孫 文, 劉倩倩, 胡彥婷, 王雅娜， 程輝彩， 張根偉， 張麗萍*

(1.河北工業(yè)大學 化工學院，天津 300130；2.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081；3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術研究中心，河北 石家莊 050081)

灰葡萄孢(Botrytiscinerea)能夠侵染番茄、黃瓜、西葫蘆等多種植物，會造成不同程度的損失，嚴重時可減產(chǎn)50%以上，由其引起的灰霉病是農(nóng)作物最主要的病害之一。短短芽胞桿菌(Brevibacillusbrevis)是一種革蘭陽性菌，在生長過程中能夠產(chǎn)生短桿菌肽、脂類、堿性蛋白酶、幾丁質酶等活性代謝產(chǎn)物[1-4]，在植物保護、食品、醫(yī)藥、保健等領域有很好的應用前景。本研究室從土壤中分離篩選出1株拮抗菌株短短芽胞桿菌ch2-22，研究室前期試驗結果表明該菌株發(fā)酵能夠產(chǎn)生唯一的抗菌物質—3 kD的短桿菌肽，可以有效抑制灰霉病原菌、炭疽病原菌、葉枯病原菌等多種病原真菌，具有廣譜的抗真菌活性，且應用試驗結果也表明ch2-22發(fā)酵液對黃瓜灰霉病、棉花枯萎病具有很好的防治效果，對植物生長有明顯的促進作用[5-6]。短短芽胞桿菌ch2-22菌株及其代謝產(chǎn)物有望開發(fā)為生防制劑，用于多種真菌引起的植物病害，可以促進化學農(nóng)藥的減施，解決化學農(nóng)藥帶來的一系列食品安全與環(huán)境方面的問題，從而促進環(huán)境生態(tài)平衡和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。提高菌株的發(fā)酵芽胞數(shù)量與發(fā)酵液抑菌活性是制備高質量生防制劑的前提。本研究以灰霉病菌為指示菌，旨在菌株抑菌活性有所提高的情況下，著重優(yōu)化了提高發(fā)酵芽胞數(shù)量的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，為開發(fā)高質量的ch2-22生防菌劑和該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 短短芽胞桿菌ch2-22菌株，由河北省科學院微生物研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NB培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母膏1 g，調節(jié)pH至7.0，定容1 L；115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，用于菌株的種子液培養(yǎng)；PB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂12 g，調節(jié)pH至7.0，定容1 L，用于平板活菌計數(shù)；馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA): 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，水1 L，用于抑菌活性檢測。

1.1.3 主要試劑及儀器 培養(yǎng)基所需試劑均購自天津市永大化學試劑有限公司與天津博迪化工股份有限公司；SPX-100B-Z型恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，Innova 43R Shaker搖床(英國New Brunswick)。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將4 ℃保存的ch2-22菌株斜面取一環(huán)轉接到NB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h，得到種子液。

1.2.2 芽胞濃度的測定 將發(fā)酵液于80 ℃水浴20 min，稀釋后平板計數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗 ①碳源的篩選：分別以1%可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、木糖、乳糖、檸檬酸三鈉、乙酸鈉和玉米粉代替NB培養(yǎng)基中的碳源。以5%的接種量將種子液分別接種到液體培養(yǎng)基中(80 mL/500 mL)，32 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 h取樣，測其抑菌活性，培養(yǎng)36 h后取樣，測定其芽胞數(shù)量，每個處理重復3次。②氮源的篩選：分別以1%大豆餅粉、魚粉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、尿素、蛋白胨、牛肉膏和胰蛋白胨代替NB培養(yǎng)基中的氮源。以5%的接種量將種子液分別接種到液體培養(yǎng)基中(80 mL/500 mL)，32 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 h取樣，測其抑菌活性，培養(yǎng)36 h后取樣，測定其芽胞數(shù)量，每個處理重復3次。

