馬笑雪， 徐 佳， 胡 健

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 病原生物教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110034； 3.宜興市中醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)科,江蘇 宜興 214200)

金黃色葡萄球菌是人類(lèi)重要的病原體之一，具有較強(qiáng)的毒性，能在醫(yī)院環(huán)境或社區(qū)環(huán)境中引起廣泛的感染性疾病，如皮膚黏膜感染﹑肺炎﹑心內(nèi)膜炎﹑骨關(guān)節(jié)炎﹑毒性休克綜合征及敗血癥等[1]。自20世紀(jì)40年代青霉素大規(guī)模投入使用后，感染一度得到了控制，然而很快第1株青霉素耐藥金葡菌(PRSA)從臨床標(biāo)本中分離出來(lái)，PRSA能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶催化水解青霉素的β-內(nèi)酰環(huán)結(jié)構(gòu)從而耐藥。至1959年，依靠能夠抵抗β-內(nèi)酰胺酶的新藥甲氧西林的研發(fā)引入臨床使用，才阻止了PRSA的流行。然而很快于1961年對(duì)甲氧西林耐藥的金葡菌(MRSA)出現(xiàn)了[2]。糖肽類(lèi)抗生素萬(wàn)古霉素于1958年批準(zhǔn)上市應(yīng)用于臨床。萬(wàn)古霉素一經(jīng)問(wèn)世就被廣泛應(yīng)用于革蘭陽(yáng)性菌的治療，尤其在20世紀(jì)80年代萬(wàn)古霉素被廣泛應(yīng)用于治療菌血癥、心內(nèi)膜炎等重癥MRSA感染，被譽(yù)為嚴(yán)重MRSA感染的最后一道防線(xiàn)。 然而，隨著MRSA感染率的上升和萬(wàn)古霉素的不合理應(yīng)用，對(duì)萬(wàn)古霉素低耐藥甚至完全耐藥的金葡菌悄然產(chǎn)生[3-4](圖1)。迄今，萬(wàn)古霉素完全耐藥金葡菌(VRSA)尚屬少見(jiàn)[5]，但萬(wàn)古霉素低耐藥金葡菌有著廣泛報(bào)道，包括異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介的金葡菌(hVISA)和萬(wàn)古霉素中介耐藥金葡菌VISA[6]。為了提高VISA/hVISA的檢出率，2006年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)把金葡菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥折點(diǎn)進(jìn)行了更新，新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：MIC≤2 μg/mL為萬(wàn)古霉素敏感金葡菌(VSSA); 4～8 μg/mL為中介耐藥(VISA)；≥16 μg/mL為完全耐藥(VRSA)[6-7]。CLSI中沒(méi)有關(guān)于hVISA的明確定義。研究表明，hVISA是VISA前體，其親代細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，而其子代中含有少量對(duì)萬(wàn)古霉素中介耐藥(MIC≥4 μg/mL)的細(xì)菌亞群，出現(xiàn)頻率為10-6甚至更高，并且該亞群能在不含萬(wàn)古霉素的培養(yǎng)基上連續(xù)傳代9 d以上仍保持其耐藥性不變[8](圖2)。

圖1 金葡菌耐藥年代變遷Fig.1 Timeline of antimicribial resistance history for S. arueus

圖2 首株VISA/hVISA的發(fā)現(xiàn)及hVISA定義Fig.2 The first reported VISA Mu50 and hVISA Mu3 and the definition of hVISA

1 VISA/hVISA的流行病學(xué)歷史

1997年，平松啓一教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了世界上首例萬(wàn)古霉素低度敏感的金葡菌VISA菌Mu50(MICvan=8)和hVISA菌 Mu3(MICvan=3)[8-9]。Mu50 (ATCC700699)從一名接受心臟手術(shù)的4月齡患者身上分離出來(lái)，患者在術(shù)后2周出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，其胸骨切口膿性分泌物處標(biāo)本分離培養(yǎng)出MRSA。隨后，患者接受萬(wàn)古霉素治療29 d，之后以阿貝卡星加氨芐西林/舒巴坦聯(lián)合治療以及外科清創(chuàng)，最終痊愈。同年，平松教授團(tuán)隊(duì)從一名患者的痰標(biāo)本中分離出hVISA-Mu3(ATCC700698)，該患者為肺癌術(shù)后并發(fā)肺炎的男性患者。之后鑒定Mu3的萬(wàn)古霉素MIC值為2 μg/mL。

隨后，許多國(guó)家和地區(qū)報(bào)道了VISA/hVISA的流行，不同報(bào)告之間hVISA的發(fā)生率存在一定的差異，主要是由地域差別﹑不同患者人群﹑不同臨床機(jī)構(gòu)及缺乏統(tǒng)一的檢測(cè)方法等造成[10]。

如表1所示，2003年，Liu等[11]通過(guò)總結(jié)之前14篇研究報(bào)道的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)從日本、韓國(guó)、香港、泰國(guó)、法國(guó)、西班牙、希臘、德國(guó)、意大利、美國(guó)等收集到的7 920株金葡菌中，鑒定為hVISA的為32株(1.76%)，其中1 868株MSSA中hVISA的發(fā)生率為0.05%。2004年Song等[12]檢測(cè)了收集自12個(gè)亞洲國(guó)家的MRSA菌，在所調(diào)查的1 349株MRSA菌株中，共檢測(cè)出hVISA 347株，發(fā)生率為4.3%，未發(fā)現(xiàn)VISA和VRSA，而來(lái)自中國(guó)的84株MRSA并未發(fā)現(xiàn)hVISA/VISA。盡管已報(bào)道的hVISA/VISA主要源自MRSA，但甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)中也可檢出hVISA/VISA[13-14]。2006年法國(guó)的一項(xiàng)研究采用三步法篩查2 300株金葡菌，發(fā)現(xiàn)其中只有7株(0.3%)是MS-hVISA[15]。2008年，美國(guó)學(xué)者Rybak等[16]調(diào)查了底特律地區(qū)從1986至2007年間1 499株MRSA中hVISA/VISA的發(fā)生率，結(jié)果顯示1986至1993年(225株)hVISA/VISA的發(fā)生率分別為2.2%/0.4%，1994至2002年(356株)為7.6%/2.3%，2003至2007年(917株)為8.3%/0.3%。法國(guó)、西班牙和德國(guó)也做了類(lèi)似的回顧性研究[17-19]。

