-6]。ACP是一個小的、含量豐富、高度保守的載體蛋白，其三級結(jié)構(gòu)由三個平行的α螺旋和一個短的橫向的α螺旋組成[7-8]，這四個α螺旋束形成一個疏水性的腔，并具有高度的結(jié)構(gòu)適應性，能夠容納不同長度的?；湥Y(jié)合?；虚g體，在各種酶的活性位點之間傳遞[9-11]。ACP結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注，近幾年，主要對其三級結(jié)構(gòu)以及功能多樣性分析。本實驗室前期從海洋淺海淤泥及巖石附著藻類上篩選得到1株高產(chǎn)油脂菌，經(jīng)鑒定為海洋季也蒙畢赤酵母，本研究通過對該酵母的ACP基因的克隆，利用生物信息學網(wǎng)站和軟件對其擬表達蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)進行預測分析，對?；d體蛋白的功能深入研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 海洋季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)T-1，本實驗室篩選保藏；大腸埃希菌E.coliDH5α，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母為YPD培養(yǎng)基，陳海水配置；大腸埃希菌為LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑盒 Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒，UNIQ-10 柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；T-Vector pMDTM19試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計 以NCBI數(shù)據(jù)庫中MeyerozymaguilliermondiiATCC6260的?；d體蛋白基因序列(CH408159.1:383672-384055)為模板，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物：上游引物序列5′- ATGTTGAGAACCGCCCTT- 3′；下游引物序列 5′-TTAACAAGCATCGGGCTG -3′。交由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 mgACP基因的克隆 按照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(酵母)說明書提取海洋季也蒙畢赤酵母T-1基因組DNA，以此DNA為模板，利用上述合成的特異性引物擴增mgACP基因。PCR擴增體系：DNA模板1 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，TaqDNA Polymeras(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 采用UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1.2.2的PCR擴增產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)藍白斑篩選陽性克隆菌落，進行菌落PCR，通過質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒并用Hind Ⅲ、SacⅠ進行雙酶切驗證，陽性單克隆交由北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.4 mgACP基因的生物信息學分析 將目的基因序列測序結(jié)果，提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中ORF Finder[12]查找mgACP基因的開放閱讀框，并對獲得的氨基酸序列進行同源序列比對，利用ExPASy網(wǎng)站在線工具[13]進行蛋白生理生化特性、疏水性/親水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點預測和分析；Npsa SOPMA和SWISS-MODEL分別對蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測分析[14]。用Clustal X2進行多序列比對，通過MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 mgACP基因的克隆

2.1.1 mgACP基因的擴增結(jié)果 以海洋季也蒙畢赤酵母T-1 基因組DNA為模板，用1.2.1合成引物擴增mgACP基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在380 bp左右有1條清晰的條帶，無雜帶，與預期的大小一致，可以進行后續(xù)實驗。

圖1 mgACP基因的擴增電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of amplificationmg ACP geneM：Trans2K DNA Marker；1：mgACP基因M：Trans2K DNA Marker；1：The gene of mgACP

2.1.2 菌落PCR鑒定結(jié)果 用牙簽挑取陽性單克隆菌落，按1.2.2所述的PCR反應體系和擴增條件進行菌落PCR，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，挑取陽性單克隆菌落經(jīng)菌落PCR得到的目的基因條帶在380 bp左右有1條清晰的條帶，與預期大小一致，可以進行后續(xù)實驗。

圖2 菌落PCR凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoretic analysis of colony PCRM：Trans2K DNA Marker；1：陽性單克隆菌落M：Trans2K DNA Marker；1：Monoclonal colony of positive

2.1.3 酶切驗證結(jié)果 提取重組質(zhì)粒，用HindⅢ/SacⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。

圖3 質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoretic analysis of colony PCRM：D 2000 Marker；1：重組質(zhì)粒雙酶切；M：D 2000 Marker；1：Recombinant plasmid by double restrictionenzyme digestion

由圖3可知，陽性單克隆菌落的重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ/SacⅠ進行雙酶切，在2 500 bp和450 bp左右各有1條清晰的條帶，與預期結(jié)果一致，說明目的基因與載體正確連接，可以進行測序。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 測序結(jié)果分析 測序結(jié)果顯示，在載體上反向插入384個堿基，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，利用NCBI中的ORF Finder程序查找開放閱讀框。結(jié)果顯示，mgACP序列具有完整的開放閱讀框，編碼127氨基酸，含有磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合位點，說明該序列為?；d體蛋白基因。