1.2.4 響應面試驗設計 用Design expert 8軟件進行響應面設計，并且對實驗數(shù)據(jù)進行回歸性分析，用t反映回歸系數(shù)的顯著性，F(xiàn)反映模型方程的顯著性，R2反映方程的擬合效果[7-10]。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 根據(jù)培養(yǎng)基優(yōu)化結果，選取pH、溫度、接種量、裝液量、轉速為液體發(fā)酵影響因素[11-14]，進行單因素試驗，逐個進行優(yōu)化，在進行優(yōu)化后一個因素時，采用前一個優(yōu)化好的因素，選出最佳發(fā)酵條件。

1.2.6 抑菌物質效價的測定 以兩性霉素B為標準品，利用瓊脂擴散法測抑菌圈直徑，得到效價對數(shù)與抑菌圈直徑線性關系的標準曲線。將發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min，過濾，稀釋適當倍數(shù)使抑菌圈直徑在標準曲線范圍內，根據(jù)標準曲線得到發(fā)酵液的效價。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗結果

2.1.1 碳源的篩選 由圖1可知，碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖時，發(fā)酵芽胞數(shù)量與抑菌活性較木糖、乳糖、玉米粉、乙酸鈉、檸檬酸三鈉為碳源時的高，且由于葡萄糖高溫滅菌時會產(chǎn)生糖醛，對菌體生長有一定副作用，所以選取可溶性淀粉為最佳碳源，蔗糖為輔助碳源。

2.1.2 氮源的篩選 由圖2可知，菌株ch2-22對無機氮源的利用率較低，產(chǎn)生的菌體量少且發(fā)酵液抑菌活性較低，而在豆餅粉、魚粉、牛肉膏等有機氮源中菌體產(chǎn)生量較多，并且抑菌活性都比其他氮源高，考慮到魚粉廉價且研究中發(fā)現(xiàn)其對芽胞形成有促進作用，所以選取豆餅粉為最佳氮源，魚粉為輔助氮源。

圖1 碳源單因素試驗結果Fig.1 The results of single factor experiments of carbon source

圖2 氮源單因素試驗結果Fig.2 The results of single factor experiments of nitrogen source

2.1.3 無機鹽的篩選 以優(yōu)化的碳氮源培養(yǎng)基為基礎，分別添加10種無機鹽，其含量及試驗結果見表1，單因素試驗結果顯示K2HPO4、(NH4)2SO4、CaCO3、NaCl、MgSO4、MnSO4對提高芽胞數(shù)量和提高發(fā)酵液抑菌活性有影響，其他無機鹽則無明顯作用或有負作用。

2.1.4 爬坡實驗 由表1可知6種目標無機鹽對發(fā)酵液抑菌活性影響不大，選取對短短芽胞桿菌ch2-22芽胞濃度影響最大的3種無機鹽即K2HPO4、(NH4)2SO4、CaCO3進行梯度爬坡實驗，結果見表2，K2HPO4為0.3%、(NH4)2SO4為0.3%、CaCO3為0.2%時芽胞濃度最高。

表1 無機鹽單因素試驗設計及結果

表2 無機鹽梯度爬坡試驗

2.2 響應面法確定發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度

2.2.1 Plackett-Burman試驗確定初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的重要影響因子 以發(fā)酵芽胞數(shù)量為判斷標準，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個因素淀粉 X1、豆餅粉 X2、蔗糖 X3、魚粉 X4、(NH4)2SO4X5、K2HPO4X6、CaCO3X7進行考察，設計實驗，實驗結果見表3、4。由表3和表4可以看出，各因素按重要性依次為淀粉、豆餅粉、蔗糖、魚粉、K2HPO4、CaCO3、(NH4)2SO4。其中淀粉、豆餅粉和蔗糖對菌株生長繁殖影響最大，是影響菌株發(fā)酵生長的主要影響因子，均為正效應。

表3 Plackett-Burman實驗設計與結果

表4 Plackett-Burman實驗分析

2.2.2 最陡爬坡實驗確定培養(yǎng)基重要影響因子的最適濃度范圍 重要影響因子淀粉、豆餅粉、蔗糖濃度變化的實驗設計及結果見表5，可以看出隨著重要影響因子濃度的增加，發(fā)酵液活菌濃度的變化趨勢為先上升后下降，淀粉3.5%、豆餅粉2.6%、蔗糖1.0%時對應的發(fā)酵芽胞數(shù)最高，為三因子的最大響應值區(qū)域。