表1 部分國(guó)家和地區(qū)報(bào)道VISA/hVISA比率

2008年來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的一項(xiàng)研究，收集了來(lái)自中國(guó)14個(gè)城市的MRSA，調(diào)查顯示在1 012株MRSA中hVISA的發(fā)生率在13%～16%之間，且報(bào)道了國(guó)內(nèi)第一例VISA-4sy39(萬(wàn)古霉素MIC=4 μg/mL)[20]。2010年，來(lái)自臺(tái)灣的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)臨床分離的1 000株MRSA中僅確認(rèn)出7株(0.7%)hVISA[21]。2012年，一項(xiàng)系統(tǒng)回顧和薈萃分析研究總結(jié)了43篇關(guān)于hVISA流行病學(xué)研究的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示MRSA中hVISA的發(fā)生率為1.3%，世界性hVISA流行率在0～73.7%之間[10]。

本課題組于2013年調(diào)查了遼寧省醫(yī)院內(nèi)分離的757株菌株結(jié)果顯示，VISA臨床菌株少見(jiàn)(0.5%)，而hVISA更為常見(jiàn)(10.0%)。2007至2010年hVISA的發(fā)生率從8.2%增長(zhǎng)至11.7%，85.7%的MRSA-hVISA和MRSA-VISA為SCCmec II型，80%的hVISA/VISA為agr II型[4]。最近，一項(xiàng)來(lái)自巴西教學(xué)醫(yī)院血液感染標(biāo)本中hVISA和VISA分離比率的調(diào)查，共檢測(cè)出6株VISA和1株hVISA[22]。

以上數(shù)據(jù)充分說(shuō)明，VISA/hVISA已經(jīng)廣泛分布于世界各國(guó)臨床醫(yī)院中，并引起了臨床醫(yī)師及微生物學(xué)者的重視。

2 VISA/hVISA表型特征變化

2.1 細(xì)胞壁增厚

電子顯微鏡下觀察金葡菌細(xì)胞壁厚度平均約為20～40 nm[23]，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是由糖和氨基酸組成的高度交聯(lián)的肽聚糖﹑磷壁酸和細(xì)胞壁相關(guān)蛋白組成。肽聚糖是由氨基糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替組成的聚糖骨架。平松教授團(tuán)隊(duì)[10]應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察Mu50菌株，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞壁存在明顯增厚的現(xiàn)象，且細(xì)胞壁厚度是對(duì)照菌株的2倍。為進(jìn)一步明確細(xì)胞壁增厚與金葡菌對(duì)萬(wàn)古霉素低度耐藥的相關(guān)性，崔龍洙等[24]從7個(gè)國(guó)家收集到16株VISA，研究發(fā)現(xiàn)這些VISA均存在細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，細(xì)胞壁增厚與糖肽類(lèi)抗生素的MIC值密切相關(guān)，其中與萬(wàn)古霉素的相關(guān)系數(shù)為0.908，與替考拉寧的相關(guān)系數(shù)為0.655。因此，臨床分離的hVISA/VISA菌株均存在不同程度的細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，且與萬(wàn)古霉素耐藥程度相關(guān)。當(dāng)VISA菌株在無(wú)藥培養(yǎng)基中連續(xù)傳代數(shù)周后，隨著VISA對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥水平逐漸降低，其細(xì)胞壁也變薄。崔龍洙等[25]研究發(fā)現(xiàn)，VISA菌株的細(xì)胞壁中未酰胺化的D-丙胺酰-D-丙胺酸殘基堆積，肽聚糖交聯(lián)減少，增強(qiáng)了結(jié)合萬(wàn)古霉素分子的能力。Hamaki等[26]通過(guò)對(duì)Mu50和Mu3的細(xì)胞壁成分研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌株相比Mu50和Mu3細(xì)胞內(nèi)的粘肽單體多了3～8倍，當(dāng)培養(yǎng)液中加入14C標(biāo)記的N-乙酰葡萄糖胺后，結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的N-乙酰葡萄糖胺數(shù)量比對(duì)照菌增加3～20倍，因此細(xì)胞壁合成活性的上升和周轉(zhuǎn)率的增加也是hVISA/VISA的共同特征。然而，也有研究表明并不是所有hVISA/VISA菌株的肽聚糖交聯(lián)都減少，某些hVISA/VISA菌株可出現(xiàn)肽聚糖交聯(lián)增加的情況[27-28]。據(jù)推測(cè)，細(xì)胞壁增厚導(dǎo)致金葡菌對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性下降的機(jī)制有以下兩個(gè)原因：一是“親和誘捕”(affinity trapping)[25]，即由于VISA中細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)減少，同時(shí)D-丙氨酰-D-丙胺酸殘基增加，結(jié)合了大量的萬(wàn)古霉素分子，阻礙其發(fā)揮殺菌作用；二是被稱(chēng)為“阻塞現(xiàn)象”(clogging phenomenon)[26]，即由于萬(wàn)古霉素與肽聚糖外層D-丙胺酰-D-丙胺酸殘基結(jié)合后，很大程度上阻塞了肽聚糖層網(wǎng)眼，萬(wàn)古霉素分子難以向細(xì)胞內(nèi)滲透到達(dá)作用靶點(diǎn)。熒光顯微鏡顯示VISA比VSSA能誘捕更多的萬(wàn)古霉素。

2.2 自溶活性增強(qiáng)