2.2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用ExPASy ProtParam在線分析mgACP蛋白的理化性質(zhì)。預測結(jié)果顯示mgACP蛋白的分子式為C619H998N162O195S1，分子量為13.862 kDa，等電點為4.74，其N端為亮氨酸 (Leu)，帶負電的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)共20，帶正電的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)共13，擬表達蛋白為不穩(wěn)定性蛋白。GRAVY值為 -0.050，表明mgACP蛋白擬表達蛋白為親水性蛋白。

2.2.3 蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測和分析 利用ExPASy ProtScale在線分析mgACP蛋白質(zhì)的疏水性/親水性，結(jié)果見圖4。

圖4 mgACP親水性分析Fig.4 Hydropathy plot of the amino acid sequence of mgACP

氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強，圖4顯示MIN:-1.878，MAX: 1.622，整個多肽鏈呈親水性，因此mgACP蛋白質(zhì)為親水性蛋白，與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

2.2.4 蛋白質(zhì)信號肽預測分析 利用SignalP 4.1 Server的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對mgACP蛋白信號肽預測和分析，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，mgACP蛋白質(zhì)不存在信號肽，因此屬于非分泌型蛋白。

圖5 mgACP信號肽預測Fig.5 Signal peptide prediction of mgACP

2.2.5 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預測與分析 利用TMHMM server v.2.0對mgACP蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預測和分析，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示ACP無跨膜結(jié)構(gòu)域，與信號肽分析結(jié)果一致。

圖6 mgACP跨膜結(jié)構(gòu)域預測Fig.6 Transmembrance domin prediction of mgACP

2.2.6 蛋白質(zhì)磷酸化位點預測和分析 利用netphos 2.0 server對mgACP蛋白質(zhì)潛在的磷酸化位點預測和分析，結(jié)果見圖7。

圖7 mgACP磷酸化位點預測Fig.7 Phosphorylation site prediction of mgACP

蛋白質(zhì)的磷酸化與蛋白的功能密切相關(guān)，潛在磷酸化位點越多，可能發(fā)揮更多的功能。從圖中可以看出，mgACP蛋白質(zhì)潛在磷酸化位點有9個。

2.2.7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測和分析 用Npsa SOPMA預測mgACP的蛋白二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果見表1。該蛋白主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其中α螺旋占47.24%，延伸鏈占15.75%，無規(guī)則卷曲32.28%。無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較多，說明該蛋白并不穩(wěn)定。

2.2.8 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測和分析 利用SWISS-MODEL采用同源建模法，對mgACP蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果見圖8。從圖8中可看出，mgACP主要以α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，有4個α螺旋，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)構(gòu)基本一致，與已報道的?；d體蛋白結(jié)構(gòu)具有高度相似性。

表1 mgACP二級結(jié)構(gòu)預測

圖8 mgACP的三級結(jié)構(gòu)預測Fig.8 Prediction 3D Structure of mgACP

2.2.9 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將mgACP蛋白序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，與MeyerozymaguilliermondiiATCC 6260?；d體蛋白序列(EDK40062.2)相似度為99%。選取7株與目的菌株具有較高的同源性序列進行多序列比對(圖9)，發(fā)現(xiàn)酰基載體蛋白較為保守，并進一步用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖10。

系統(tǒng)進化樹分析表明，mgACP與季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)ATCC6260屬于同一分支，親緣關(guān)系最近，與BLAST的結(jié)果一致。

圖9 Meyerozyma guilliermondii T-1與其他酵母ACP同源氨基酸序列的多重比對Fig.9 Sequence alignment ACP from Meyerozyma guilliermondii T-1 and other homologous yeast

圖10 mgACP系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 The Phylogenetic tree of mgACP

3 討 論

本研究從海洋季也蒙畢赤酵母T-1的基因組中擴增獲得384 bp的?；d體蛋白基因序列，其編碼127氨基酸，具有?；d體蛋白家族保守區(qū)域磷酸泛酰巰基乙胺的結(jié)合位點，說明其為?；d體蛋白基因。生物信息學進一步分析顯示，該基因擬表達蛋白為不穩(wěn)定的非分泌型的親水性蛋白質(zhì)，不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，存在9個潛在的磷酸化位點，與?；d體蛋白結(jié)構(gòu)的高度適應性相符；其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)顯示主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，與已報道的?；d體蛋白結(jié)構(gòu)[7-8]具有高度相似性，為以后深入開展?；d體蛋白的功能研究提供參考。

[1] Leibundgut M, Jenni S, Frick C, et al. Structural basis for substrate delivery by acyl carrier protein in the yeast fatty acid synthase[J]. Science, 2007, 316(5822): 288-290.