表5 爬坡實驗梯度設計與結果

2.2.3 Box-Behnken試驗確定培養(yǎng)基重要影響因子的最佳濃度 試驗確定培養(yǎng)基重要影響因子的最佳濃度，三個重要因子的最適濃度范圍確定后，以淀粉3.5%、豆餅粉2.6%、蔗糖1.0%為中心點施行響應面分析，各因素水平見表6，實驗設計及結果見表7。由Design expert 8擬合出的回歸方程模型為：Y=76.67+5X1+3.12X2+0.62X3-5.25X1X2-0.75X1X3+1.5X2X3-26.83X12-12.58X22-10.58X32，方程回歸分析見表8。

表6 Box-Behnken設計因子及水平列表

表7 Box-Behnken實驗設計及結果

續(xù)表7

由方差分析得出P=0.000 1，表明回歸方程顯著性很好，且R2=91.34%，說明響應模型可以解釋91.34%菌體發(fā)酵水平的變化，能夠很好地反映ch2-22的發(fā)酵過程。響應面回歸分析和回歸方程繪制的響應面圖形如圖3、4、5所示。觀察上述圖形的變化趨勢，可以看出X1、X2、X3在試驗范圍內存在極大值。這三個組分的最優(yōu)試驗點為(0.1、0.1、0)，即淀粉35.05 g/L、豆餅粉26.08 g/L、蔗糖10 g/L，在此點預測的發(fā)酵芽胞濃度為7.1×109cfu/mL。由圖3、4、5可以看出X1X2、X1X3等高線呈橢圓形，交互作用顯著，X2X3等高線近似圓形，交互作用不顯著。

表8 回歸模型的方差分析

圖3 淀粉與豆餅粉交互作用對芽胞濃度預測的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of spore concentration versus starch and soybean powder

圖4 淀粉與蔗糖交互作用對芽胞濃度預測的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of spore concentration versus starch and sucrose

圖5 豆餅粉與蔗糖交互作用對芽胞濃度預測的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of spore concentration versus soybean powderand sucrose

2.2.4 模型驗證 為了驗證模型預測的準確性，在優(yōu)化條件下進行3組裝液量為80 mL/500 mL發(fā)酵實驗，測得的平均芽胞濃度為7.2×109cfu/mL，與模型預測值非常相近，說明設計的模型，能夠很好地預測短短芽胞桿菌ch2-22的發(fā)酵情況而且此時與灰霉的對峙試驗測得抑菌圈直徑為15 mm，抗菌物質效價為3 350 IU/mL，比之前的1 600 IU/mL提高了109%。圖6為未稀釋的發(fā)酵液與灰霉的對峙實驗結果。

2.3 發(fā)酵條件的單因子試驗

2.3.1 初始pH和溫度對菌株生長和發(fā)酵液活性的影響 由圖7可知，pH為7.0時，芽胞濃度與抑菌活性都達到最高，所以最適pH為7.0。在28～32 ℃范圍內隨著溫度上升，芽胞數(shù)量逐漸升高，32 ℃時發(fā)酵液也顯示出較強的抑菌活性，溫度高于32 ℃時，發(fā)酵液芽胞數(shù)量與抑菌活性均下降，可能是因為溫度過高，菌體不宜生長導致自溶，所以ch2-22的最適培養(yǎng)溫度為32 ℃。

圖6 發(fā)酵液與灰霉對峙試驗結果Fig.6 The results of Broth confrontation with gray mold test a：優(yōu)化前發(fā)酵液(接種)；b：優(yōu)化后發(fā)酵液(接種)；c：優(yōu)化前發(fā)酵液(未接種)；d：優(yōu)化后發(fā)酵液(未接種)a： the broth of pre-optimization (inoculated)； b： the broth of optimized (inoculated)； c： the broth of pre-optimization (uninoculated)；d： the broth of optimized (uninoculated)

圖7 pH和溫度對發(fā)酵芽胞濃度與抑菌活性的影響Fig.7 Effects of temperature and pH on the spore concentration and anti-fungal activity