最初報(bào)道VISA菌株Mu50具有升高的自溶活性，而之后的數(shù)據(jù)表明Mu50與其他VISA一樣，具有全細(xì)胞自溶活性降低的特性，因此自溶性下降是VISA/hVISA的一個(gè)共同特點(diǎn)[29]。Koehl等[30]研究表明，VISA的自溶活性下降是菌體復(fù)雜的調(diào)控結(jié)果，與細(xì)胞壁成分、自溶酶活性、自溶素翻譯后過(guò)程以及自溶酶基因表達(dá)水平有關(guān)。Sieradzki等[31]研究認(rèn)為，自溶活性下降很可能是VISA菌株的壁磷壁酸抑制自溶酶降解肽聚糖。在萬(wàn)古霉素作用下，萬(wàn)古霉素結(jié)合在金葡菌的細(xì)胞壁上，抑制了自溶酶系統(tǒng)的活性，細(xì)菌呈多細(xì)胞簇生長(zhǎng)，直接阻礙了葡萄球菌胞壁水解酶接觸胞壁底物，從而導(dǎo)致使自溶活性下降[32]。在金葡菌中與自溶調(diào)節(jié)相關(guān)的基因?yàn)樽匀芩鼗?atl)和肽糖水解酶基因(lytM)。此外，金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory gene regulator，agr)功能的缺失也與自溶活性下降有一定的相關(guān)性[33]。在萬(wàn)古霉素存在的情況下，萬(wàn)古霉素結(jié)合到細(xì)胞壁上直接阻礙了肽聚糖水解酶活性，能解釋VISA/hVISA自溶活性降低，但是不能解釋沒(méi)有萬(wàn)古霉素作用時(shí)的VISA/hVISA自溶活性下降的現(xiàn)象。

2.3 毒力減弱

Howden等[34]應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)證明金葡菌在獲得萬(wàn)古霉素耐藥性后其毒力減弱，對(duì)宿主的適應(yīng)性發(fā)生改變，VISA/hVISA表型與促炎因子NF-kB、TNF-α、IL-1β表達(dá)降低相關(guān)。Peleg等[35]應(yīng)用無(wú)脊椎動(dòng)物大蠟螟感染模型，實(shí)驗(yàn)表明萬(wàn)古霉素MIC值高的菌株對(duì)大蠟螟的毒力降低，agr功能降低的金葡菌其毒力也降低。在應(yīng)用心內(nèi)膜炎大鼠模型的實(shí)驗(yàn)中，GISA的毒力減弱表現(xiàn)在其血液清除速度快，與GISA在心臟贅生物中的生存適應(yīng)性降低有關(guān)[36]。另有一項(xiàng)鼠敗血癥模型實(shí)驗(yàn)證明，VISA菌株的弱毒性體現(xiàn)在不能使動(dòng)物模型產(chǎn)生肝膿腫和組織壞死上[37]。一項(xiàng)臨床回顧及前瞻性研究表明，VISA/hVISA與VSSA相比具有較低的感染疾病發(fā)生率，主要因?yàn)榫Y發(fā)生比率降低[38]。另外對(duì)MRSA菌血癥患者的調(diào)查顯示，高萬(wàn)古霉素MIC菌株感染患者中休克發(fā)生比率降低。Hattangady等[39]提出，與母菌株相比，兩株VISA中編碼分泌性蛋白酶和溶血素的基因下調(diào)，相應(yīng)的基因變異與VISA毒力下降和對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性降低相關(guān)。作者提出，VISA雖不能引起急性感染，但是以逃避宿主免疫監(jiān)視的策略，促進(jìn)VISA在組織器官中持續(xù)定殖。Cameron等[40]關(guān)于鼠菌血癥模型研究提示，VISA產(chǎn)生了低于VSSA 20倍的α溶血毒素，VISA感染鼠比VSSA感染鼠的死亡率低。VISA感染鼠免疫抑制，導(dǎo)致VISA在組織器官內(nèi)持續(xù)存活。VISA對(duì)NPP(非專(zhuān)業(yè)巨噬細(xì)胞)毒性小，能在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存活。

2.4 代謝改變

Nelson等[41]發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)VISA菌株的醋酸鹽分解代謝發(fā)生障礙，在VISA中約71%菌株的醋酸鹽分解代謝下降，而在VSSA中只有8%菌株的醋酸鹽分解代謝下降。他們推測(cè)，醋酸鹽分解代謝下降導(dǎo)致VISA/hVISA的生長(zhǎng)特征發(fā)生改變、抗生素耐受、細(xì)胞死亡改變以及細(xì)胞間黏附的多聚糖合成增加。VISA中細(xì)胞壁合成需要消耗大量底物和能量，為了構(gòu)筑增厚的細(xì)胞壁，VISA需要調(diào)整相應(yīng)的細(xì)胞代謝以配合細(xì)胞壁生物合成前體的需求。Alexander等[42]通過(guò)系統(tǒng)代謝組學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)建模技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了與VISA表型相關(guān)的特異可逆的代謝改變。在JH和SG系列VISA中，六種代謝產(chǎn)物、戊糖磷酸途徑、TCA循環(huán)通路發(fā)生變化，這些代謝產(chǎn)物的變化直接或間接地與細(xì)胞壁前體的生物合成相關(guān),相關(guān)代謝基因的變異直接參與細(xì)胞代謝調(diào)整，以便支持細(xì)胞壁合成。Cmk基因代謝產(chǎn)物在嘧啶合成途徑中起作用，將變異的Cmk基因?qū)雋VISA菌株Mu3后變成了VISA。當(dāng)Cmk活性降低時(shí)UTP增多，UTP為肽聚糖合成的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物UDP-GlcNAc所必需[43]。Fdh2編碼甲酸脫氫酶，其變異能直接影響細(xì)胞壁合成，從而促進(jìn)VISA的萬(wàn)古霉素耐藥[44]。另有幾個(gè)代謝相關(guān)的蛋白變異也從VISA菌株中鑒定出來(lái)，包括參與翻譯、核酸代謝、氨基酸合成等蛋白，這些蛋白也能直接調(diào)整細(xì)胞代謝以便支持VISA的細(xì)胞壁合成。Pieper等[45]的二維凝膠電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VISA菌株VP32中參與嘌呤生物合成途徑的酶豐度顯著增加，肽聚糖水解酶LytM和SceD在胞膜中增加，D-Ala-D-Ala連接酶的豐度在細(xì)胞質(zhì)中減少。與菌株HIP5827相比，VP32中青霉素結(jié)合蛋白2(PBP2)具有顯著增高的活性。 LytM、PBP2和D-Ala-D-Ala連接酶在細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成中起催化反應(yīng)，這些酶的表達(dá)和活性變化是VP32細(xì)胞壁更新速度加快的原因。