[2] Perez D R, Leibundgut M, Wider G. Interactions of the acyl chain with theSaccharomycescerevisiaeacyl carrier protein[J]. Biochemistry, 2015, 54(13): 2205-2213.

[3] Liu X, Hicks WM, Silver PA, et al. Engineering acyl carrier protein to enhance production of shortened fatty acids[J]. Biotechnology for biofuels, 2016, 9: 24.

[4] Haushalter RW, Groff D, Deutsch S, et al. Development of an orthogonal fatty acid biosynthesis system inE.colifor oleochemical production[J]. Metabolic engineering, 2015, 30: 1-6.

[6] Zhu L, Cronan JE. The Conserved Modular Elements of the Acyl Carrier Proteins of Lipid Synthesis Are Only Partially Interchangeable[J]. Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(22): 13791-13799.

[7] Chung MC, Dean SN, van Hoek ML. Acyl carrier protein is a bacterial cytoplasmic target of cationic antimicrobial peptide LL-37[J]. Biochemical Journal, 2015, 470(2): 243-253.

[8] Campopiano DJ. ACP-AasS You Like It[J]. Chemistry & biology, 2014, 21(10): 1257-1259.

[9] Chan DI, Vogel HJ. Current understanding of fatty acid biosynthesis and the acyl carrier protein[J]. Biochemical Journal, 2010, 430(1): 1-19.

[10]Perez DR, Leibundgut M, Wider G. Interactions of the acyl chain with theSaccharomycescerevisiaeacyl carrier protein[J]. Biochemistry, 2015, 54(13): 2205-2213.

[11]Nguyen C, Haushalter RW, Lee DJ, et al. Trapping the dynamic acyl carrier protein in fatty acid biosynthesis[J]. Nature, 2014, 505(7483): 427-431.

[12]Rombel IT, Sykes KF, Rayner S, et al. ORF-FINDER: a vector for high-throughput gene identification[J]. Gene, 2002, 282(1): 33-41.

[13]Artimo P, Jonnalagedda M, Arnold K, et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal[J]. Nucleic acids research, 2012: gks400.

[14]Kiefer F, Arnold K, Künzli M, et al. The SWISS-MODEL Repository and associated resources[J]. Nucleic acids research, 2009, 37(suppl 1): D387-D392.

[15]Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular biology and evolution, 2013, 30(12): 2725-2729.

誠征廣告

《微生物學雜志》由中國微生物學會、遼寧省微生物學會、遼寧省微生物科學研究院主辦，為中國科技論文核心期刊、中國生物學核心期刊，被美國《化學文摘(CA)》、《英聯(lián)邦農(nóng)業(yè)文摘(CAB)》、《中國生物學文摘》、中國科學引文數(shù)據(jù)庫、CNKI中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、中國核心期刊(遴選)數(shù)據(jù)庫等國內(nèi)外重要檢索刊物及數(shù)據(jù)庫摘引和收錄，是包括工業(yè)微生物學、農(nóng)業(yè)微生物學、醫(yī)學微生物學、獸醫(yī)微生物學、生物質(zhì)資源、食用菌學、生物工程學、加工技術(shù)及各相關(guān)領(lǐng)域的綜合性刊物，是國內(nèi)外科研人員、大中專院校師生、企業(yè)人士、醫(yī)生及生物學愛好者必讀的刊物。

《微生物學雜志》創(chuàng)刊于1978年，國內(nèi)外發(fā)行，雙月刊。發(fā)行面覆蓋國內(nèi)各地的圖書館、科研院所、高校、企業(yè)、醫(yī)院及港、澳、臺、北美、澳州、西歐、日本、東南亞等地。

本刊于2013年全面改版升級。目前誠征廣告業(yè)務，真誠歡迎國內(nèi)外廠商和讀者來此發(fā)布產(chǎn)品、技術(shù)和服務信息，刊登試驗及生產(chǎn)設(shè)備、儀器、試劑等各方面的廣告。

地址：遼寧省朝陽市雙塔區(qū)龍山街四段820號《微生物學雜志》編輯部

郵編：122000 信箱：lnwswxh@126.com

帳戶：工行朝陽市燕都支行 戶名：遼寧省微生物學會

帳號：0713020209249067528

電話：0421-2976841 0421-2914613 聯(lián)系人：孫翠煥