2.3.2 接種量對菌體生長和抑菌活性的影響 由圖8可知，接種量在1%～4%范圍內，芽胞數(shù)量與抑菌活性逐漸上升，當接種量大于4%時，隨著接種量的增大，芽胞數(shù)量開始減少，可能是因為培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的過度消耗引起的，所以最佳接種量為4%。

2.3.3 裝液量和轉速對菌體生長和抑菌活性的影響 由圖9可知，當500 mL三角瓶裝液量為100 mL時，芽胞數(shù)量與抑菌活性都達到最高。當裝液量高于或低于100 mL時，芽胞數(shù)量下降，且抑菌活性也降低，說明ch2-22菌株對通氣量有一定要求，裝液量過多過少都不利于菌體發(fā)酵，所以100 mL為最佳裝液量；轉速在120～180 r/min時，芽胞數(shù)量與抑菌活性都逐漸增加，在180 r/min時達到最大值，當轉速超過180 r/min時,芽

胞數(shù)量與發(fā)酵液抑菌活性逐漸降低，可能是因為轉速太高導致菌體細胞損傷而影響其生長，所以最佳轉速為180 r/min。

圖8 接種量對發(fā)酵芽胞濃度與抑菌活性的影響Fig.8 Effect of inoculum on the spore concentration and anti-fungal activity

圖9 裝液量和轉速對發(fā)酵芽胞濃度與抑菌活性的影響Fig.9 Effect of liquid volume and shaking speed on the spore concentration and anti-fungal activity

2.3.4 最佳培養(yǎng)條件驗證 使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，測得芽胞數(shù)量為8.1×109cfu/mL，抑菌效價為3 350 IU/mL。

3 討 論

本研究以發(fā)酵芽胞濃度和抑菌活性為衡量指標，從培養(yǎng)基碳源、氮源和無機鹽種類與含量及溫度、轉速、pH、裝液量和接種量等發(fā)酵條件進行了優(yōu)化[15-18]。采用廉價且易獲得的原料進行液體發(fā)酵并且優(yōu)化結果顯著。

Plackett-Burman試驗設計優(yōu)點在于試驗次數(shù)少、精度高，能夠在眾多因素中挑選出影響試驗的主要因素[19]。本研究優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉35.05 g/L，豆餅粉26.08 g/L，蔗糖10 g/L，魚粉5 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO40.3 g/L，(NH4)2SO43 g/L，MnSO40.1 g/L，K2HPO43 g/L，酵母膏1 g/L，CaCO32 g/L。優(yōu)化結果顯示可溶性淀粉、豆餅粉和蔗糖對提高菌株發(fā)酵芽胞濃度影響最大，且魚粉作為輔助氮源時能夠有效提高菌體芽胞率，從而提高菌株抗性，對生防制劑的制備有很大幫助[20]。

優(yōu)化后培養(yǎng)條件為溫度32 ℃，轉速180 r/min，裝液量100 mL/500 mL，接種量4%，初始pH為7.0，發(fā)酵時間45 h。菌體最佳裝液量100 mL，比解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等芽胞桿菌要多，說明菌株ch2-22對溶氧要求比其他芽胞桿菌低，而且研究中發(fā)現(xiàn)菌株ch2-22在發(fā)酵過程中pH往堿性方向變化，與其他芽胞桿菌[21-]有所差異，原因可能是該菌株的代謝途徑與其他菌株不同，有待研究。

優(yōu)化后菌株發(fā)酵結束時pH穩(wěn)定在7.5～8.0，芽胞濃度達到8.1×109cfu/mL，比優(yōu)化前提高3.7倍，高于其他芽胞桿菌一般發(fā)酵水平的6.0×109cfu/mL；發(fā)酵液效價達到3 350 IU/mL，比優(yōu)化前提高109%，優(yōu)化水平高于同類菌株的2 000 IU/mL，且該菌株作為生防制劑的主要原料，對解決土壤酸化問題，提高土地資源利用率及化學農(nóng)藥的減施和復合菌肥的開發(fā)與應用具有重要意義。

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