3 VISA/hVISA基因調(diào)控分子

對(duì)于VISA/hVISA的萬(wàn)古霉素低敏感形成的分子機(jī)制迄今還沒(méi)有完全清楚?？梢源_定的是，VISA/hVISA菌株不同于VRSA菌株，在VISA/hVISA中缺少常見(jiàn)于耐萬(wàn)古霉素腸球菌質(zhì)粒上的van基因，如vanA、vanB或vanC基因。有研究提出細(xì)菌壓力學(xué)說(shuō)，某些調(diào)節(jié)基因在VISA/hVISA中萬(wàn)古霉素的耐藥形成中起了重要的作用。其中重要的有vraSR，vraSR調(diào)節(jié)系統(tǒng)在Mu50、Mu3及其他VISA菌株中表達(dá)上調(diào)[46]。vraSR是細(xì)胞壁刺激器的一部分，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的生物合成，增加細(xì)胞壁厚度[47]。vraR能活化vra操縱子和46個(gè)與細(xì)胞壁壓力調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，其中一些基因如pbpB和fmtA編碼已知或未知的細(xì)胞壁合成蛋白。二元調(diào)控系統(tǒng)GraSR也被認(rèn)為與糖肽類(lèi)耐藥相關(guān)[48]。在VISA中GraSR系統(tǒng)上調(diào)，GraSR缺失造成菌株對(duì)萬(wàn)古霉素超級(jí)敏感。GraSR通過(guò)上調(diào)dltABCD和mprF基因增強(qiáng)萬(wàn)古霉素耐藥[49]。在VISA菌株中，altA、sle1、lytM等基因和數(shù)個(gè)編碼含CHAP域蛋白的基因是下調(diào)的。數(shù)據(jù)支持二元調(diào)控系統(tǒng)walKR直接調(diào)控altA、sle1和lytM基因[50]。 另有研究檢測(cè)了IS256插入walKR啟動(dòng)子后的調(diào)控改變，揭示了walKR表達(dá)上調(diào)則萬(wàn)古霉素耐藥性降低，walKR表達(dá)下調(diào)則提高萬(wàn)古霉素耐藥性[51]。rpoB基因編碼RNA多聚酶的催化活性部位β亞單位，Mu50中rpoB基因H481Y變異能引起廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的改變，促進(jìn)了抗菌多肽耐藥[52]。另外，在VISA中也發(fā)現(xiàn)了RNA多聚酶的其他基因如rpoC或rpoD發(fā)生變異的現(xiàn)象[43]。研究表明，在VISA/hVISA中agr表達(dá)普遍下調(diào)，agr下調(diào)促進(jìn)菌體黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)生物膜形成[53]。另外有一些經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的與VISA/hVISA耐藥相關(guān)的基因，如CloP、Stp1、Cmk等。

Katayama等[44]最近的研究表明，通過(guò)向VSSA菌株N315ΔIP的基因中依次導(dǎo)入在Mu50中檢測(cè)到的6個(gè)突變位點(diǎn)，就能使N315ΔIP完全重現(xiàn)Mu50的表型特征。這六個(gè)基因突變位點(diǎn)分別是vraS中第329位點(diǎn)絲氨酸→亮氨酸，msrR中第146位點(diǎn)谷氨酸→賴(lài)氨酸，graR中第197位點(diǎn)天冬氨酸→絲氨酸，rpoB中第481位點(diǎn)組氨酸→酪氨酸，fdh2中第297位點(diǎn)丙氨酸→纈氨酸，或敲除了67個(gè)氨基酸的sle1基因 [sle1(Δ67aa)]， 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述六個(gè)變異基因直接或間接參與了細(xì)菌的生理調(diào)節(jié)，推測(cè)VISA表型是伴隨細(xì)菌生理功能的急劇變化而形成的。

4 VISA/hVISA檢測(cè)

VISA定義為菌株的萬(wàn)古霉素MIC值為4～8 μg/mL，應(yīng)用CLSI推薦的瓊脂稀釋法或肉湯稀釋法來(lái)測(cè)定MIC，應(yīng)用宏量稀釋Etest法(MET)也可測(cè)定MIC值，但是其測(cè)量值往往高于肉湯稀釋法所測(cè)值，因此不適合VISA檢查。①M(fèi)ET法[54]:將200 μL的2麥?zhǔn)蠁挝痪壕鶆蛲坎荚贐HI平皿上，然后貼上E test試紙條。判定標(biāo)準(zhǔn)：48 h后，如果MIC萬(wàn)古霉素≥8 μg/mL且MIC替考拉寧≥ 8 μg/mL或僅MET MIC替考拉寧≥ 12 μg/mL，初步判定為hVISA。②BHIA6V法[55]：美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)和CLSI推薦的用于檢測(cè)VRSA和萬(wàn)古霉素MIC值≥8 μg/mL菌株的方法，將0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)混懸液10 μL滴在瓊脂平板上，24 h和48 h后分別判定，2個(gè)以上菌落生長(zhǎng)初步判定為陽(yáng)性hVISA。BHIA6V法的敏感性和特異性分別為4.5%～12%和68%～100%。③MHA5T篩查法[56]：將10 μL的2麥?zhǔn)蠁挝痪壕鶆蛲坎荚诤婵祭瓕? μg/mL的MH平板上，于24 h和48 h后各判定一次，有1個(gè)或以上菌落生長(zhǎng)初步判定為陽(yáng)性。MHA5T法篩查hVISA，其敏感性和特異性分別為73.3%和82.7%。④BHIA3V法[57]:將 10 μL的0.5麥?zhǔn)蠁挝痪航臃N到含3 μg/mL的BHI瓊脂平板上，于24 h和48 h后各觀察一次，有1個(gè)或以上菌落生長(zhǎng)判定為陽(yáng)性。BHIA3V法的敏感性和特異性分別為100%和81.6%。⑤菌群譜型分析-曲線(xiàn)下面積(PAP-AUC)確證法[58]:取過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌的原液、10-3、10-6稀釋液均勻涂布于含萬(wàn)古霉素濃度為0.5、1.0、2.0、2.5、4.0和8.0 μg/mL的BHI平皿上，孵育48 h后計(jì)數(shù)菌落。應(yīng)用Graphpad Prism(San Diego，美國(guó))軟件繪制菌落數(shù)log對(duì)數(shù)值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度的曲線(xiàn)，并計(jì)算曲線(xiàn)下面積。與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照：AUC待測(cè)菌株/AUCMu3<0.9，VSSA；0.9≤AUC待測(cè)菌株/AUCMu3<1.3，hVISA；AUC待測(cè)菌株/AUCMu3>1.3，VISA。

以上BHIA6V法、MHA5T篩查法、BHIA3V法操作簡(jiǎn)便，適合臨床實(shí)驗(yàn)室用于篩查hVISA，PAP-AUC法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，但是其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，被國(guó)際上公認(rèn)為檢測(cè)hVISA的金標(biāo)準(zhǔn)。

5 VISA/hVISA治療

體外藥敏顯示VISA/hVISA對(duì)多種抗菌素敏感，傳統(tǒng)藥物如利福平﹑夫西地酸﹑氟喹諾酮類(lèi)等的聯(lián)合配伍均有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)VISA/hVISA有效。利福平本身在治療金葡菌感染方面有許多優(yōu)越性，具有很高的殺菌活性，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度高，并能穿透細(xì)菌生物膜，但是單劑使用利福平容易迅速耐藥，因此推薦利福平與其他活性好的抗生素聯(lián)合應(yīng)用。夫西地酸對(duì)金葡菌也有很好的活性，單劑易產(chǎn)生耐藥，被認(rèn)為是與利福平聯(lián)合應(yīng)用的候選藥物[59]。Howden等[60]研究表明，在手術(shù)清創(chuàng)后，對(duì)于一些經(jīng)過(guò)萬(wàn)古霉素治療失敗的VISA/hVISA病例，可應(yīng)用利福平聯(lián)合夫西地酸及聯(lián)合喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行治療。另有研究表明，萬(wàn)古霉素聯(lián)合利福平﹑左氧氟沙星或萬(wàn)古霉素聯(lián)合夫西地酸可有效減少萬(wàn)古霉素耐藥菌株的產(chǎn)生，以聯(lián)合夫西地酸效果最明顯[61]。萬(wàn)古霉素聯(lián)合哌拉西林-他唑巴坦或苯唑西林也對(duì)VISA具有協(xié)同抗菌作用。

利奈唑胺是人工合成的惡唑烷酮類(lèi)抗菌素，通過(guò)阻止細(xì)菌70S起始復(fù)合物形成，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，屬于抑菌劑[62]。盡管已經(jīng)有報(bào)道利奈唑胺耐藥的病例，但是其耐藥率尚低。Howden等[60]報(bào)道提示，利奈唑胺獨(dú)劑，或者利奈唑胺與利福平和夫西地酸聯(lián)合，對(duì)萬(wàn)古霉素低敏感金葡菌有效，可用于治療包括感染性心內(nèi)膜炎在內(nèi)的嚴(yán)重的VISA/hVISA感染。但是要注意在長(zhǎng)期應(yīng)用利奈唑胺治療時(shí)對(duì)組織器官的毒副作用。Teonver等[63]報(bào)道，一名安裝了心臟自動(dòng)復(fù)律除顫器的60歲患者血液培養(yǎng)出VISA，經(jīng)萬(wàn)古霉素和達(dá)托霉素治療失敗后，在使用利奈唑胺配伍T(mén)MP-SMX治療28 d，繼以利奈唑胺單獨(dú)治療6周后血液菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰。但也有報(bào)道利奈唑胺的體外實(shí)驗(yàn)沒(méi)有出現(xiàn)相同效果。因此，建議使用利奈唑胺應(yīng)對(duì)VISA/hVISA感染的證據(jù)不充分，對(duì)使用利奈唑胺或聯(lián)合其他抗生素應(yīng)對(duì)VISA/hVISA的使用效果尚需進(jìn)一步評(píng)估。

達(dá)托霉素為環(huán)形脂肽類(lèi)抗生素，是廣譜型殺菌劑，達(dá)托霉素干擾細(xì)菌胞膜對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，阻礙細(xì)胞壁肽聚糖的合成。達(dá)托霉素是治療VISA/hVISA的潛在可選藥物。在一項(xiàng)50株hVISA/VISA的調(diào)查研究中，所有菌株對(duì)達(dá)托霉素敏感，其MIC范圍在0.125～1 g/mL[64]。但是，也有研究提示在VISA/hVISA中達(dá)托霉素高耐藥比率,47株從未暴露于達(dá)托霉素的澳大利亞VISA/hVISA中，15% hVISA和38% VISA對(duì)達(dá)托霉素非敏感。值得注意的是，當(dāng)達(dá)托霉素作用于曾暴露過(guò)萬(wàn)古霉素的菌株時(shí)，能產(chǎn)生一定程度的交叉耐藥[63]。研究表明，菌株的萬(wàn)古霉素高M(jìn)IC與達(dá)托霉素的非敏感性是相關(guān)聯(lián)的。達(dá)托霉素是濃度依賴(lài)型殺菌劑，當(dāng)應(yīng)用于hVISA/VISA高負(fù)荷感染，或藥物穿透力較差組織感染時(shí)，必須提高使用劑量，以防止達(dá)托霉素耐藥導(dǎo)致治療失敗。一項(xiàng)VISA/hVISA心內(nèi)膜贅生物的體外模擬實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了應(yīng)用高劑量(達(dá)托霉素10 mg/kg/d，8 d)或劑量遞減(達(dá)托霉素10 mg/kg/d，4 d；隨后6 mg/kg/d，4 d)處理，比應(yīng)用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)劑量(達(dá)托霉素6 mg/kg/d，8 d)和劑量遞增(達(dá)托霉素6 mg/kg/d，4 d；隨后10 mg/kg/d，4 d)處理相比，能迅速減少實(shí)驗(yàn)體中VISA/hVISA菌的負(fù)荷量。對(duì)于hVISA，劑量遞減比劑量遞增的處方具有更強(qiáng)的殺菌效果(P<0.024)[65]。但以上結(jié)論缺乏相應(yīng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)支持。另外，萬(wàn)古霉素治療失敗后病例也可考慮高劑量達(dá)托霉素配伍慶大霉素、利福平、利奈唑胺、TMP-SMX或β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物治療[66]。

達(dá)巴萬(wàn)星(新一代糖肽類(lèi))是美國(guó)Vicuron制藥公司研發(fā)的第二代糖肽類(lèi)抗菌藥物，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌抗菌有較強(qiáng)的殺菌活性，體內(nèi)外抗菌活性都優(yōu)于萬(wàn)古霉素及其他常用抗菌藥物。達(dá)巴萬(wàn)星對(duì)VISA的MIC為1 μg/mL，對(duì)耐利奈唑胺的VISA/hVISA具有良好的療效[67]，MIC在0.06～2 μg/mL之間。奧利萬(wàn)星是Medicines公司開(kāi)發(fā)的新型糖肽類(lèi)抗菌藥物，研究表明， 奧利萬(wàn)星對(duì)包括耐萬(wàn)古霉素的葡萄球菌、腸球菌等革蘭陽(yáng)性菌具有良好抗菌活性，具有防止耐藥性產(chǎn)生的多重作用機(jī)制，減少耐藥形成[68]。

新型頭孢菌素如頭孢吡普，在VISA感染的心內(nèi)膜炎模型中的治療效果具有更明顯的優(yōu)越性[69]。此外，還有諸如泰利霉素、替加環(huán)素等也均有報(bào)道對(duì)VISA/hVISA有效。

6 結(jié) 語(yǔ)

金葡菌對(duì)各抗生素的耐藥往往發(fā)生在抗生素廣泛應(yīng)用于臨床之后。金葡菌從VSSA到VISA/hVISA的轉(zhuǎn)化是一個(gè)逐步演變的過(guò)程，VISA/hVISA的形成與少數(shù)金葡菌調(diào)控基因如walKR、graRS、vraSR和rpoB中的多種突變有關(guān)，另外也有一些基因變異如rpoC、rpoD、agr、msrR、fdh2、sle1等也賦予了金葡菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的各種表型。VISA/hVISA的耐藥特性似乎是通過(guò)連續(xù)的點(diǎn)突變后，伴隨著細(xì)菌的代謝生理方面的變化，通過(guò)多種方式獲得。VISA/hVISA中相應(yīng)基因的變異同時(shí)也是VISA/hVISA對(duì)宿主毒力減弱、持續(xù)定殖及對(duì)宿主適應(yīng)性改變的遺傳基礎(chǔ)。為了預(yù)防和控制VISA/hIVSA感染，應(yīng)全面了解其生物學(xué)特性﹑流行概況﹑表型特征及耐藥分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便有效的檢驗(yàn)方法，探索制定以萬(wàn)古霉素為主靈活配伍現(xiàn)有抗生素的治療策略，積極開(kāi)發(fā)新興抗生素，達(dá)到有效防治的目的。

[1] Dayan GH, Mohamed N, Scully I，et al.Staphylococcusaureus: the current state of disease, pathophysiology and strategies for prevention. pathophysiology and strategies for prevention[J]. Expert Rev. Vaccines, 2016, 15(11):1373-1392.

[2] Nordmann P, Naas T, Fortineau N, et al. Superbugs in the coming new decade; multidrug resistance and prospects for treatment ofStaphylococcusaureus,Enterococcusspp. andPseudomonasaeruginosain 2010[J]. Curr. Opin. Microbiol, 2007, 10(5):436-440.

[3] Levine DP. Vancomycin: a history[J]. Clin. Infect. Dis, 2006, 42(Suppl.1)：5-12.

[4] Hu J, Ma XX, Tian Y, et al. Reduced vancomycin susceptibility found in methicillin resistant and methicillin sensitiveStaphylococcusaureusclinical isolates in Northeast China[J]. Plos One, 2013, 8(9):e73300.

[5] Walters MS, Eggers P, Albrecht V, et al. Vancomycin-resistantStaphylococcusaureus-Delaware, Morb. Mortal[J]. Wkly. Rep.，2015, 64： 1056.

[6] Howden BP, Davies JK, Johnson PD, et al. Reduced vancomycin susceptibility inStaphylococcusaureus, including vancomycinintermediate and heterogeneous vancomycin intermediate strains: resistance mechanisms, laboratory detection, and clinical implications[J]. Clin Microbiol Rev., 2010, 23(1):99-139.

[7] Tenover FC, Moellering RC Jr. The rationale for revising the Clinical and Laboratory Standards Institute vancomycin minimal inhibitory concentration interpretive criteria forStaphylococcusaureus[J]. Clin Infect Dis, 2007, 44(9):1208-1215.

[8] Hiramatsu K, Aritaka N, Hanaki H, et al. Dissemination in Japanese hospitals of strains ofStaphylococcusaureusheterogeneously resistant to vancomycin[J]. Lancet, 1997, 350: 1670-1673.

[9] Hiramatsu K, Hanaki H, Ito T, et al. Methicillin resistantStaphylococcusaureusclinical strain with reduced vancomycinsusceptibility[J]. J Antimicrob Chemother, 1997, 40(1):135-136.

[10]Van Hal SJ, Lodise TP, Paterson DL, et al. The clinical significance of vancomycin minimum inhibitory concentration inStaphylococcusaureusinfections: a systematic review and meta-analysis[J]. Clin Infect Dis, 2012, 54(6):755-771.

[11]Liu C, Chambers HF.Staphylococcusaureuswith heterogeneous resistance to vancomycin: epidemiology, clinical significance, andcritical assessment of diagnostic methods[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(10): 3040-3045.

[12]Song JH, Hiramatsu K, Suh JY, et al. Emergence in Asian countries ofStaphylococcusaureuswith reduced susceptibility to Vancomycin[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(12):4926-4928.

[14]Hawser SP, Bouchillon SK, Hoban DJ, et al. Rising incidence ofStaphylococcusaureuswith reduced susceptibility to vancomycinand susceptibility to antibiotics: a global analysis 2004-2009[J]. Int J Antimicrob Agents, 2011, 37(3):219-224.

[15]Garnier F, Chainier D, Walsh T, et al. A 1 year surveillance study of glycopeptide intermediateStaphylococcusaureusstrains in a French hospital[J]. J Antimicrob Chemother, 2006, 57(1):146-149.

[16]Rybak MJ, Leonard SN, Rossi KL, et al. Characterization of vancomycin heteroresistantStaphylococcusaureusfrom the metropolitan area of Detroit, Michigan, over a 22 year period (1986 to 2007)[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(9):2950-2954.

[17]Robert J, Bismuth R, Jarlier V. Decreased susceptibility to glycopeptides in methicillin resistantStaphylococcusarueus: a 20 year study in a large French teaching hospital, 1983-2002[J]. J Antimicrob Chemother, 2006, 57(3): 506-510.

[18]Cercenado E.Glycopeptide intermediateStaphylococcusaureus: rediscovery of an old problem?[J].Clin Microbiol Infect,2000,6(10):517-518.

[19]Bierbaum G, Fuchs K, Lenz W, et al. Presence ofStaphylococcusaureuswith reduced susceptibility to vancomycin in Germany[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1999, 18(10):691-696.

[20]Sun W, Chen H, Liu Y, et al. Prevalence and characterization of heterogeneous vancomycin intermediateStaphylococcusaureusisolates from 14 citeis in China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(9):3642-3649.

[21]Ho CM, Hsueh PR, Liu CY, et al. Prevalence and accessory gene regulator (agr) analysis of vancomycin intermediateStaphylococcusaureusamong methicillin-resistant isolates in Taiwan-SMART program, 2003[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2010, 29(4):383-389.

[22]Da Costa TM, Morqado PG, Cavalcante FS, et al. Clinical and Microbiological Characteristics of Heteroresistant and Vancomycin-IntermediateStaphylococcusaureusfrom Bloodstream Infections in a Brazilian Teaching Hospital[J]. Plos One, 2016, 11(8):e0160506.

[23]Dmitriev BA, Toukach FV, Holst O, et al. Tertiary structure ofStaphylococcusaureuscell wall murein[J]. J Bacteriol, 2004, 186(21):7141-7148.

[24]Cui L, Ma X, Sato K, et al. Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance inStaphylococcusaureus[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(1): 5-14.

[25]Cui L, Murakami H, Kuwahara-Arai K, et al. Contribution of a thickened cell wall and its glutamine nonamidated component to the vancomycin resistance expressed byStaphylococcusaureusMu50[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(9): 2276-2285.

[26]Hanaki H, Kuwahara-Arai K, Boyle-Vavra S, et al. Activated cell-wall synthesis is associated with vancomycin resistance in methicilin-resistantStaphylococcusaureusclinical strains Mu30 and Mu50[J]. J Antimicrob Chemother, 1998, 42(2): 315-320.

[27]Bishop EJ, Howden BP. Treatment ofStaphylococcusaureusinfections: new issues, emerging therapies and future directions[J]. Expert Opin Emerg Drugs, 2007, 12(1): 1-22.

[28]Julian K, Kosowska-Shick K, Whitener C, et al. Characterization of a daptomycin-nonsusceptible vancomycin intermediateStaphylococcusaureusstrain in a patient with endocarditis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(9): 3445-3448.

[29]Boyle-Vavra, Yin S, Challapalli SM, et al. Transcriptional induction of the penicillin-blinding protein 2 gene inStaphylococcusaureusby cell wall-active antibiotics oxacillin and vancomycin[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(3):1028-1036.

[30]Koehl JL, Muthaivan A, Javaswal RK, et al. Cell wall composition and decreased autolytic activity and lysostaphin susceptibility of glycopeptide intermediateStaphylococcusaureus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(10):3749-3757.

[31]Sieradzki K, Tomasz A. Inhibition of the autolytic system by vancomycin causes mimicry of vancomycin intermediateStaphylococcusaureustype resistance: cell concentration dependence of the MIC, and antibiotic tolerance in vancomycin susceptibleS.aureus[J]. Antimicrob. Agents Chempther, 2006, 50(2): 527-533.

[32]Sakoulas G, Eliopoulos GM, Moellering RC Jr, et al.Staphylococcusaureusaccessory gene regulator (agr) group Ⅱ: is there arelationship to the development of intermediate-level glycopeptide resistance?[J].J Infect Dis, 2003, 187(6): 929-938.

[33]Utaida S, Pfeltz RF, Jayaswal RK, et al. Autolytic properties of glycopeptide-IntermediateStaphylococcusaureusMu50[J].Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(4): 1541-1545.

[34]Howden BP, Smith DJ, Mansell A, et al. Different bacterial gene expression patterns and attenuated host immune responses are associated with the evolution of low-level vancomycin resistance during persistent methicillin-resistantStaphylococcusaureusbacteraemia[J]. BMC Microbiol,2008, 8:39.

[35]Peleg AY, Monga D, Pillai S, et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity inStaphylococcusaureusinfection[J]. J Infect Dis, 2009, 199(4):532-536.

[36]Majcherczyk PA, Barblan JL, Moreillon P,et al. Development of glycopeptide-intermediate resistance byStaphylococcusaureusleads to attenuated infectivity in a rat model of endocarditis[J]. Microb Pathog, 2008, 45(5-6):408-414.

[37]Cameron DR, Ward DV, Kostoulias X, et al. Serine/threonine phosphatase Stp1 contributes to reduced susceptibility to vancomycin and virulence inStaphylococcusaureus[J]. J. Infect. Dis, 2012, 205(11):1677-1687.

[38]Soriano A, Marco F,Martinez JA, et al. Influence of vancomycin minimum inhibitory concentration on the treatment of methicillinresistantStaphylococcusaureusbacteremia[J]. Clin. Infect. Dis, 2008, 46(2):193-200.

[39]Hattangady DS, Singh AK, Muthaiyan A, et al. Genomic, transcriptomic and metabolomic studies of two well-characterized, laboratory-derived vancomycin intermediateStaphylococcusaureusstrains derived from the same parent strain[J].Antibiotics(Basel), 2015, 4(1):76-112.

[40]Cameron DR, Lin YH, Trouillet-Assant S, et al. Vancomycin-intermediateStaphylococcusaureusisolates are attenuated for virulence when compared with susceptible progenitors[J].Clin Microbiol Infect, 2017, 23(10):767-773.

[41]Nelson JL, Rice KC, Slater SR, et al. Vancomycin intermediateStaphylococcusaureusstrains have impaired acetate catabolism: implications for polysaccharide intercellular adhesin synthesis and autolysis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(2): 616-622.

[42]Alexander EL, Gardete S, Bar HY, et al. Intermediate type vancomycin resistance (VISA) in genetically distinctStaphylococcusaureusisolates is linked to specific, reversible metabolic alterations[J]. Plos One, 2014, 9(5):e97137.

[43]Matsuo M, Cui L, Kim J, et al. Comprehensive identification of mutations responsible for heterogeneous Vancomycin intermediateStaphylococcusaureus(hVISA)-to-VISA conversion in laboratory-generated VISA strains derived from hVISA clinical strain Mu3[J]. Antimicrob. Agents Chemother, 2013, 57(12): 5843-5853.

[44]Katayama Y, Sekine M, Hishinuma T, et al. Complete reconstitution of the vancomycin-intermediateStaphylococcusaureusphenotype of strain Mu50 in vancomycin-susceptibleS.aureus[J]. Antimicrob. Agents Chemother, 2016, 60(6):3730-3742.

[45]Pieper R, Gatlin-Bunai CL, Mongodin EF, et al. Comparative proteomic analysis ofStaphylococcusaureusstrains with differences in resistance to the cell wall-targeting antibiotic vancomycin[J]. Proteomics, 2006, 6(15):4246-4258.

[46]Kuroda M, Kuwahara-Arai K, Hiramatsu K. Identification of the up- and down-regulated genes in vancomycin-resistantStaphylococcusaureusstrains Mu3 and Mu50 by cDNA differential hybridization method[J]. Biochem. Biophys. Res. Commun, 2000, 269(2): 485-490.

[47]Kuroda M, Kuroda H, Oshima T, et al. Two-component system VraSR positively modulates the regulation of cell-wall biosynthesis pathway inStaphylococcusaureus[J]. Mol. Microbiol, 2003, 49(3): 807-821.

[48] Cui L, Lian J Q, Neoh H M, et al. DNA microarray-based identification of genes associated with glycopeptide resistance inStaphylococcusaureus[J]. Antimicrob. Agents Chemother, 2005, 49(8):3404-3413.

[49]Ernst C M, Peschel A. Broad-spectrum antimicrobial peptide resistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping ofphospholipids[J]. Mol. Microbiol, 2011, 80(2):290-299.

[50]Delauné A, Dubrac S, Blanchet C, et al. The WalKR system controls major staphylococcal virulence genes and is involved in triggering the host inflammatory response[J]. Infect Immun, 2012, 80(10):3438-3453.

[51]McEvoy C R, Tsuji B, Gao W, et al. Decreased vancomycin susceptibility inStaphylococcusaureuscaused by IS256 tempering of WalKR expression[J]. Antimicrob. Agents Chemother, 2013, 57(7):3240-3249.

[52]Matsuo M, Hishinuma T, Katayama Y, et al. Mutation of RNA polymerase beta subunit (rpoB) promotes hVISA-toVISA phenotypic conversion of strain Mu3[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(9):4188-4195.

[53]Howden BP, Johnson PD, Ward PB, et al. Isolates with low-level vancomycin resistance associated with persistent methicillin-resistantStaphylococcusaureusbacteremia[J].Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(9):3039-3047.

[54]Leonard SN, Rossi KL, Newton KL, et al. Evaluation of the Etest GRD for the detection ofStaphylococcusaureuswith reduced susceptibility to glycopeptides[J]. J Antimicrob Chemother, 2009, 63(3):489-492.

[55]Voss A, Mouton JW, van Elzakker EP, et al. A multi-center blinded study on the efficiency of phenotypic screening methods to detect glycopeptide intermediately susceptibleStaphylococcusaureus(GISA) and heterogeneous GISA (h-GISA)[J]. Ann CLin Microbiol Antimicrob, 2007,6(1): 1-5.

[56]Fitzqibbon MM, Rossnev AS, O′ Connell B. Investigation of reduced susceptibility to glycopeptides among methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolates from patients in Ireland and evaluation of agar screening methods for detection of heterogeneously glycopeptide-intermediateS.aureus[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(10):3263-3269.

[57]胡健，馬笑雪，田園，等.異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012, 32(7):661-662.

[58]Wooton M, Howe RA, Hillman R, et al. A modified population analysis profile (PAP) method to detect hetero-resistance to vancomycin inStaphylococcusaureusin a UK hospital[J]. J Antimicrob Chemother, 2001, 47(4):399-403.

[59]Kang YR, Chung DR, Kim J, et al.Invitrosynergistic effects of various combinations of vancomycin and non-beta-lactams againstStaphylococcusaureuswith reduced susceptibility to vancomycin[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2016, 86(3):293-299.

[60]Howden BP, Ward PB, Charles PG, et al. Treatment outcomes for serious infections caused by methicillin resistantStaphylococcusaureuswith reduced vancomycin susceptibility[J]. Clin Infect Dis, 2004, 38(4):521-528.

[61]劉明濤，常剛，李凱述，等.異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌分離率與檢測(cè)方法評(píng)價(jià)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017,27(14)：3147-3149.

[62]Holmes NE, Tong SY, Davis JS, et al. Treatment of Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus: Vancomycin and Beyond[J]. Semin Respir Crit Care Med, 2015, 36(1):17-30.

[63]Tenover FC，Sinner SW, Seqal RE, et al. Characterisation ofStaphylococcusaureuswith progressive loss of susceptibility to vancomycin and daptomycin during therapy[J]. Int J Antimicrob Agents， 2009, 33(6):564-568.

[64]EnterocSamra Z, Ofir O, Shmuely H.Invitrosusceptibility of methicilli resistantStaphylococcusaureusand vancomycin resistantoccus faecium to daptomycin and other antibiotics[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2007, 26(5):363-365.

[65]Vidaillac C, Steed ME, Rybak MJ. Impact of dose de-escalation and escalation on daptomycin′s pharmacodynamics against clinical Methicillin resistantStaphylococcusaureusisolates in aninvitromodel[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(5): 2160-2165.

[66]Will A, McGuinness, Natalia Malachowa, et al. Vancomycin Resistance inStaphylococcusaureus[J]. Yale Journal Of Biology And Medicine, 2017, 90(2):269-281.

[67]Streit JM, Sader HS, Fritsche TR, et al. Dalbavancin activity against selected populations of antimicrobial resistant Grampositive pathogens[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2005, 53:307-310.

[68]劉春池，趙冬梅.奧利萬(wàn)星[J]. 中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2015, 25(1)：81.

[69]Chambers HF. Evaluation of ceftobiprole in a rabbit model of aortic valve endocarditis due to methicillin-resistant and vancomycin-intermediateStaphylococcusaureus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(3):884-888.